专利名称：一种具有肿瘤细胞杀伤作用的cik细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从人外周血或脐带血中分离单个核细胞(PBMC)，并且通过17-20天的时间以最为简单的方法获得具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞。
背景技术：
肿瘤一直以来几乎是死亡的代名词。虽然医学以及生物学界围绕着肿瘤的发生、机理以及治疗等方面进行了大量的工作，但是目前为止最为主要的治疗方式还是放化疗。但是对于患者而言放化疗无异于饮鸩止渴，患者不仅需要付出高额的治疗费用并且还要忍受副作用所带来的巨大痛苦，而更为可悲的是这一痛苦的过程只不过是延缓死亡而已。因此，相关专家学者越来越清楚地认识到攻克肿瘤应该寻找另一条路线。细胞治疗并不是近几年才受到关注的，从早期的NK细胞、树突状细胞直到现在的细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-1nduced Killer,CIK)以及多种细胞的联合应用细胞治疗已经发展成为一个非常有希望的手段并越来越受到重视。其中，CIK细胞由于其增殖能力强、细胞毒作用强、兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，并且对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞的特点:1、增殖能力强，主要效用细胞⑶3+⑶56+可增殖1000倍；2、杀伤活力强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子Y干扰素、白细胞介素2等；3、杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用，对多重耐药肿瘤细胞仍敏感，杀瘤活性不受环孢素A(CsA)和FK506等免疫抑制剂的影响，能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小,无严重不良反应。CIK细胞治疗技术的优势:1、可有清除手术、放化疗后残余的癌细胞及微小病灶，预防肿瘤的复发和转移；2、可与放、化疗联合使用，能降低放化疗的毒副作用的感染率，提高放化疗的疗效；3、可用于放、化疗无效的患者，或对化疗药物产生耐药性的患者的治疗；4、对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者，能迅速缓解其临床症状，延长生存期；大部分患者出现瘤体减小甚至消失或长期带瘤生存的治疗效果；5、由于CIK细 胞具有免疫调节和体细胞修复作用，在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽，黑斑淡化，静脉曲张消失，脱发停止甚至头发生长或白发变黑等“年轻化”表现，及精神状态或体力明显恢复等现象，从而提闻肿瘤患者的生存质量，延长生存期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一套简单、高效、可重复性好的具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，利用密度为1.084的Ficoll单核细胞分离液于PBS系统中分离外周血或脐带血单个核细胞，并且通过17-20天的诱导培养获得CIK细胞。Ficoll、外周血或脐带血、PBS混合体积比为1:1:1。单个核细胞分离离心参数为:离心力250g，离心时间40分钟。所述具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，包括以下步骤:(1)临床获取外周血或脐带血，利用密度为1.084的Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞；(2) DO天利用初始诱导培养基培养；D1天加入抗⑶3抗体，IL_2 ;以后每三天补加基础培养基、自体血清和IL-2 ;第19天获得足量CIK细胞；(3)对获得CIK细胞进行表面标志物检测和杀伤活力检测。按体积比浓度计，所述初始诱导培养基为淋巴细胞基础培养基98 %、自体血清浓度为1%、双抗1%、IFN-Y浓度为2000u/ml ;CIK维持培养基为淋巴细胞基础培养基98%、自体血清浓度为I %、双抗1%、IL-2浓度为1000u/ml。所述双抗为青霉素和链霉素。本发明的有益效果是:本发明利用ficoll密度梯度离心法高效分离获得单个核细胞、并利用细胞培养袋和CIK细胞培养系统获得足量的CIK，可以满足临床治疗的需求。本方法单个核细胞分离效果优于其他方法；操作简便易行；采用Takara淋巴细胞培养基，和自体血清、细胞因子联合培养技术，避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏原污染几率，同时保持了 CIK细胞高效扩增的优点；利用细胞培养袋技术、减少细胞污染几率，适合临床治疗应用。
图1 CIK细胞总量扩增曲线；图2诱导CIK细胞流式检测结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。本发明的技术方案如下:1.使用Ficoll单核细胞分离液从45ml新鲜外周血中分离得到6*107左右的PBMC:1)在医院诊所等具有资质的医疗机构采集新鲜的外周血50ml，利用枸橼酸钠或者肝素等为抗凝剂，采用静脉穿刺的方式将外周血采集到采血袋当中，2)冷链运输，在4°C环境下保存外周血，并运输到实验室，进行单个核细胞分离，外周血可以保存24小时，不影响单个核细胞采集。
3)新鲜血液样品和磷酸缓冲液(PBS)全部温浴至20°C后按照1:1的比例混合均匀。4)取3支新的50ml离心管，每个离心管中加入温浴至20°C的Ficoll单核细胞分离液15ml (密度为1.084)。5)使用一次性移液管将30ml混合均匀的血液稀释液轻轻加到Ficoll单核细胞分离液的上层并确保两层液体分层明显。6)轻轻将配平的离心管放入离心机中，250g离心40min。7)轻轻取出离心管，以新移液管首先吸出上层血清至一个新的离心管中备用然后吸取单个核细胞白膜层以及白膜层上下各5ml的液体至另一个新的离心管中。8)在单个核细胞的离心管中加入30ml PBS,混合均匀后250g离心5min。9)移液管吸弃上清再次加入30ml PBS,混合均勻后250g离心5min。10)重复7)的操作11)移液管吸弃上清，加入5ml CIK细胞培养基础培养基充分混匀细胞计数并计
算活率。12)保留5*107个细胞用于CIK细胞诱导。13)将自体血清分成3支0.5ml、I支1.5ml、I支5ml、2支20ml冻存在20°C条件下备用
2.CIK细胞的诱导:(以下百分比浓度均为体积比浓度)I)将分离获得的PBMC按照l*106/ml、共50ml接种到T-175细胞培养瓶中，并且添加1%自体血清、I %的双抗以及终浓度2000u/ml的IFN-Y在CO2培养箱中诱导培养。2) 24h后在培养基中添加终浓度1000u/ml的IL-2和100ng/ml抗CD3的单抗继续诱导培养，并将本日定为诱导Dl。3) D4时对细胞进行细胞计数以及活率，按照50ml培养基补加I %自体血清、I %的双抗以及终浓度1000u/ml的IL-2持续诱导培养。4)D7时对细胞进行细胞计数以及活率，补加50ml新鲜培养基并且按照IOOml培养基补加1%自体血清、1%的双抗(青霉素和链霉素，Gibco, W10479)以及终浓度1000u/ml的IL-2混合均匀后平均分到2个T-175中继续诱导培养。5)D10时对细胞进行细胞计数以及活率，将全部细胞转入细胞培养袋中，补力口350ml新鲜培养基并且按照450ml培养基补加I %自体血清、I %的双抗以及终浓度IOOOu/ml的IL-2混合均匀继续诱导培养。6)D13时对细胞进行细胞计数以及活率，补加1350ml新鲜培养基并且按照1800ml培养基补加I %自体血清、I %的双抗以及终浓度1000u/ml的IL-2混合均匀继续诱导培养。7)D16时对细胞进行细胞计数以及活率，按照1800ml培养基补加1%自体血清、I %的双抗以及终浓度1000u/ml的IL-2混合均匀继续诱导培养。8)D19时250g离心回收所有细胞进行细胞计数以及活率9)通过流式细胞仪检测⑶3+⑶56+细胞比例10)以Hela细胞作为靶细胞进行细胞杀伤实验以确定诱导的CIK细胞的杀伤效果实施例1:
PBMC 的分离:I) 50ml新鲜血液样品(外周血或脐带血)和磷酸缓冲液(PBS)全部温浴至20°C后按照1:1的比例混合均匀。2)取3支新的50ml离心管，每个离心管中加入15ml温浴至2(TC的Ficoll单核细胞分离液(密度为1.084)。3)使用一次性移液管将30ml混合均匀的血液稀释液轻轻加到Ficoll单核细胞分离液的上层并确保两层液体分层明显。4)轻轻将配平的离心管放入离心机中，250g离心40min。5)轻轻取出离心管，以新移液管首先吸出上层血清至一个新的离心管中备用然后吸取单个核细胞白膜层以及白膜层上下各5ml的液体至另一个新的离心管中。6)在单个核细胞的离心管中加入30ml PBS,混合均匀后250g离心5min。7)移液管吸弃上清再次加入30ml PBS,混合均勻后250g离心5min。8)重复7)的操作9)移液管吸弃上清，加入5ml CIK细胞培养基础培养基充分混匀细胞计数并计算活率。10)最终获得16.2*107个细胞活率99%以上，保留5*107个细胞用于诱导。将自体血清按照3支0.5ml、I支1.5ml、I支5ml、2支20ml冻存在20°C条件下备用。
CIK细胞诱导:I)将5*107个细胞悬浮于49mlCIK诱导基础培养基(TAKARA公司GT-T551培养基)中并加入到一个T-175细胞培养瓶中，加入0.5ml自体血清、0.5ml双抗、0.1ml IFN-y母液(1000000u/ml)混合均匀后放入CO2培养箱中诱导培养。2) 24h 后在培养基中添加 0.25ml IL-2 母液(200000u/ml)和 0.005ml 抗 CD3 的单抗母液(lmg/lml)继续诱导培养，并将本日定为诱导Dl。3) D4时对细胞进行细胞计数结果为4.84*10'活率99%以上，补加0.5ml自体血清(使用低温保存的血清)、0.5ml双抗、0.25ml IL-2母液继续诱导培养。4)D7时对细胞进行细胞计数结果为6.85*107、活率99%以上，补加50ml新鲜培养基以及Iml自体血清(使用低温保存的血清)、lml双抗、0.5ml IL-2母液混合均匀后平均分到2个T-175细胞培养瓶中继续诱导培养。5)DlO时对细胞进行细胞计数结果为18.5*107、活率99%以上，将所有细胞加入到细胞培养袋(TAKARA公司GT-T610 (A)细胞培养袋)中，再加入400ml新鲜培养基并补加5ml自体血清(使用低温保存的血清)、5ml双抗、2.5ml IL-2母液混合均匀后继续诱导培养。6)D13时对细胞进行细胞计数结果为118.5*107、活率99%以上，补加1350ml新鲜培养基并补加18ml自体血清(使用低温保存的血清)、18ml双抗、9ml IL-2母液混合均匀
后继续诱导培养。7)D16时对细胞进行细胞结果为422.5*10'活率99%以上，并补加18ml自体血清(使用低温保存的血清)、18ml双抗、9ml IL-2母液混合均匀后继续诱导培养。8)D19时250g离心回收所有细胞进行细胞计数结果共获得552.5*107个细胞、活率99%以上。
9)通过流式细胞仪检测⑶3+⑶56+细胞比例，结果显示⑶3+⑶56+细胞比例为28.4% (图 2)10)以Hela细胞作为靶细胞按照CIK细胞:靶细胞比例20: I进行细胞杀伤实验，杀伤5h后杀伤效率达到72%。结果显示本方法诱导出的CIK细胞具有很好的杀伤效率。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之 内。
权利要求
1.一种具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，其特征在于，利用密度为1.084的Ficoll单核细胞分离液于PBS系统中分离外周血或脐带血单个核细胞，并且通过17-20天的诱导培养获得CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，其特征在于，Ficoll、外周血或脐带血、PBS混合体积比为1:1:1。
3.根据权利要求1所述的CIK细胞的制备方法，其特征在于，单个核细胞分离离心参数为:离心力250g，离心时间40分钟。
4.根据权利要求1所述具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)临床获取外周血或脐带血，利用密度为1.084的Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞； (2)DO天利用初始诱导培养基培养；D1天加入抗CD3抗体，IL-2 ；以后每三天补加基础培养基、自体血清和IL-2 ;第19天获得足量CIK细胞； (3)对获得CIK细胞进行表面标志物检测和杀伤活力检测。
5.根据权利要求4所述的具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，其特征在于，按体积比浓度计，所述初 始诱导培养基为淋巴细胞基础培养基98 %、自体血清浓度为I %、双抗1%、IFN-Y浓度为2000u/ml ;CIK维持培养基为淋巴细胞基础培养基98%、自体血清浓度为I %、双抗1%、IL-2浓度为1000u/ml。
6.根据权利要求5所述的具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述双抗为青霉素和链霉素。
全文摘要
本发明公开了一种具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，利用密度为1.084的Ficoll单核细胞分离液于PBS系统中分离外周血或脐带血单个核细胞，并且通过17-20天的诱导培养获得CIK细胞。本发明利用ficoll密度梯度离心法高效分离获得单个核细胞、并利用细胞培养袋和CIK细胞培养系统获得足量的CIK，可以满足临床治疗的需求。本方法采用Takara淋巴细胞培养基，和自体血清、细胞因子联合培养技术，避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏原污染几率，同时保持了CIK细胞高效扩增的优点；利用细胞培养袋技术、减少细胞污染几率，适合临床治疗应用。
文档编号C12N5/078GK103184192SQ20111044664
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者陈晓波, 韩洪起, 韩俊领, 黄家学, 武文杰, 侯士芳, 张宇光 申请人:协和干细胞基因工程有限公司