专利名称：一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法
技术领域：
本发明属于葡萄酒冻干发酵剂、乳酸菌制品生产技术领域，具体涉及一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法。
背景技术：
近年来，我国葡萄酒产量保持着强劲的增长势头，但葡萄酒行业所使用的苹果酸-乳酸发酵剂全部依赖国外进口，费用每年高达约六千万元人民币，并且随着葡萄酒产量的逐年增加，此项费用仍会进一步扩大。为了能够有效的控制苹果酸-乳酸发酵(MLF)， 直投式乳酸菌发酵剂的生产和使用已引起了葡萄酒微生物工作者的广泛关注。直投式发酵剂是指发酵活力强，活菌数高，在接种葡萄酒时可以直接使用，无须中间继代培养的一种安全高效的生物制品。制备直投式发酵剂的主要方法是冷冻干燥，然而冷冻干燥会对乳酸菌造成损伤，致使菌体冻干存活率降低，对生产十分不利。另外，酒精发酵结束后的葡萄酒生境恶劣复杂，在人工直接接种的情况下，往往会造成菌体的大量死亡，而无法成功的启动MLF。根据相关文献报道，究其原因有两方面，一是实验室培养获得的菌体失去了对葡萄酒环境的天然抗性，造成接种存活率下降；二是菌体在冷冻干燥过程中受到损伤，导致冻干后存活细菌数减少。因此，制备高效的直投式葡萄酒乳酸菌发酵剂，除保证菌体的高密度培养外，更需注重培养条件对菌体接种存活率和冻干存活率影响的研究。那么怎样才能提高酒酒球菌发酵剂的存活率呢？有文献研究标明，酒酒球菌存在着胁迫交叉保护能力，即在给定胁迫的条件下进行培养，所得的菌体能增强对其他胁迫的抗性，这是由酒酒球菌本身的生理特性决定的。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种通过胁迫预处理从而提高酒酒球菌冻干存活及其发酵活性的方法。该方法不仅提高了酒酒球菌冻干存活率，增强了苹果酸乳酸发酵性能，而且明显改善了葡萄酒的口感和风味。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案—种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，其特征在于，该方法将酒酒球菌菌株经过富集培养至稳定前期，离心收集得菌泥，重悬于加入胁迫处理液的ATB培养基中，25°C条件下静置池 3h，离心，收集菌体，在菌体中再加入适量的质量浓度为2% 5 %的谷氨酸钠溶液作为冻干保护剂进行冷冻干燥，得冻干菌粉。上述酒类酒球菌菌株为Oenococcus oeni SD_2a，保藏号CGMCC NO. 0715。上述离心收集条件为离心力为4000 X g 6000 X g,时间5min 15min，4°C离心。所述的胁迫处理液为含有质量浓度为8% 10%乙醇的ATB培养基，或用盐酸调节ATB培养基的pH值至3. 2-3. 5，胁迫处理时间为浊 汕。本发明的利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，所带来的技术效果是1、通过合适的胁迫预处理提高了酒酒球菌冻干存活率，谷氨酸钠用作冻干保护剂，其作为味精的主要成分对人畜安全无害并具有多种保健作用，采用该方法生产的冻干粉可作为直投式发酵剂，应用于葡萄酒的苹果酸乳酸发酵。2、明显提高葡萄酒酿造过程中苹果酸乳酸发酵性能，可在20天内完成降酸过程， 并显著增加葡萄酒的口感和风味。3、操作简单、快捷，工艺合理，具有较强的工业化实施性。
具体实施例方式在以下的描述中，所述的ATB培养基为本领域已知的培养基，例如，中国专利(专利号=ZL 02123444. 2)中所述的ATB培养基。所用酒类酒球菌菌株为Oenococcus oeni SD_2a(已于2002年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO. 0715)。按照本发明的技术方案，一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，包括如下步骤1、菌泥收集与胁迫处理液制备将冷冻保藏的酒酒球菌菌株转接至ATB培养基中，在25 °C条件下活化7天，然后在同样的培养基中，再转接2次，每次分别培养80h。将第三次培养好的菌悬液，离心得菌泥。 在制备的新鲜ATB培养基中加入一定量的乙醇或盐酸，即为胁迫处理液。所用酒类酒球菌菌株为Oenococcus oeni SD_2a(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO. 0715)，收集处于稳定前期的菌体，离心力为 4000 X g 6000 X g，时间5-15min，4°C离心。胁迫处理液为新鲜配制的ATB培养基，加入乙醇，使乙醇的终浓度为8-10% ；或者用盐酸调节pH为3. 2-3. 5。2、保护剂选择申请人:选用多种食品级保护剂进行菌体冻干存活率的研究，经实验表明，最佳保护剂为2. 5%谷氨酸钠。
保护剂冻干存活率(％)10%葡萄糖39. 8±2. 610%果糖36±2. 210%麦芽糖50. 1±1. 610%乳糖58. 9±1. 810%蔗糖50. 8±1. 210%海藻糖60. 9±3. 210%葡萄聚糖47. 2±2. 62. 5%谷氨酸钠69. 5±2. 75.0%山梨糖醇22. 7±1. 85.0%甘露醇18. 7±1. 9ATB培养基45. 5±2. 33、胁迫处理在菌泥中加入胁迫处理液，25°C进行胁迫处理。胁迫处理时间为2_池。4、冷冻干燥选用质量浓度为2. 5%谷氨酸钠作为保护剂，与菌体混勻后室温静置20min 30min，放入真空冷冻干燥仪中冻干，复水后测定冻干存活率。在实验过程发现，为当胁迫处理液为ATB培养基中的乙醇终浓度为8-10%或者ATB培养基的pH3. 2 3. 5，胁迫处理 2h 汕时，可以得到良好的冻干存活率。
权利要求
1.一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，其特征在于，该方法将酒酒球菌菌株经过富集培养至稳定前期，离心收集得菌泥，重悬于加入胁迫处理液的ATB培养基中，25°C条件下静置池 3h，离心，收集菌体，在菌体中再加入适量的质量浓度为2% 5% 的谷氨酸钠溶液作为冻干保护剂进行冷冻干燥，得冻干菌粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酒酒球菌菌株为Oenococcusoeni SD-2a，保藏号CGMCC NO. 0715。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心收集条件为离心力为4000X g 6000X g，时间 5min 15min，4°C离心。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胁迫处理液为含有质量浓度为8% 10%乙醇的ATB培养基，或用盐酸调节ATB培养基的pH值至3. 2-3. 5，胁迫处理时间为池 3h。
5.权利要求1所述方法，制得的冻干菌粉用于葡萄酒的苹果酸乳酸发酵的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的冻干菌粉能够在20天内完成葡萄酒的苹果酸乳酸发酵。
全文摘要
本发明涉及一种利用胁迫预处理提高酒酒球菌冻干活性的方法，该方法将酒酒球菌菌株经过富集培养至稳定前期，离心收集得菌泥，重悬于加入胁迫处理液的ATB培养基中，25℃条件下静置2h～3h，离心，收集菌体，在菌体中再加入适量的质量浓度为2％～5％的谷氨酸钠溶液作为冻干保护剂进行冷冻干燥，得冻干菌粉。该方法得到的冻干菌粉可作为直投式酒酒球菌发酵剂。本发明引入了胁迫预处理的思路，而且用谷氨酸钠作冻干保护剂，其作为味精的主要成分对人畜安全无害并具有多种保健作用，这一思路可以用于直接食用发酵剂的制作过程。
文档编号C12R1/01GK102559500SQ20111044873
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者张国强, 樊明涛 申请人:西北农林科技大学