专利名称：散发性乳腺癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种散发性乳腺癌易感基因无创检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估女性散发性乳腺癌遗传易感性的风险级别，并作为女性预防乳腺癌的建议指导。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，这种疾病通常发生在乳房腺上皮组织，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见恶性肿瘤之一。绝大多数(90% 95%)乳腺癌属于散发性乳腺癌，属体细胞遗传病，即在体细胞水平具有遗传性。其肿瘤的发生是一个多步骤的过程，由遗传异常积累导致基因组不稳定及肿瘤细胞的正常生长调节失控引起。目前认为乳腺癌的发生与雌激素的水平增高、癌基因激活和抑癌基因失活有关，同时一些代谢酶的异常也可能参与乳腺癌的发生和进展。乳腺癌作为激素依赖性肿瘤之一，雌激素在其发生、发展中发挥重要作用，雌激素主要通过表达于细胞核内的雌激素受体(estrogenre^ptor-a ,ER-α)发挥作用。雌激素受体是一种配体依赖的转录因子，属于核受体超家族成员，介导雌激素的多向效应，在各种发育和生理过程中有着广泛的作用。ER-α基因^CbaI多态位点的基因型有GG、GA、AA，其中 GA和AA被确定为风险基因型，与乳腺癌的发病有关。ER-α基因PvuII多态位点的基因型有CC、CT、TT，其中TT和CT被确定为风险基因型，与乳腺癌的发病有关。儿茶酚氧位甲基转移酶基因COMT基因第4号外显子上的一个G/A多态位点突变， 导致其第158位密码子编码的氨基酸由Val变为Met。该位点的基因型有GG、GA、AA，其中 A等位基因与乳腺癌的发生有关，AA基因型(即Met/Met基因型)被确定为乳腺癌风险基因型。COMT基因的Val、Met等位基因分别与酶的高、低活性有关，且呈共显性遗传，即Val/ Val基因型的酶具有高活性，Val/Met基因型的酶具有中度活性，而Met/Met基因型的酶活性最低。Val/Val和Met/Met基因型之间，酶活性相差3-4倍。当携带风险基因型(Met/ Met，即AA)时，COMT酶活性下降，影响了儿茶酚雌激素的灭活，S卩儿茶酚雌激素增多，SP儿茶酚雌激素增多，乳腺癌发生风险上升。谷胱甘肽S-转移酶 Pl (glutathione S-transferase PI, GSTP1)蛋白是 GSiTs 超基因家族η家族酶成员之一，是一种具有解毒功能的酶，它参与了对致癌物质的降解、排泄过程。GSTPl基因结构、功能和表达的差异，可以导致个体抵御外界致癌物的能力不同，使个体在乳腺癌中的易感性不同。因此，通过检测GSTPl基因的多态性，分析其与乳腺癌发生的关系，可以为进一步探索GSTPl基因结构的异常改变在乳腺癌发生中的作用提供理论依据。因此，建立简单、快速的散发性乳腺癌易感基因无创检测方法，能够检测出女性在与散发性乳腺癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患乳腺癌的女性高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，这对于降低女性乳腺癌发病率有非常重要的眉、ο
发明内容
基于雌激素受体ER-α (PvuI I), ER-a (XbaI)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因 COMT (Val 158Met)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因GSTPl (Ilel05Val)的4个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估女性散发性乳腺癌发生风险级别的基础上，本发明提供一种女性散发性乳腺癌易感基因无创检测试剂盒，并向受检者提供个性化健康指导方案。该试剂盒包括检测雌激素受体ER-α (PvuI I), ER-a (XbaI)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因 COMT (Val 158Met)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因GSTPl (Ilel05Val)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)ER-α (PvuII)/ER-α (XbaI)正向引物5' TCTCCCACCTCAGCCTTACA3‘ER-α (PvuII)/ER-α (XbaI)正向引物5 ‘ TCCATAGCCATACTTCCCTTG3‘
Q)C0MT(Vall58Met)正向引物5' TCGTGGACGCCGTGATTC3‘C0MT(Vall58Met)反向引物5' CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3‘C3)GSTPl(Ilel05Val)正向引物5' ATCCTTCCACGCACATCC3‘GSTPl(Ilel05Val)反向引物5' CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1 分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)ER-α (PvuII)/ER-α (XbaI)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA3‘(2)C0MT(Vall58Met)测序引物5' TCGTGGACGCCGTGATTC3‘(3)GSTPl(Ilel05Val)测序引物5' ATCCTTCCACGCACATCC3‘反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.提供受检者女性散发性乳腺癌遗传易感性检测服务1.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的雌激素受体ER- α (PvuII)、 ER-α OCbal)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因C0MT(Vall58Met)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因 GSTPl (Ilel05Val)的4个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这4个SNPs位点的基因型。3.女性散发性乳腺癌遗传易感性高危人群风险评估
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具女性散发性乳腺癌遗传易感性风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者雌激素受体ER-α (PvuII) ,ER-α Oibal)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因COMT (Vall58Met)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因GSTPl (Ilel05Val)上SNP 位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读女性散发性乳腺癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测散发性乳腺癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测与女性散发性乳腺癌发生密切相关的雌激素受体ER-α (PvuII) ,ER-α Oibal)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因COMT (Val 158Met)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因GSTPl (Ilel05Val) 4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对雌激素受体ER-α (PvuI I), ER-a (XbaI)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因COMT (Val 158Met)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因GSTPl (Ilel05Val)的4个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这4个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对雌激素受体ER-α (PvuI I), ER-a (XbaI)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因COMT (Vall58Met)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因GSTPl (Ilel05Val)的4个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述4个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下(1)ER-α(PvuII)/ER-α (XbaI)正向引物5' TCTCCCACCTCAGCCTTACA3‘ER-α (PvuII)/ER-α (XbaI)反向引物5 ‘ TCCATAGCCATACTTCCCTTG3‘(2)COMT(ValI58Met)正向引物5‘TCGTGGACGCCGTGATTC3‘COMT(Vall58Met)反向引物5‘ CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3‘(3)GSTPl(Ilel05Val)正向引物5'ATCCTTCCACGCACATCC3‘GSTPl (Ilel05Val)反向引物5' CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3‘
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列是针对如下(1)ER-α(PvuII)/ER-α (XbaI)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA3‘(2)COMT(Vall58Met)测序引物5'TCGTGGACGCCGTGATTC3‘(3)GSTPl(Ilel05Val)测序引物5'ATCCTTCCACGCACATCC3‘
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)PCR反应体系10XPCR反应缓冲液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种散发性乳腺癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测与散发性乳腺癌发生密切相关的雌激素受体ER-α(PvuII)、ER-α(XbaI)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因COMT(Val158Met)、谷胱甘肽硫转移酶P1基因GSTP1(Ile105Val)4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与散发性乳腺癌发生密切相关的4个单核苷酸多态性位点基因型来评估女性易患散发性乳腺癌的风险级别，指导女性提早针对性的预防乳腺癌的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102424854SQ201110448498
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司