专利名称：含有病毒去活化的生长因子且pdgf与vdgf耗尽的血小板裂解物及其制备方法
技术领域：
本发明关于血小板衍生物的领域，特别是关于得自人类或动物源血小板的生长因子浓厚液的领域。本发明还关于ー种制备这类含有生长因子的血小板裂解物的方法，及其在试管内(in vitro)、活体外(ex vivo)的细胞培养(例如干细胞扩增及分化)的用途、美容或临床的应用，如与骨移植体的组合应用。
背景技术：
蛋白体学分析的证据显示，人类血小板包含大量具有重要生理功能的分子，其中又以生长因子(GF)最受瞩目。这些生长因子堆积在血小板的α-颗粒内，主要 包括三种血小板衍生的生长因子的异构体(H)GF-AA、-AB及-ΒΒ)、血管内皮生长因子(VEGF)、转形生长因子-β (TGF-β I及TGF12)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、以及ー些类胰岛素生长因子(IGF)。现已根据这些生长因子的治疗标的，将复杂的人类血小板生长因子混合物以单ー捐输者(single-donor)血小板凝胶生物材料的形式用于治疗方面的应用，上述血小板凝胶生物材料是通过凝血酶对含血小板的血浆进行活化后得到。血小板活化通常会使包含在血小板内的生长因子释出，在此同时，凝血酶会使纤维蛋白原转变成纤维蛋白而形成凝胶基质(gel matrix)，这类凝胶基质会将生长因子抓在里面。这项生物材料一般会单独施用或与移植材料(graft materials)共同施用在组织上，故可将含有生长因子的血小板凝胶(platelet gels)用于再生医学(regenerativemedicine)，以促进软组织及硬组织的愈合及再生。亦可将从血小板得到的生长因子浓厚液补充在试管内(in vitro)或活体外(ex vivo)的细胞培养的生长培养基中。近来已证明，可能使用富含人类生长因子的血小板释出物来取代胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),而使间质干细胞(mesenchymal stem cells)或造血干细胞(hematopoietic stem cells)在活体外(ex vivo)中扩增。目前将富含生长因子的血小板释出物应用于干细胞扩增一事倍受瞩目，特别是在公认的新“广效”细胞(即间质干细胞mesenchymal stem cells, MCS),或造血干细胞(hematopoietic stem cells))扩增中用来作为胎牛血清(FBS)或胎犊血清(fetal calfserum, FCS)的替代品,这些血清普遍被视为普利子蛋白(prion)及病毒的可能传染源，也被视为在病患身上造成免疫问题的原因，这是胎牛血清或胎犊血清中残余的牛蛋白和抗原所造成的。最近已发展出新的策略，包括在公知表现系统中生产重组血小板生长因子，如将某重组人类个体(Rh)生长因子用于治疗用途。某些国家已核准将基因工程酵母菌所表现的Rh-PDGF-BB用于治疗慢性神经病变型下肢糖尿病性溃疡(chronicneuropathiclower-extremity diabetic ulcers),不过，要达到临床成效需要施用高剂量的这种单一生长因子数周之久。同样地，TGF-β超级家族中的Rh-骨型态发生蛋白(Rh-bonemorphogenetic proteins,BMP)BMP-2及BMP-7可从中国仓鼠卵巢细胞制得，并已核准用于治疗某些骨折手术。然而，可用的重组生长因子数目仍然非常有限，部分是因为这些生长因子在分离、鉴定、选殖及表现方面的难度所致。进ー步言之，血小板衍生的制备物的优点仍比使用单一重组因子要多，这是因为在某些应用中，生长因子的组合可达到优势协同作用(synergistic effect)。目前数据显示生长因子TOGF及VEGF是直接与异常细胞增殖及/或分化有关(例如可參见 Ferrara et al. , Nature Medicine, vol. 9, no. 6, 2003, pp. 669-676 ;以及EuropeanMedical Agency 在 2010 年 2 月 18 日刊行的 EMA/92326/2010，和 FDA 于 2008 年3 月 27 日的通Tfi“an ongoing safety review of regranex(becaplermin)，'ノ。由十在以TOGF及VEGF个别进行的治疗中，发展中癌症的感受性(susceptibility)増加了，因此要避免将这两种生长因子用于培养干细胞或治疗病患，特别是当该病患已有罹癌风险的时候。因此，目前确有发展处理人类血小板材料的方法的需要，这些方法是用以制备已定性且具病毒安全性的エ业生长因子制备物，特别是其中I3DGF及VEGF耗尽的制备物。专利申请W02009/087560已揭露可使人类血小板浓厚液接受溶剂及清洁剂组合 (S/D)的处理来达到双重目的(a)脂质包膜病毒的去活化，以及(b)从血小板α-颗粒大量释出生长因子。之后可通过结合S/D处理、油萃取及疏水性交互作用层析(HIC)步骤而得到ー标准化复杂血小板生长因子混合物，其包含H)GF-AB、-BB及-AA、TGF-β、EGF、VEGF,以及类胰岛素生长因子-β I (IGF-β I)，其中油萃取及HIC是用以移除S/D试剂而不会显著影响PGF及蛋白的含量。所得血小板生长因子制备物显示可在试管内刺激多种细胞株，并促使由抽脂取得的脂肪组织当中的干细胞扩增。此外，W02009/087560亦揭露了以SP-sepharose阳离子交换管柱来取代HIC,以制备经纯化的FiDGF-VEGF流析物(fraction)。在这项方案中，PDGF及VEGF确实可被吸附在管柱上，但TGF-β、EGF、IGF则与在病毒去活化步骤中使用的S/D试剂一同在前缘部分(breakthrough)出现。反言之，W02009/087560揭露的是可通过DEAE-s印harose阴离子交换取代HIC的方式将TGF- β及EGF纯化到一定的程度。在El-Ekiaby et al.所发表的文献(El-Ekiaby et al ； , ^Solvent-detergentiiltered(b/D_F)iresh frozen plasma and cryoprecipitate minipools prepared in anewly designed integraldisposable processing bag system，，,Transfusion medicine,2010,20,48-61)当中，作者揭露了ー种方法，其可用于单ー来源(singulet)或迷你集池(mini-pools)的输血用血浆及冷冻沉淀品的病毒去活化处理，包含下列主要步骤以TnBP及Triton X_45的混合物对新鲜冷冻血浆(FFP)、冷冻沉淀品贫乏的血浆(Cryo-PoorPlasma, CPP)或冷冻沉淀品进行S/D处理；对经S/D处理的血浆材料进行油萃取；以及透过含有经活化的活性碳的S/D吸收过滤器来过滤经油萃取的血浆材料。如该文献的讨论所述，其所揭露的方法特别是能够保存血浆蛋白(例如凝血因子)的功能活性，不会改变VWF多聚体组成物(VWF mu I timer composition),且会将TnBP及Triton X-45减少到可接受浓度以下，并可通过重力使所得的经纯化血浆进行无菌过滤。然而这份文献是针对血浆材料的纯化，故未揭露或建议ー种可用于从血小板浓厚液纯化出生长因子的方法。在密集研究后，发明人惊奇地发现，本发明包含对血小板浓厚液进行S/D处理、再进行油萃取及活性碳萃取或单以活性碳萃取的方法能够简便、快速、有效地制备出ー种含有病毒去活化的生长因子且PDGF及VEGF耗尽的血小板裂解物，其中溶剂及清洁剂的浓度是符合主管机关有关经S/D处理的非经ロ血液衍生治疗产品的核可标准。更特定言之，本发明的方法不会改变主要蛋白(如白蛋白及免疫球蛋白)的含量，且基本不影响I3DGF及VEGF以外的生长因子的浓度，如TGF-β I、EGF及IGF。进ー步来说，本发明的方法可溶解脂质膜，所以会将脂质包膜病毒及其它病原体(例如，细菌和寄生虫如原虫)等去活化，并可移除在起始血小板浓厚液中存在的血浆及血小板脂质。是以，本发明的方法使之可能提供ー种病毒去活化的血小板衍生的生长因子混合物，其可被有效地标准化而用于治疗性处理、细胞疗法或细胞培养。最后，临床上在静脉内使用血小板来矫治数量性或功能性血小板数量低下症(thrombocytopenia)时，由于血小板的保存期限是5或7天(部分是因为细菌污染风险与止血功能活性丧失的问题)，所以毎年通常都会废弃大量保存时间大于5或7天的血小板单位。本发明的方法允许使用过期血小板储存液来制备血小板衍生的浓厚液，掲示了ー种极具有经济目标的愿景。
发明内容
本发明的目的之ー是ー种制备含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的方法，其包含下列步骤使起始血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂接触；使所述起始血小板浓厚液与所述溶剂及/或清洁剂共同培养一段至少5分钟至6小时的时间，其PH值维持在从约6. O至约9. O的范围内，且其温度是在从2°C至50°C的范围内，优选为在从25°C至40°C的范围内；通过油萃取来移除所述溶剂及/或清洁剂，以得到一水性蛋白相；以及将所述水性蛋白相与活性碳共同培养，或通过将经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液单与活性碳共同培养来移除溶剂及/或清洁剂。在一优选实施方式中，在本发明的方法中所使用的溶剂是选自由具有不同烷基链的ニ -或三烷基磷酸酯类所组成的群组，优选为三正丁基磷酸酯(TnBP)。在一优选实施方式中，在本发明的方法中所使用的清洁剂是选自由脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯类(partial esters)、非离子性清洁剂、脱氧胆酸钠及磺基甜菜碱类(sulfobetaines)所组成的群组,更优选为选自由Triton X-45、Triton X-100、Tween 80及Tween 20所组成的群组。在一优选实施方式中，所述溶剂及/或所述清洁剂在将所述血小板浓厚液与溶剂/清洁剂共同培养的步骤中的个别浓度范围为从0. 2至5体积％，优选为从0. 2至2体积％，其是以所述起始血小板浓厚液的体积为基础计算。在本发明的方法的一优选实施方式中，所述起始血小板浓厚液是单与2% TnBP接触，或与I % TnBP及I % Triton X-45接触，其是以所述血小板浓厚液的体积为基础计算。进ー步言之，在本发明ー优选实施方式中，油萃取是以医药等级油来进行，且所述油的用量为从2至20重量％、或从5至15重量％、或从5至10重量％ ,其是以所述血小板浓厚液与所述溶剂及/或清洁剂的混合物的重量为基础计算。在一优选实施方式中，当在与经活化的活性碳共同培养之前进行油萃取时，经活化的活性碳的用量为在油萃取后回收的水性蛋白相的从50至250g/l，优选为从55至200g/l、或从 60 至 150g/l、或从 65 至 100g/l。在另ー实施方式中，当在与经活化的活性碳共同培养之前不进行油萃取时，经活化的活性碳的用量为经溶剂及/或清洁剂处理一次的血小板浓厚液的从250至1250g/l，优选为从 275 至 1000g/l、或从 300 至 750g/l、或从 325 至 500g/l。在一优选实施方式中，本发明的方法在油萃取后、及/或在与活性碳共同培养后包含另ー离心步骤。本发明的方法可进ー步包含另ー选自由层析、纳米过滤(用以移除致病剂)及/或超滤所组成的群组的步骤来处理所得血小板裂解物。在一优选实施方式中，本发明的方法包含一制备起始血小板浓厚液的初步步骤，所述起始血小板浓厚液是通过血小板分离术(apheresis)或通过血沉棕黄层(buffy-coat)分离法而从全血加已制备，且为新鲜、过期的储存液体、或过期且冷冻的状态。本发明的另ー目的是ー种含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小 板裂解物，或是ー种通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物。在一优选实施方式中，这种血小板裂解物包含生长因子TGF-β、IGF及EGF。在另ー实施方式中，这种血小板裂解物进ー步包含bFGF。在一优选实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物包含-PDGF-AB,其浓度为低于10ng/ml的所述裂解物，更优选为低于5ng/ml的所述裂解物，更优选为低于3ng/ml的前述裂解物；及/或-VEGF,其浓度为低于O. lng/ml的前所述裂解物，更优选为低于O. O lng/ml的所述裂解物 '及/或-TGF- β，其浓度为高于50ng/ml的所述裂解物，更优选为高于100ng/ml的所述裂解物，更优选为高于150ng/ml的前所述裂解物，更优选为高于200ng/ml的所述裂解物，更优选为高于250ng/ml的所述裂解物；及/或-EGF,其浓度为高于O. 5ng/ml的所述裂解物，更优选为高于lng/ml的所述裂解物，更优选为高于I. 5ng/ml的所述裂解物，更优选为高于2ng/ml的所述裂解物，更优选为高于2. 5ng/ml的所述裂解物；及/或-IGF，其浓度为高于20ng/ml的所述裂解物，更优选为高于50ng/ml的所述裂解物，更优选为高于100ng/ml的所述裂解物。本发明的又一目的是通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子且PDGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的用途，或是本发明的含有病毒去活化且I3DGF及VEGF耗尽的生长因子的血小板裂解物的用途；其是用于促进骨骼再生或重建，或用于治疗骨折骨。本发明的再一目的是通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的用途，或是本发明的含有病毒去活化的生长因子且PDGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的用途；其是用于试管内(in vitro)或活体外(ex vivo)的细胞培养；优选为用于促进干细胞増殖及/或分化。在一优选实施方式中，本发明的含有生长因子的血小板裂解物是用于促进干细胞分化为成骨细胞系及/或软骨细胞。
图I :富含TGF- β I且TOGF-AB及VEGF耗尽的生长因子混合物的制备方法。图2 S/D-PC-0(a)及每20mL的S/D_PC_0(即在油萃取后回收的水性蛋白相)以
I.5g (b)、3g (c)、3· 5g (d)及 4g (e)经活化的活性碳处理后的 PDGF-AB (A) ,VEGF (B)、EGF (C)、IGF-I (D)及 TGF- β I (E)含量。图3 :在未还原(A)及还原(B)条件下对血小板流析物所进行的SDS-PAGE分析，包括起始PC(第I行)、经溶剂-清洁剂处理及一次油萃取后(S/D-PC-0 ;第2行)、经活性碳吸收后(S/D-PC-0C ;第3行)。Novex鲜明预染蛋白标记(M)。a :纤维蛋白原；b IgG ；c 白蛋白；d :纤维蛋白原次单兀；e IgG重链；f IgG轻链。图4:在添加 10% (v/v) FBS (a)与未添加 FBS (b)、以及添加了 I % (c),3% (d),5%(e)及10% (f)的S/D-PC-0C的MEM培养基中培养的MG63 (A)及SIRC⑶细胞株的MTS细 胞增殖数据。培养5天后测定细胞存活率。
具体实施例方式本发明的目的之ー是ー种制备含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的方法，其包含下列步骤使起始血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂接触；使所述起始血小板浓厚液与所述溶剂及/或清洁剂共同培养一段至少5分钟至6小时的时间，其pH值维持在从约6. O至约9. O的范围内，且其温度是在从2°C至50°C的范围内；通过油萃取来移除所述溶剂及/或清洁剂，以得到一水性蛋白相；以及将所述水性蛋白相与活性碳共同培养，或通过将经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液单与活性碳共同培养来移除溶剂及/或清洁剂。本发明使用了“病毒去活化的”的用语，其是指实质上不带有感染性病毒的含有生长因子的血小板裂解物，特别是脂质包膜病毒，例如人类免疫不全病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、西尼罗病毒(WNV)、TT病毒、登革热病毒、巨细胞病毒(CMV)、Epstein Barr病毒(EBV)、人类疱疹病毒_8 (HHV-8)、猴泡沫病毒、严重急性呼吸道症候群病毒(SARS冠状病毒)、HlNI及其它流感病毒；以及其它脂质包膜病毒，例如反转录病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒、乳酸脱氢酶病毒、疱疫群病毒(Herpes group virus)、棒状病毒(rhabdovirus)、白血病病毒(Ieukovirus)、黏液病毒、α病毒、虫媒病毒(arbovirus)、苜Ij黏液病毒、沙状病毒(arenavirus)及冠状病毒。“实质上不带有”是指血小板生长因子制备物的病毒去活化程度至少大于41ogl0，这是强力病毒减毒步骤所定出的标准，由欧洲医药产物评量机构(European Agencyfor the Evaluation of Medicinal Products, EMEA)的专利医药产物委员会(Committee forproprietary medicinal products, CPMP)在病毒批核研究基准(Note for guidance on virusvalidation studies)定出(參考文献 CPMP/BWP/268/95)，且更优选为大于51ogl0或更进ー步大于61ogl0，因此，它不大可能会在输血给患者时造成脂质包膜病毒的血源性感染。本发明使用了 “TOGF及VEGF耗尽” ー词，其是指该含有生长因子的血小板裂解物实质上不含 F1DGF(platelet derived growth factor)及 VEGF(vascular endothelialgrowthfactor)。 在ー特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中的PDGF-AB浓度是低于10ng/ml的裂解物，优选为低于5ng/ml的裂解物，更优选为低于3ng/ml的裂解物。在一特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中的VEGF浓度是低于O. lng/ml的裂解物，优选为低于O. O lng/ml的裂解物。本发明亦使用了 “经活化的活性碳”、“经活化的碳”或“活性碳”几个词，其均是指ー经处理而非常多孔的形式的碳。因此，经活化的活性碳其有非常大的表面积，能提供非常重要的吸收能力。经活化的活性碳一般是制自碳源材料，如坚果壳、泥炭(peat)、木头、椰棕(coir)、褐煤(lignite)、煤(coal)及石油浙青(petroleumpitch)。其可用多种方法得到，包含物理性再活化(使用气体来使前趋物转变为经活化的活性碳)及化学性活化(在碳化作用前将特定化学物质注入原始材料，例如酸、强碱或盐)。经活化的活性碳可以整块使用，或包在市售滤筒中使用。在一优选实施方式中，在本发明中使用的经活化的活性碳是由蒸气及/或化学处理得到的经活化的活性碳粉末。活性碳的孔隙度可为微孔(孔径范围< 10nm)、中孔(孔径 范围10-25nm)或大孔(孔径范围> 25nm)、或其组合。来源与处理方式的不同可能会影响最后所得的孔隙度。在一优选实施方式中，经活化的活性碳的等级及/或孔隙度要能够留置溶剂、清洁剂、TOGF及VEGF。适用于本发明的方法的经活化的活性碳可能来自多个供货商，如已预先包装的活性碳滤筒、3M/CUN0(CUN0的经活化的活性碳)及Pall (经活化的活性碳AKS)。当使用3M/CUN0的经活化的活性碳时，优选为使用(孔隙度)等级5的经活化的活性碳。进ー步言之，孔隙度为5的3M/CUN0等级5经活化的活性碳在移除溶剂、清洁剂、PDGF及VEGF的效果方面要比孔隙度为2、3及4的来得好。同样地，当使用Pall的经活化的活性碳时，AKS等级6会比AKS 7和4来得好，因为它提供了较好的溶剂、清洁剂、PDGF及VEGF移除效果。在一优选实施方式中，在本发明的方法中使用的经活化的活性碳可吸收在从100g/m2至550g/m2范围内的甲基蓝，在ー实施方式中，可吸收在300g/m2至500g/m2,或在另ー实施方式中，可吸收100g/m2至300g/m2(甲基蓝近来是用作測量经活化的活性碳的吸收能力的标准物质)。亦可依照待处理的流体的黏度来选择活性碳；优选为针对低黏度流体(如黏度低于20cp)设计的活性碳。ー种可使用的特殊活性碳为CUNO R55，其中第一个5是指过滤精度(filtrationrating,与黏度有关)，第二个5则是指碳的等级。“清除溶剂及/或清洁剂”的说法是指含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中的溶剂及/或清洁剂的量极低，且优选为无法侦测。确实，所属领域一般技术人员已知溶剂及/或清洁剂浓度升高与长期毒性是有直接联系的，且特别是与神经性病症的发生有直接联系(如揭不于J. P. R. Pelletier, S. Transue, E. L. Snyder. Pathogen inactivationtechniques. Best Practice&Research Clinical Haematology Vol. 19,No. l,pp. 205-242,
2006) o因此，溶剂量“极低”的说法是指在本发明中的溶剂量小于lOOppm，优选为小于50ppm,优选为小于20ppm,更优选为小于lOppm、小于5ppm,且再更优选为小于lppm。进ー步来说，清洁剂量“极低”的说法是指在本发明中的清洁剂量小于500ppm，优选为小于250ppm,优选为小于IOOppm,更优选为小于50ppm,且再更优选为小于lOppm。
本发明或通过本发明的方法所得的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物至少包含下列功能性生长因子转形生长因子(TGF-β )超级家族，其特别包含TGF-β I及/或TGF-β 2 ;胰岛素样生长因子(IGF);表皮生长因子(EGF)。在一优选实施方式中，本发明的含有生长因子的血小板裂解物进ー步包含碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)。在一特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中的TGF-β I浓度至少与起始血小板浓厚液中的类似，优选为高于50ng/ml裂解物，优选为高于100ng/ml裂解物，优选为高于150ng/ml裂解物，优选为高于200ng/ml裂解物，优选为高于250ng/ml裂解物。在一特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中的IGF浓度至少与起始血小板浓厚液中的类似，且优选为高于20ng/ml裂解物，优选为高于50ng/ml裂解物，优选为高于100ng/ml裂解物。 在一特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中的EGF浓度为高于O. 5ng/ml裂解物，优选为高于lng/ml裂解物，优选为高于I. 5ng/ml裂解物，优选为高于2ng/ml裂解物，且优选为高于2. 5ng/ml裂解物。在一特别实施方式中，本发明或通过本发明的方法所得的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物不会引起血液细胞相关的输血反应。“血液细胞相关的输血反应”是指这种含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物不带有完整的活细胞(例如红血球、血小板及白血球)，故可避免在患者身上引起一定范围的已知输血反应，包括免疫(如异体免疫(Alloimmunization))及溶血性并发症(如參见Stroncek et Rebulla,“Platelettransfusions，，，The Lancet,August 4,2007 ；vol. 370 :427-438) 确实，免疫能力正常的受赠者通常会对捐赠者的血液细胞抗原表现出免疫反应，而引起多种取决于相关血液细胞及特异抗原的临床結果。最普遍的相关抗原是选自下列种类(I)第一型HLA，血小板及白血球共有者；(2)第二型HLA，在某些白血球有表现者；(3)颗粒性白血球特异抗原；(4)血小板特异抗原(举例来说，如人类血小板抗原HPA);以及(5)红血球特异抗原。在一特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物是从AB血型供血者的血小板浓厚液制得，故不含抗-A血凝素或抗-B血凝素的抗体，从而特别是避免受血者可能会发生的溶血反应。在另ー特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物是从特定血型的血小板浓厚液制得，而用于与供血者相同血型的患者，其中所述血小板浓厚液是得自小族群的供血者(如A族群或B族群)的供血者。更特定言之，在本发明的制备方法中，活的血液细胞(红血球、白血球及血小板)会被溶剤-清洁剂摧毀/溶胞，从而減少(且更佳为预防)患者暴露于外来抗原及完整血液细胞的风险。故本发明的方法可从由患者得到的血小板(用来治疗患者本身)、或从同种异体的血小板来制备含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物。在另ー实施方式中，通过本发明的方法所得的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物进ー步包含免疫球蛋白，如IgG、IgM及/或IgA。在ー特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中免疫球蛋白IgG的浓度较佳为高于5g/L裂解物，且更佳为约8g/L裂解物。在另ー实施方式中，通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物可进ー步额外进行纯化步骤，例如离子交換层析，以移除免疫球蛋白，例如IgG、IgM 及/或 IgA0在另ー实施方式中，本发明或通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物包含白蛋白、纤维蛋白原及凝血酶原当中至少ー种。在一特别实施方式中，本发明的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中的白蛋白浓度优选为闻于30g/L裂解物。在另ー实施方式中，本发明或通过本发明的方法所得的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物进ー步包含α I-抗胰蛋白酶(α Ι-antitrypsin)、α2_抗胞楽;素(a 2-antiplasmin)、α 2-巨球蛋白(a 2-macroglobulin)、转铁蛋白(transferrin)、纤维黏连蛋白(fibronectin)及 C1-INH。在一优选实施方式中，血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂于本发明的方法进行培养的时间范围为从2至4小时，其是于生理pH值下进行，如在从pH 7. O至pH 7. 5范围内·的PH值(当起始血小板为新鲜的血小板吋)、或在从pH 6. 8至8. 2范围内的pH值(当起始血小板为过期及/或冷冻血小板吋)进行。有利的是，培养温度为约31°C。在本发明的方法中所使用的合适溶剂为ニ -或三烷基磷酸酯类，如三-(η- 丁基)磷酸酯、三-(t-丁基)磷酸酯、三-(η-己基)磷酸酯、三-(2-こ基己基)磷酸酯、三-(η-癸基)磷酸酯、ニ-(η-丁基)磷酸酯、ニ-(t-丁基)磷酸酯、ニ-(η-己基)磷酸酯、ニ-(2-こ基己基)磷酸酯、ニ-(η-癸基)磷酸酯及具有不同烷基链的ニ烷基磷酸酯类。可使用具有不同烷基链的ニ或三烷基磷酸酯类，例如ニ-(η-丁基)磷酸こ酷。特别优选的三烷基磷酸酯为三-(η- 丁基)磷酸酯(TnBP)。在本发明的方法中所使用的合适清洁剂包括脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯类(partial esters)(例如品名为“Tween 80” (也称为“聚山梨醇酯80(polysorbate80) ”)、“Tween 20”的市售产品)及非离子性清洁剂(如以下列品名贩卖的氧こ基化的烷基酚“Triton X-100”或“Triton X_45”)。进ー步考虑的清洁剂是脱氧胆酸钠及磺基甜菜碱类，如N-十二基-N，N- ニ甲基-2-铵-I-こ烷磺酸盐(N-dodecyl-N，N-dimethyl-2-ammonio-l-ethane sulphonate)。特别优选的清洁剂为 “Triton X-45”、“TritonX-100，，、“Tween 80”及“Tween 20”。在本发明的特别实施方式中，起始血小板浓厚液是与溶剂及清洁剂共同培养，优选为与TnBP及Triton X-45共同培养。有利的是，所述溶剂或所述清洁剂的最终浓度、或所述溶剂及所述清洁剂的个别最終浓度是包含于从0. 2至5体积％的范围内，优选为包含于从0. 2至2体积％的范围内，其是以所述血小板浓厚液的体积为基础计算。在一优选实施方式中，所述起始血小板浓厚液是与2% TnBP共同培养。在另ー优选实施方式中，所述起始血小板浓厚液是与1% TnBP及1% Triton X-45共同培养。所述溶剂及/或清洁剂可通过以医药等级油进行油萃取及活性碳萃取、或仅通过活性碳萃取而从生物性流体中萃出，如此则留存的裂解物中的溶剂及/或清洁剂已被耗尽。所述医药等级油可以是天然油(例如从植物或动物萃取出来的油)或结构类似的合成化合物。合适的天然油包括蓖麻油(castor oil,或称ricinus oil)、大豆油、葵花油、棉籽油。优选的合成化合物为合成性三酸甘油酷。合适的合成性三酸甘油酯范例包括三油精(triolein)、三硬脂精(tristearin)、三棕榈精(tripalmitin)、三肉宣蘧精(trimyristin)、及其组合。医药等级油的量为可萃取至少80%脂溶性エ艺化学物质(process chemical)的量，所用油量为从2至20重量％，其是以血小板浓厚液的重量为基础计算；优选为从5至15重量％，且更优选为从5至10重量％。活性碳萃取可用前文所述的经活化的活性碳来进行，所述活性碳可吸收并留置溶剂及/或清洁剂粒子。活性碳萃取可分批进行(即将活性碳与油萃取后回收的水性蛋白相混合)或在管柱中进行(使水性蛋白相通过前置沉淀活性碳(preably sedimentedcharcoal))，或者透过预先填充的市售筒匣来进行。在一优选实施方式中，活性碳萃取为分批进行。
在一优选实施方式中，当在与经活化的活性碳共同培养之前进行油萃取时，用以进行活性碳萃取的经活化的活性碳用量为从50至250g/l水性蛋白相，优选为从55至200g/l水性蛋白相，或从60至150g/l水性蛋白相，或从65至100g/l水性蛋白相。在一更一优选实施方式中，用以进行活性碳萃取的经活化的活性碳用量为75g/l水性蛋白相，其中水性蛋白相是在油萃取后回收得到。在另ー优选实施方式中，当在与经活化的活性碳共同培养之前不进行油萃取吋，用以进行活性碳萃取的经活化的活性碳用量为从250至1250g/l经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液，优选为从275至1000g/l经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液，或从300至750g/l经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液，或从325至500g/l经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液。在一优选实施方式中，在油萃取及活性碳萃取后、或仅进行活性碳萃取后的溶剂量为小于IOOppm,优选为小于50ppm,优选为小于20ppm,更优选为小于IOppm,小于5ppm,且再更优选为小于lppm。在一优选实施方式中，在油萃取及活性碳萃取后、或仅进行活性碳萃取后的清洁剂量为小于500ppm,优选为小于250ppm,更优选为小于IOOppm,更优选为小于50ppm,且再更优选为小于lOppm。在一优选实施方式中，本发明的方法可在油萃取后、或在与活性碳共同培养后进一歩包含至少ー离心步骤。优选地，该离心步骤是在油萃取及活性碳萃取后进行，或在単独施行活性碳萃取后进行，以移除细胞碎片。有利的是，所述离心步骤是于800至20000Xg进行10至30分钟，且优选为于IOOOOXg进行15分钟。 在一优选实施方式中，本发明的方法亦可进ー步包含至少ー额外步骤，其是选自层析纯化及/或超滤、及/或纳米过滤、及/或无菌过滤。在油及活性碳萃取、或活性碳萃取后接着可以进行层析纯化。优选地，是将活性碳与在油萃取后回收的水性蛋白相的混合物、或活性碳与经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液的混合物于培养后进行离心，收集上清液并将之加入层析支持物，以流析出混合物的成分，或移除某些成分。可用的合适层析管柱包含反相(疏水性交互反应)基质、或蛋白吸附基质如离子交換(阴离子及阳离子)基质及亲和力(如免疫-亲和カ或固定化肝素)基质、或尺寸排除(size-exclusion)基质。在一优选实施方式中,血小板裂解物中所包含的生长因子会被留置在所用的层析支持物上，并进一歩被合适的洗提缓冲液洗提出来。优选地，层析条件是选自例如使层析分离/纯化在可与目标生长因子的稳定性及生理功能兼容的PH值下进行，如实质为中性的PH值，如此则可避免生长因子变性。充填、清洗及洗提的条件是由发明所属领域一般技术人员依其一般常识来決定。在通过油及活性碳萃取或单由活性碳萃取来移除溶剂及/或清洁剂后，可进ー步加入ー步骤，来使非包膜病毒(如小病毒B19、或者也可能是A型肝炎病毒(HAV))去活化或将之移除，例如纳米过滤，且更特别是使用75-nm、35-nm、20-nm、15-nm或10-nm孔径的滤膜来进行纳米过滤。在一特别实施方式中，在本发明的方法中用作起始材料的血小板浓厚液是单ー或混合(pooled)的标准血小板浓厚液，例如制备作输血用途的血小板浓厚液。血小板浓厚液亦可得自全血的血沉棕黄层分离法。一単位得自血沉棕黄层的血小板浓厚液一般为30至50ml。得自血沉棕黄层的血小板可用作起始材料，其为单ー単位或多个单ー单位的混合，如在形成一治疗性单位时，其为4至6个单ー单位的混合(如Council of Europe 所编辑的 Guide to the preparation, use and quality assurance of bloodcomponents_13thedition (2007)中的揭不)。血小板浓厚液可通过血液分离术、细胞分离术(cytapheresis)或血小板分离术(plateletpheresis)标准程序(如參见 Council of Europe 所编辑的 Guide to thepreparation,use and quality assurance oi blood components,13th edition(2007),)得至1J，且可通过使用 MCS+(Haemonetics)、Trima Accell 或 COBE Spectra(Gambro)或Amicus(Baxter)而得到。与透过血沉棕黄层分离法程序所得者相较之下，血小板分离术ー般会从每个捐赠者身上得到较大的体积(相当于300ml血小板浓厚液)。在一优选实施方式中，本发明的方法包含一制备起始血小板浓厚液的初步步骤。有利的是，制备起始血小板浓厚液的方法包括但不限于标准血库程序(如血小板分离术或透过全血捐输的血小板制备法)及重点照护程序(如那些使用血球保存剤/分离器或桌上装置者)。在本发明的方法中，用作起始材料的血小板浓厚液可以是新鮮(即收集后少于5或7天)、过期(即收集后多于5或7天)、或过期且冷冻于_20°C或以下数周的时间。在一特别实施方式中，在本发明的方法中用作起始材料的血小板浓厚液可进ー步包含白血球及/或红血球。故该起始血小板浓厚液可能包含数种已分化且未活化的白血球,如淋巴细胞、嗜中性的颗粒性白血球及单核球。更特定言之,嗜中性球及单核球富含内有骨髓过氧化酶(myeloperoxidase)的颗粒,这种酶会催化氯化物的氧化作用，而生成次氯酸(hypochlorous acid)及其它反应性氧衍生物，其中所述反应性氧衍生物是作为杀菌氧化剂，对微生物及霉菌具有毒性。因此，当起始血小板浓厚液包含数种已分化且未活化的白血球时，通过本发明的方法所得的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物进ー步包含抗微生物成分及多种源自白血球的生长因子。在一优选实施方式中，用作起始材料的血小板浓厚液中的白血球会被消灭，优选为通过白血球去除作用(Ieukoreduction)来进行，以避免白血球中的蛋白酶及酸水解酶发生促发炎反应。白血球去除作用也可降低普利子蛋白(prion)污染的风险。健康人的正常血小板计数一般为每mm3血液中包含150000至400000个血小板，亦即150至400 X IO9个血小板/し这个“正常”血小板计数在约95%健康人身上是如此，而剩下的5%可能会有统计上不正常的血小板计数(非常低或非常高)。当以血小板分离术收集血小板时，在一袋250ml当中的血小板计数一般是高于每ml有I. 2X IO9个血小板，其血小板计数相当于每袋(単位)有多于约3X IO11个血小板。在一优选实施方式中，起始血小板浓厚液中血小板的数目比血液中通常的数目高出3至10倍。本发明或通过本发明的方法所得的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物可与人工支架(例如以胶原蛋白、几丁聚醣(chitosan)、陶瓷所制造者)混合，或与得自血 浆的纤维蛋白黏胶或纤维蛋白密封剂混合；举例来说，其可用于治疗目的，即治疗性或预防性的处理，用于在人类及/或动物身上治疗适应症，而透过医药、免疫或代谢效用来回复、修正或改变其生理功能。本发明或通过本发明的方法所得的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物特别适用于处理人类及/或动物的病症、及/或用干与其身体的体表部分接触，这是因为它的溶剂及清洁剂都已被清除，且具有病毒安全性。亦可在含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物中加入额外的化合物，其包含但不限于化疗剂、抗生素及/或激素。本发明的另一目的是ー种本发明或通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物干治疗性应用及于试管内或活体外的细胞培养的用途。当其用于在试管内或活体外的细胞培养时，本发明或通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物存在于培养基中的量是在培养基体积的从1%至30%范围内，优选为从2%至20%范围内，又更优选为从3%至10%范围内。本发明的另一目的是ー种医药产品及/或美容产品，其包含本发明或通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物。“医药产品”是指血小板凝胶(platelet gel)、血小板黏胶(platelet glue)、富含生长因子的纤维蛋白黏胶及/或密封剂(sealant)、人工支架。“美容产品”是指数种施用于人体的制剂当中的任ー种，其用于美化、保存或改变外表、或清洁、着色、调理或保护皮肤、头发、指甲、嘴唇、眼睛或牙齿。本发明的另一目的是ー种本发明或通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物于细胞培养的用途，其是适用于在试管内或活体外培养纤维母细胞、软骨细胞、成骨细胞、角质细胞(keratinocytes)、干细胞及/或移植细胞(transplantscells)。本发明的另一目的是适用于在试管内或活体外培养纤维母细胞、软骨细胞、成骨细胞、角质细胞、干细胞及/或移植细胞的培养基，且包含本发明或通过本发明的方法得到的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物。在一优选实施方式中，本发明含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物的用途是用于促进干细胞的繁殖及/或分化，特别是间质干细胞。在一优选实施方式中，本发明含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物的用途是用于促进干细胞分化为成骨细胞系及/或软骨细胞系。
本发明的另一目的为ー种本发明含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的用途，其是用于促进骨骼重建、骨骼再生或伤ロ疗愈，以及美容用途。本发明的上述及其它目的、特征及优点将因以下叙述、參考文献及后附图式而变得更加显明。实施例I.材料与方法I.分离术血小板(apheresis platelet)的收集起始血小板浓厚液(PC)是征得志愿捐赠者同意后使用MCS+多成分系统(Haemonetics, Braintree, USA)收集而来。全血是透过使用间歇性流动(intermittent flow)的静脉导管取得，并立即以1/9的比例用柠檬酸右旋葡萄糖溶液配方A(citratedextrosesolution Formula A)进行抗凝血处理。通过连续离心,使血小板与红血球及其它血液成分分离，并悬浮于血浆中，再收集到无菌容器内。进行数个分离循环，直到所收集的PC的总体积达到在225及315mL之间的体积范围为止，预定的血小板产量目标是等于或大于3. OX 1011。PC是于室温缓慢混合储存，并在收集的24至72小时内进行处理。2.细胞计数红血球、血小板及白血球在起始PC中的含量是使用细胞计数器(ABC VetAutomaticBlood Counter, ABX Diagnostics, Franceノ 来测足。3.起始血小板浓厚液的处理a.研究设计起始血小板浓厚液是根据图I的研究设计来处理。简言之，将PC (300mL)移入塑料袋，并如EP 1，685，852所述进行处理。将血浆浓厚液(plasma concentrates)与 1% (v/v)(终浓度)三正丁基憐酸酯(TnBP) (MerckKGaA,Darmstadt, Germany)及 I % (v/v)(终浓度)Triton X-45 (Sigma, Missouri, USA)的组合于室温(RT)恒定温和搅拌(70rpm) (FINEPCR, Seoul, Korea)的条件下共同培养I小时。之后加入10% (v/v)(终浓度)大豆油(Sigma, Missouri, USA),先剧烈混合30秒，之后与经S/D处理的PC(S/D-PC)于室温(RT)在70rpm混合15分钟。之后将该油/S/D-PC混合物倒出45分钟，以分离出清澈的油相(顶部)、浊相(turbidphase)(中间)及一清澈的水性蛋白相(底部)。通过重力从袋子底部回收水性蛋白相(约2701^)，并于20-25^在6000父8离心10分钟使之澄清，并使细胞碎片或不溶材料沉淀成团块状。在离心后，回收上清液(S/D-PC-0，约265mL)并于RT在70rpm与回收19. 9g经活化的活性碳(3M，St. Paul, MN, USA)混合30分钟，其对应比例为I. 5g/20mL的S/D-PC-0。之后将混合物离心(6000 X g，10分钟，RT)而使活性碳沉淀成团块状，并回收澄清的上清液(S/D-PC-0C)。使样本经此方法处理并于_80°C冷冻，直到要进行分析为止。所呈现的数据为四次或五次重复的平均图形。4.活性碳比例的影响进行小规模预先实验，决定要用来移除TnBP及Triton X_45的活性碳的最适量，并评估它对GF及蛋白含量的影响。使用旋转混合器将用量递增的活性碳(1.5至4め与5/D-PC-O (20mL)于RT在70rpm混合30分钟。之后将混合物离心(6000 X g, 10分钟，RT)，使活性碳沉淀成团块状并回收澄清的上清液，再将之于-30°C冷冻，直到进行评估为止。
5.生长因子测定在程序的各个步骤中取出I-ml样本。将之于10000 Xg离心15分钟(Microfuge 22R, Beckman Coulter, Fullerton, CA),使血小板及/或细胞碎片沉淀成团块状,并得到无细胞的上清液来进行血小板源生长因子的測量。之后上清液立即于_80°C冷冻。样本于37°C解冻，并在I小时内以敏感且具专一性的市售免疫測定法进行分析。标准品及样本进行二重复測定，并计算平均值。结果乘以样本所用的稀释系数。PDGF-AB.TGF-β I、EGF、VEGF及 IGF-1 是特别使用 Quantikine 套组(R&D Systems ；Minneapolis, MN)来进行ELISA测定而进行量测。a. PDGF-AB使用Quantikine ELISA kit (#· DHD00B，R&D SYSTEMs, Minneapolis, MN)来测定PDGF-AB0样本以Calibrator稀释剂(RD6-11)稀释100倍。将孔盘培养2小时、清洗、并和与酶共轭结合的I3DGF-AB抗体于室温再共同培养3小吋。使用清洗缓冲液(WashBuffer)来清洗盘孔，之后于室温加入基质溶液(Substrate Solution) 20-30分钟。盘孔为避光保护。在各盘孔中加入停止溶液(Stop Solution)，并使用微滴定盘读取仪来测定450nm的吸光值。最小可侦测的剂量为1.7pg/ml。b.TGF-βΙ使用Quantikine ELISA kit (DB100B，R&D SYSTEMs)来测定 TGF-β I。样本以Calibrator稀释剂(RD5-26)稀释100倍。在涂覆有TGF-β -受器II的96孔微滴定盘中制备体积为100-μ I的TGF-β I标准品(890207)稀释序列。在TGF-β I分析之前，进行酸活化及中和反应，以将潜性TGF-β I活化到免疫活性形成状态。为达此目的，将0. 5ml样本与0. Iml 的 IN HCl 混合，于室温培养 10 分钟，加入 0. Iml 的 I. 2N Na0H/0. 5MHEPES(N_[2_ 羟基こ基]哌-N0-[2-こ烷磺酸])(Sigma, H-7523)加以中和，再行离心。之后測定上清液部分的总TGF-βΙ含量。将各等分(50μ1)以二重复的方式加到微滴定盘中，之后盖上盖子，于室温培养2小吋。之后清洗盘孔，加入与酶共轭结合的TGF-β I多株抗体，并于室温持续培养I. 5小吋。如前述完成測量。TGF-β I的侦测限值为4. 61pg/ml。c. EGF使用Quantikine ELISA kit(#. DEG00, R&D SYSTEMs, Minneapolis, MN)来测定EGF。样本以Calibrator稀释剂(RD6N)稀释20倍。将200 μ I的标准品、对照品或样本加入盘孔中。将孔盘于室温培养2小吋。各盘孔经过抽吸，并填入清洗缓冲液来加以清洗。在各盘孔中加入EGF共轭结合物，并于室温培养2小吋。使用清洗缓冲液清洗盘孔，并在各盘孔中加入基质溶液(200 μ I)。混合物于室温避光培养20分钟。在各盘孔中加入停止溶液(50 μ I)。各盘孔的光学密度是使用微孔盘读取仪(VersaMax microplate reader,Molecular Devices, USA)在30分钟内于450nm进行測定。最小可侦测的剂量为0. 7pg/ml οd. VEGF使用Quantikine ELISA kit (#DVE00, R&D Systems, Minneapolis, MN)来定量VEGF0样本以Calibrator稀释剂(RD6U)稀释2倍。如制造商所说，其最小可侦测的剂量范围为小于9. 0pg/ml，且平均MDD为50ng/ml。在各盘孔中加入100 μ I的测定稀释剂(RDlW)，接着是100 μ I的标准品(VEGF标准品)。以黏胶条覆盖孔盘，并于室温培养2小吋。将盘孔清洗3次，之后和与酶共轭结合的VEGF于室温共同培养2小吋。e. IGF-I·使用Quantikine ELISA kit (DG100，得自 R&D SYSTEMs)来定量 IGF-1。样本以Calibrator稀释剂(RD5-22)稀释100倍。如制造商所说，其最小可侦测的剂量范围为从O. 007至O. 056ng/ml，且平均MDD为O. 026ng/ml。在各盘孔中加入150 μ I的测定稀释剂0 1-53)，接着是5(^1的标准品(890775)。以黏胶条覆盖孔盘，并于2_8°C培养2小时。将盘孔清洗3次，之后和与酶共轭结合的IGF-I于2-8°C共同培养I小吋。如前述完成测量。6. P-选择素测定使用Quantikine kits (R&D Systems)而以 ELISA 测定法来测量 P-选择素。7.蛋白及脂质测定在油萃取后及在活性碳吸收后，用RocheP800分析仪来测定总蛋白、白蛋白、总胆固醇及三酸甘油酯(triglycerides, TG)在起始PC中的量。IgG、IgM及IgA是在 CobasIntegra 800(Roche COBAS INTEGRA 800, RocheDiagnostics, Mannheim,Germany)使用全自动乳胶增强免疫比池测定法(fully automatic latex-enhancedimmunoturbidimetricassay)来测重。8.十二烧基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDb—PAGEノSDS-PAGE是使用4_12 %梯度凝胶、反应试剂及Invitrogen电泳系统(InvitrogenCorporation,Carlsbad,California,USA)在未还原与还原的条件下进行。使用Novex Sharp Pre-Stained Protein Molecular Weight Standard (Invitrogen)来估
算分子量。9. TnBP 及 Triton X-45 測定如先前所述进行样本的萃取，以测定残余的TnBP及Triton X-45 (19)。以气相层析(GC-17A, SHIMADZU, Tokyo, Japan)及火焰离子化侦测(flame ionization detection)来进行 TnBP 定量，另使用 LiChrospher 100RP-18 管柱(ID :4mm，长度250mm，P/N :724964,Merck KGaA, Darmstadt, Germany)以高效液相层析(SHIMADZU)来进行 TritonX-45 定量。10.细胞培养S/D-PC-0C在试管内刺激细胞生长及取代FBS的能力是使用下列细胞株来进行评估(a)人类成骨细胞MG63 (ATCC CRL 1427，购自中国台湾新竹生物资源保存及研究中心，BCRC)及(b) StatensSeruminstitute 兔角膜上皮细胞(rabbit corneal epithelialcells, SIRC) (ATCC CCL-60，购自BCRC)。这些细胞株是维持在37°C且含有5% CO2的控制环境中。它们是以姆孔2X IO3个细胞的密度在平底96孔盘(Greiner bio-one,Tokyo, Japan)中使用最低必需培养基(minimum Essential medium,MEM) (Gibco, Invitrogen)进行培养，所述培养基含有2. 2g的NaHC03、0. ImM非必须胺基酸、ImM丙酮酸钠(sodium pyruvate)、2mM的L-麸酰胺酸(L-glutamine)、100U/mL青霉素及100 μ g/mL链霉素，且添加了 10 %(v/v) FBS (Gibco, Invitrogen)。在实验中，ー开始是使细胞贴附18小时,之后在测试不同的GF添加物之前，于无血清培养基中使细胞处于饥饿状态6小吋。用无血清培养基清洗两次后，将细胞在添加了不同浓度(I至10% )的S/D-PC-OC的培养基(分别对应于TGF-β终浓度在O. 31及3. lng/ml之间的范围)培养高达5天的时间。每轮实验都以不添加任何蛋白/GF添加物或添加了 10% FBS的细胞培养物来作为对照组。11. MTS 测试在培养五天时，使用MTS四唑鎗[3-(4，5_ ニ甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)~2~ (4-横苯基)-2H-四唑鐵，[3- (4, 5-dimethylthiazol_2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(^-sulfophenyjj-2H-tetrazolium)的内盐 unner;(PromegaCorporation,Madison, Wisconsin, USA)依照制造商的指示来测定目视在增生的细胞。这项测定使用了MTS溶液及电子稱合试剂PMS (吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate))。MTS会被细胞生物还原(bioreduced)为不溶于组织培养基的产物甲膜(formazan)。具代谢活性的细胞 当中的去氢酶会将MTS转换为甲臜。从96孔测定盘测量甲臜于490nm的吸光值，其与培养物中存活细胞的数目有直接的比例关系。制备后，将溶液保持在-20°C的避光保护管中。将MTS及PMS侦测试剂以20 KMTS PMS)比例混合后，立刻以I 5 (MTS+PMS/培养基)的比例加入细胞培养物中。12.统计分析数据是以平均值土标准差(SD)来表示。并以双尾配对学生检定(two-tailedpairedStudent test)来进行统计上的比较。P值小于0. 05是用来估算平均测试參数的明显差异(the significance of the differences)。当p值< 0. 05时，则认为有明显差异。II.结果I.细胞计数起始PC 平均含有 1216± 188. 6X IO6 个血小板/ml (范围896-1388X IO6 个 /ml)。白血球及红血球的平均计数分别为0. 32 ±0. 10 (范围0. 20-0. 4) X IO6个/ml及
O.04 + 0. 01 (范围0. 02-0. 06) X IO9个/ml。之后进行S/D处理的所有流析物中都侦测不到血球细胞。2.活性碳的最适比例測定预先实验显示活性碳处理在所测试的各个比例都会移除S/D试剂，但也会大幅降低TOGF-AB及VEGF的含量。因此进行下列测试将用量渐增的活性碳(I. 5、3、3. 5或4g)与20mL的S/D-PC-0混合。在所有进行评估的比例中，残余的TnBP均< 2ppm，而残余的TritonX-45则分别为9、3、2及I. 5ppm。图2显示S/D-PC-0流析物的活性碳处理对于PDGF-AB, TGF-β I、EGF、VEGF 及 IGF-I 含量的典型影响。TGF-β I、EGF 及 IGF-I 的浓度保持基本不变，而在所有进行评估的比例中，PDGF-AB及VEGF含量都大幅降低。每20mL的S/D-PC-O对I. 5g的活性碳的比例可让TnBP及TritonX-45的量降低至少于IOppm,故在后续实验中使用该比例。3.多种流析物的组成使用19. 9g的活性碳对265mL的P/D-PC-0萃取物(对应选择率为I. 5g/20mL)进行活性碳处理，其对GF、p-选择素、蛋白、胆固醇及TG含量的影响如表I所示(4次实验的平均值)。在油萃取及活性碳吸收后，TGF-β I、IGF及EGF浓度保持基本恒定(分别为约368、55及2. 4ng/mL)。在S/D-PC-0C中的GF平均整体回收量相对于在S/D-PC-0中所侦测到的含量分别为TGF-e I为81. 5%，EGF为94%，而IGF为83. 8%。相对而言，PDGF及VEGF的平均浓度在活性碳处理当中显著降低(P < O. 01)(分别为约2. 31ng/mL及< O. 009ng/mL)，确认了在小規模实验中的观察。P-选择素含量不会受活性碳处理的影响太多，只有轻微的降低。白蛋白、IgG、IgA、IgM的平均浓度保持基本不变，但可观察到纤维蛋白原含量有显著的小幅降低(P < O. 05)。胆固醇及TG平均含量保持稳定。TnBP平均量会从约738ppm降至 8. 7ppm,而 TritonX-45 则会从 2628ppm 降至 8. 8ppm(p < O. 001)。表I经S/D处理的血小板浓厚液在油萃取后的组成物(S/D-PC-0)及其在活性碳处理后的组成物(S/D-PC-0C) (N = 4)
权利要求
1.ー种含有病毒去活化的生长因子且roGF及VEGF耗尽的血小板裂解物。
2.如权利要求I所述的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物，其包含生长因子TGF-β、IGF 及 EGF。
3.如权利要求I或2所述的含有病毒去活化的生长因子的血小板裂解物，其中 -PDGF-AB在所述裂解物中的浓度为低于10ng/ml，更优选为低于5ng/ml，更优选为低于3ng/ml ;及/或 -VEGF在所述裂解物中的浓度为低于O. lng/ml，更优选为低于0.01ng/ml ;及/或 -TGF-β在所述裂解物中的浓度为高于50ng/ml，更优选为高于100ng/ml，更优选为高于150ng/ml,更优选为高于200ng/ml,更优选为高于250ng/ml ;及/或 -EGF在所述裂解物中的浓度为高于O. 5ng/ml，更优选为高于lng/ml，更优选为高于I. 5ng/ml,更优选为高于2ng/ml,更优选为高于2. 5ng/ml ;及/或 -IGF在所述裂解物中的浓度为高于20ng/ml，更优选为高于50ng/ml，更优选为高于100ng/ml。
4.一种制备含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的方法，其包含下列步骤 a)使起始血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂接触； b)使所述起始血小板浓厚液与所述溶剂及/或清洁剂共同培养 -一段至少5分钟至6小时的时间， -其pH值维持在从约6. O至约9. O的范围内，且 -其温度是在从2 °C至50°C的范围内； c)通过油萃取来选择性移除所述溶剂及/或清洁剂，以得到一水性蛋白相；以及 d)将步骤b)的经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液或步骤c)的水性蛋白相与活性碳共同培养。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述溶剂是选自由ニ-或三-烷基磷酸酯类、具有不同烷基链的ニ -或三-烷基磷酸酯类所组成的群组，优选为三正丁基磷酸酯(TnBP)。
6.如权利要求4至5任一项所述的方法，其中所述清洁剂是选自由脂肪酸的聚氧こ烯衍生物、山梨糖醇酐的偏酯类、非离子性清洁剂、脱氧胆酸钠及磺基甜菜碱类所组成的群组，优选为 Triton X-45> Triton X-100 或 Tween 80。
7.如权利要求4至6任一项所述的方法，其中步骤b)中所述溶剂及/或所述清洁剂的个别浓度范围为从O. 2至5体积％，其是以所述起始血小板浓厚液的体积为基础计算。
8.如权利要求4至7任一项所述的方法，其中，所得病毒去活化的生长因子血小板裂解物是权利要求I至3任一项所述的病毒去活化的生长因子血小板裂解物。
9.如权利要求4至8任一项所述的方法，其中油萃取是以医药等级油来进行，所述油的用量为从2至20重量％、或从5至15重量％或从5至10重量％ ,其是以所述血小板浓厚液与所述溶剂及/或清洁剂的混合物的重量为基础计算。
10.如权利要求4至9任一项所述的方法，其中 -当进行步骤c)的油萃取时，亦对步骤c)的水性蛋白相进行活性碳萃取，其中活性碳的量为所述水性蛋白相的从50至250g/l，优选为从55至200g/l、或从60至150g/l、或从65至100g/l ;以及-当不进行油萃取吋，则对步骤b)的经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液进行活性碳萃取，其中活性碳的量为所述水性蛋白相的从250至1250g/l，优选为从275至IOOOg/I、或从 300 至 750g/l、或从 325 至 500g/l。
11.如权利要求4至10任一项所述的方法，其中经活化的活性碳所吸收的甲基蓝为经活化的活性碳的从100至550g/m2范围内，优选为从300至500g/m2或从100至300g/m2范围内。
12.如权利要求4至11任一项所述的方法，其在步骤c)油萃取之后、及/或在步骤d)与活性碳共同培养之后进ー步包含至少ー离心步骤。
13.如权利要求4至12任一项所述的方法，其进ー步包含步骤(e):层析纯化及/或超滤及/或纳米过滤。
14.如权利要求4至13任一项所述的方法,其在步骤a)之前进ー步包含一制备起始血小板浓厚液的初步步骤，优选为通过血小板分离术或血沉棕黄层分离法而从全血加以制备。
15.如权利要求4至14任一项所述的方法，其中步骤a)的起始血小板浓厚液是从混合血小板浓厚液得到。
16.ー种通过权利要求4至15任一项所述的方法得到的含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物、或权利要求I至3任一项所述的含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的用途，其用于美容、促进骨骼再生或重建、或治疗骨折。
17.—种通过权利要求4至15任一项所述的方法得到的含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物、或权利要求I至3任一项所述的含有病毒去活化的生长因子且TOGF及VEGF耗尽的血小板裂解物的用途，其用于试管内或活体外的细胞培养，优选为用于促进干细胞分化为成骨细胞系及/或软骨细胞。
全文摘要
富含生长因子(PGF)的人类血小板萃取物可用于伤口疗愈及干细胞扩增，近来日益受到关注。本发明关于一种含有病毒去活化的生长因子且PDGF及VEGF耗尽的血小板裂解物，优选为富含TGF、IGF及EGF者。本发明进一步关于一种得到上述血小板裂解物的方法，其包含下列步骤使起始血小板浓厚液与一溶剂及/或清洁剂接触；使所述起始血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂共同培养一段至少5分钟至6小时的时间，其pH值维持在从约6.0至约9.0的范围内，且其温度是在从2℃至50℃的范围内；通过油萃取来选择性移除上述溶剂及/或清洁剂，以得到一水性蛋白相；以及将该经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液或该水性蛋白相与活性碳共同培养。
文档编号C12N5/00GK102985101SQ201180025490
公开日2013年3月20日 申请日期2011年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者席耶利·布诺夫, 苏正尧 申请人:国维联合科技股份有限公司