专利名称：木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法
木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物基化学品的生物制造和生物炼制领域，具体地说，是以玉米秸杆等木质纤维素为原料，使用同步糖化与发酵工艺生产微生物油脂，并将纤维素酶部分回收和废水循环利用的方法。
背景技术：
生物柴油是最重要的可再生液体燃料产品之一，是采用动物或植物油脂及酯化交换反应得到的、具有与石化柴油同标号、相同使用效果的一种合成燃料。以植物油脂为原料生产生物柴油,原料成本占生产成本的70% -85%。同时，作为生物柴油原料的菜籽油、大豆油、棉籽油、工业废脂肪酸以及厨余油等价格均高于或接近生物柴油成品。因此，生物油脂资源是制约生物柴油产业发展的主要瓶颈。自然界有少量微生物可以在适宜的条件下代谢环境中的碳水化合物，合成并贮存超过其细胞自身干重20 %以上的油脂组分，具有这种特性的微生物统称产油微生物。产油微生物细胞积累的油脂组分与植物油脂具有高度相似性，是一种优质的合成生物柴油的油脂资源。木质纤维素原料是自然界最为丰富的碳水化合物资源，全球每年的木质纤维素产量可达IO11吨。因此，利用廉价、丰富的木质纤维素原料生产微生物油脂具有广阔的应用前景。近年来，发酵生产油脂的研究多有报道。Economou等用霉菌Mortierellaisabellina以甜高粱作物基质进行半固体发酵，含水量为92%时，产油量达到llg/100g干物质。Angerbauer等用Lipomyces starkeyi以活性污泥为基质进行发酵,含油率达到68%,经过超声处理的污泥产油达到1.0g/L。Chanika等用Rhodotorula glutinis以甘油为碳源，硫酸铵为氮源，吐温20为表面活性剂进行发酵研究，在反补发酵过程中，最高油脂产量6.05g/L,油脂含量为60.r10A。Chen等筛选出了一种能够广泛耐受木质纤维素降解物的一株 Trichosporon cutaneum CXl0目前，尽管发酵生产油脂的研究有很多报道，但是，大多数微生物发酵生产油脂的底物都是淀粉基葡萄糖或环境和工业废弃物，高昂的原料成本大大限制了微生物油脂的产业化发展，而微生物油脂生产产业化的关键在于廉价的发酵底物。同时，使用木质纤维素作为微生物油脂的发酵原料最大的成本在于纤维素酶的价格，因此，如何提高纤维素酶的酶解效率，降低纤维素酶加量，回收纤维素酶，成为进一步降低成本的关键。本发明提供一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，同时实现了纤维素酶的部分回收和发酵废液的循环利用，有效降低了微生物油脂的生产成本，为微生物油脂的产业化提供了相关的技术储备。
发明内容本发明目的在于将木质纤维素原料通过同步糖化与发酵技术转化为可发酵糖并同时生产微生物油脂，以及发 酵结束后通过离心分离回收发酵醪上清液中纤维素酶的方法。本发明的构思:一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，具体地说是将发明人所在实验室筛选分离的耐抑制物皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CXl,活化之后接种于同步糖化与发酵的生物反应器中，加入纤维素酶，皮状丝孢酵母把纤维素酶解生成的可发酵性糖同步转化为微生物油脂；同步糖化发酵过程解除了糖化过程中葡萄糖浓度过高对酶解过程的抑制，以及发酵初始时葡萄糖浓度过高对皮状丝孢酵母的生长和产油的抑制，因此可实现高效的同步糖化与发酵木质纤维素原料生产微生物油脂。另外，通过离心分离发酵醪，回收上清液中的纤维素酶，可以充分利用纤维素酶，实现纤维素酶的高效利用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，具体步骤为，(I)木质纤维素原料的预处理；所述的木质纤维素原料包括玉米秸杆、麦杆、稻杆、油菜杆、甜高粱杆、甘蔗渣、木屑、废纸、柳枝稷或者麻风树籽壳中的一种或几种的混合物；所述的预处理方法包括稀酸预处理、机械预处理、碱法预处理、热水预处理、蒸汽爆破预处理、氨纤维膨爆预处理、生物预处理等，优选稀酸预处理；
(2)预处理后的物料脱毒处理；所述的脱毒方法包括水洗脱毒、过碱化处理(Overliming)、活性炭吸附、树脂吸附和生物脱毒等，优选生物脱毒；(3)对发酵菌种进行驯化培养；将冻存管中的菌种皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CXl在种子培养基中活化24小时，然后经含有50% (v/v)种子培养基的木质纤维素水解液驯化培养24小时，最后接入水解液中驯化培养24小时，水解液由经过预处理的木质纤维素原料酶解获得；所述的微生物油脂发酵菌种包括皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis、Lipomyces starkey1、Yarrowialipolytico等，以及通过诱变、基因操作等方法改造的上述菌株或其他菌株；所述的菌种驯化方法是先将冻存的菌种在合成培养基中活化，然后在不同浓度的木质纤维素酶解液中进行驯化培养，最后在100%的木质纤维素酶解液中进行菌种培养；(4)将驯化好的菌种与原料、纤维素酶加入到反应器中进行同步糖化与发酵；将纤维素酶和脱毒后的木质纤维素原料加入反应器，加入营养盐，在50°C，pH4.8的条件下预酶解0-24小时；然后在30°C，pH5.0的条件下接入驯化好的皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CXl进行同步糖化与发酵生产微生物油脂；所述的同步糖化发酵生产微生物油脂时，木质纤维素的固体含量为10-15% (w/w)，纤维素酶量为3.0-15.0 FPU/g DM，溶氧水平10%-40%，发酵时间为24 96小时；营养盐的添加量为:硫酸铵0-5.0g/L,七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0-0.5g/L。FPU (Filter Paper Unit)是指纤维素酶滤纸酶活，DM (Dry matter)是指干基木质纤维素；溶氧水平是指在一定条件下，溶解于水中分子状态的氧的含量；(5)将发酵后的发酵醪液进行液固分离，固相组分进行微生物油脂提取，液相部分作为纤维素酶重新循环利用；将步骤(4)获得的发酵醪经过固液分离，上清液全部回收使用，作为水和酶的混合物，同体则使用酸热法进行油脂提取。所述的利用同步糖化与发酵生产的微生物油脂包括油酸、亚麻酸、亚油酸、二十二碳六烯酸等一系列饱和与不饱和脂肪酸所组成的甘油三酯。所述的发酵醪的固液分离包括离心、抽滤、压滤、板框过滤等多种方法。所述的油脂提取方法包括酸热法、有机溶剂提取法、超声波破碎提取法等多种方法，优选酸热法提取油脂。所述的发酵醪上清液中回收纤维素酶包括外切酶、内切酶和糖苷酶在内的所有纤维素酶组分；循环利用发酵醪上清液进行同步糖化与发酵时，可以补加部分纤维素酶，也可不补加纤维素酶；发酵醪上清液可以循环使用1-3次。与现有技术相比，本发明的积极效果是:(I)本发明使用同步糖化发酵技术，实现了纤维素原料生产微生物油脂，大大降低了固液分离工段的成本，同时，消除了葡萄糖对酶解过程的抑制，有效提高纤维素的酶解效率，减少了纤维素酶用量，降低生产成本；(2)本·发明对发酵后上清液进行了回收利用，实现了对纤维素酶的充分利用，大大降低了使用纤维素酶的成本，极大减少了发酵过程中水的用量，既降低了成本，又减少了废水排放。
图1实施例1发酵过程曲线图；图2实施例2发酵过程曲线图。
具体实施方式以下提供本发明木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法的具体实施方式
。实施例1请参见附图1，经粉碎、洗涤、烘干后的玉米秸杆与稀硫酸溶液混合(固液比2: I, w/w),浸润过夜后,含水量约为33% (w/w),基于干稻杆的硫酸浓度2.5% (w/w);在190°C下预处理3分钟，预处理后物料调节pH到5.5，含水量约60% (w/w)，加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZNl, 25°C固态培养5天；收获物料,物料在115°C下灭菌20分钟，冷却后加入发酵罐中，发酵罐中固体含量质量分数分别为10%和15%，纤维素酶用量为7FPU/gDM，50°C预先糖化6小时和12小时，5摩尔每升氢氧化钠控制发酵过程pH在
5.0，30°C下发酵72小时，最终油脂浓度分别为3.03和4.02g/L。实施例2请参见附图2，经粉碎、洗涤、烘干后的玉米秸杆与稀硫酸溶液混合(固液比2: I, w/w),浸润过夜后,含水量约为33% (w/w),基于干稻杆的硫酸浓度2.5% (w/w);在190°C下预处理3分钟，预处理后物料调节pH到5.5，含水量约60% (w/w)，加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZNl, 25°C固态培养5天；收获物料,物料在115°C下灭菌20分钟，冷却后加入发酵罐中，发酵罐中固体含量质量分数为10%，纤维素酶用量为7FPU/g DM, 50°C预先糖化6小时，5摩尔每升氢氧化钠控制发酵过程pH在5.0，30°C下发酵72小时，最终油脂浓度为3.03g/L j5 4000rpm离心分离3分钟后，发酵上清液完全回收使用，发酵操作如前所述，最终油脂浓度为1.57g/L以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护 范围内。
权利要求
1.一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，具体步骤为， (1)木质纤维素原料的预处理； (2)预处理后的物料脱毒处理； (3)对发酵菌种进行驯化培养； 将冻存管中的菌种皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CXl在种子培养基中活化24小时，然后经含有50% (v/v)种子培养基的木质纤维素水解液驯化培养24小时，最后接入水解液中驯化培养24小时，水解液由经过预处理的木质纤维素原料酶解获得； (4)将驯化好的菌种与原料、纤维素酶加入到反应器中进行同步糖化与发酵； 将纤维素酶和脱毒后的木质纤维素原料加入反应器，加入营养盐，在50°C，pH4.8的条件下预酶解0-24小时；然后在30°C，pH5. O的条件下接入驯化好的皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum CXl进行同步糖化与发酵生产微生物油脂； (5)将发酵后的发酵醪液进行液固分离，同相组分进行微生物油脂提取，液相部分作为纤维素酶重新循环利用； 将步骤(4)获得的发酵醪经过固液分离，上清液全部回收使用，作为水和酶的混合物，固体则使用酸热法进行油脂提取。
2.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的木质纤维素原料为玉米秸杆、麦杆、稻杆、油菜杆、甜高粱杆、甘蔗渣、木屑、废纸、柳枝稷或者麻风树籽壳中的一种或几种的混合物。
3.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的预处理方法为稀酸预处理、机械预处理、碱法预处理、热水预处理、蒸汽爆破预处理、氨纤维膨爆预处理、生物预处理，优选稀酸预处理。
4.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的脱毒方法为水洗脱毒、过碱化处理(Overliming)、活性炭吸附、树脂吸附和生物脱毒，优选生物脱毒。
5.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的微生物油脂发酵菌种包括皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum>Rhodosporidium toruloides>Rhodotorula glutinis>Lipomycesstarkeyi、Yarrowia lipolytico,以及通过诱变、基因操作方法改造的上述菌株。
6.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的菌种驯化方法是先将冻存的菌种在合成培养基中活化，然后在不同浓度的木质纤维素酶解液中进行驯化培养，最后在100%的木质纤维素酶解液中进行菌种培养。
7.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的同步糖化发酵生产微生物油脂时，木质纤维素的固体含量为10-15% (w/w)，纤维素酶量为3. 0-15. O FPU/gDM，溶氧水平10%-40%，发酵时间为24 96小时；营养盐的添加量为硫酸铵0-5. Og/L，七水合硫酸镁O. 5g/L，磷酸二氢钾.0-0. 5g/L ；FPU (Filter Paper Unit)是指纤维素酶滤纸酶活，DM (Dry matter)是指干基木质纤维素。
8.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的利用同步糖化与发酵生产的微生物油脂包括油酸、亚麻酸、亚油酸、二十二碳六烯酸饱和与不饱和脂肪酸所组成的甘油三酯。
9.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的发酵醪的固液分离包括离心、抽滤、压滤、板框过滤方法; 所述的油脂提取方法包括酸热法、有机溶剂提取法、超声波破碎提取法方法，优选酸热法提取油脂。
10.如权利要求I所述的一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，其特征在于，所述的发酵醪上清液中回收纤维素酶包括外切酶、内切酶和糖苷酶在内的所有纤维素酶组分；循环利用发酵醪上清液进行同步糖化与发酵时，补加部分纤维素酶，或者不补加纤维素酶；发酵醪上清液循环使用1-3次。
全文摘要
本发明涉及一种木质纤维素同步糖化与发酵生产微生物油脂并回收使用纤维素酶的方法，具体步骤为，(1)木质纤维素原料的预处理；(2)预处理后物料脱毒处理；(3)对发酵菌种进行驯化；(4)将步骤(3)中获得的发酵菌种与原料、纤维素酶加入到反应器中进行同步糖化发酵；(5)将发酵后的醪液进行液固分离，固相进行微生物油脂提取，液相作为纤维素酶重新循环实施步骤(4)和(5)。本发明的优点以木质纤维素为原料采用同步糖化发酵工艺生产微生物油脂，提高了设备利用率和微生物油脂的生产效率；循环利用发酵醪中的液相组分，实现了纤维素酶的部分回收和发酵废液的循环利用，减少了酶用量和废水排放，降低了微生物油脂的生产成本。
文档编号C12P7/64GK103255185SQ20121003975
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日 公开号201210039756.8
发明者鲍杰, 刘威, 张建 申请人:华东理工大学