专利名称：一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法
技术领域：
本发明涉及寡核苷酸序列，尤其是涉及一种一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法。
背景技术：
在养殖业中，每年约有10%的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。 16SrRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SrRNA，专业技术水平要求较高，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体，由于制备技术要求较高、周期较长，使其应用也受到一定的限制。指数富集配体进化技术(SystemicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment),简称SELEX技术,是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子一适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性、发光的(并非所有菌株)海洋弧菌，菌体呈弧状， 极生单鞭毛。它广泛分布于近岸温暖的海水、海洋沉积物、海洋动物的体表，也是许多海洋脊椎动物和无脊椎动物的正常菌群。但是在某些特定条件下，如水质恶化或环境异常等条件下常会引起养殖动物发病，是近些年来才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX技术筛选哈维氏弧菌和溶藻弧菌的共同适配子，将能同时识别检测哈维氏弧菌和溶藻弧菌，从而能大大提高哈维氏弧菌和溶藻弧菌检测的效率。中国专利CN102199667A公开一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用，包括SEQIDNo. I、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。中国专利CN102329862A公开一种三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用，寡核苷酸序列包括SEQIDNo. I 3。将寡核苷酸文库与溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列；对获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。
发明内容
本发明的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法。所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No. I (该序列又可记为“C7” )、SEQ ID No. 2 (该序列可记为“C8” )、SEQ ID No. 3 (该序列可记为“C14”)和SEQ ID No.4(该序列可记为“C22”)4条寡核苷酸序列，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；所述SEQ ID No. I 为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCAC AAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID No. 2 为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAG GCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID No. 3 为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCAC AAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID No. 4 为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAA GGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'。所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法包括以下步骤I、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；2、将寡核苷酸文库分别与哈维氏弧菌、溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；3、SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；4、选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列。在步骤2中，所述SELEX筛选的具体方法为2. I弧菌菌液的制备用生理盐水将哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围1 X IO8 9X IO8个/ml，于_20°C低温保存备用；2. 2适配子的SELEX筛选，具体方法如下2. 2. I ssDNA与哈维氏弧菌的结合、分离，具体方法如下取ΙΟΟμΜ的ssDNA寡核苷酸文库4μ L，用2X结合缓冲液稀释至100 μ 1，95 °C变性5min，冰浴IOmin后加入100 μ I自然室温恢复的哈维氏弧菌菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min,弃上清,然后用IX结合缓冲液洗沉淀,弃上清；在沉淀中再加入IX结合缓冲液100 μ L,96°C加热5min,然后15000rpm离心IOmin,取上清液,对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与哈维氏弧菌有亲和力的ssDNA次级文库；所述2X结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX 结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20 X结合缓冲液配方为 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。2. 2. 2 ssDNA与溶藻弧菌的结合、分离，具体方法如下将步骤2. 2. I分离得到的能与哈维氏弧菌结合的ssDNA，再与100 μ I自然室温恢复的溶藻弧菌菌液，摇床结合30min，后续步骤同步骤2. 2. 1，则可分离到与溶藻弧菌和哈维氏弧菌都有亲和力的ssDNA次级文库。2. 2. 3不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下对步骤2. 2. 2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25 μ I 的不对称PCR扩增体系为IOXPCR 缓冲液2 μ I (可购于 Fermentas 公司)；Pl (10 μ Μ) :1 μ I (可购于上海生物工程公司)；Ρ2 (O. 2 μ Μ) : I μ I (可购于上海生物工程公司);dNTP (各 2. 5mM) :0. 4 μ I (可购于 Takara 公司);MgCl2 (25mM) : I. 2 μ I (可购于 Fermentas 公司)；ssDNA 模板(O. 2 μ g/ μ I) 2μ I ；Taq DNA 聚合酶(5u/ μ I) 0. 2 μ I (可购于 Fermentas 公司)；ddH20 17. 2μ I ；PCR反应参数94°C预变性4min，然后进行40个循环(94°C变性30s，58°C退火 30s，72。。延伸 20s)，最后 72°C延伸 7min ；2. 2. 4亲和力的测定(操作流程如图2)，具体方法如下2. 2. 4. I扩增用带有地高辛标记的引物Pl不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2. 2. 3的不对称PCR扩增体系和参数相同；2.2.4.2与菌结合取步骤2.2.4.1扩增所得的？0 产物10(^1^，951变性 5min，冰浴IOmin后加入到室温恢复的100 μ L菌液中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的 ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2 X结合缓冲液代替 PCR产物，同样进行上述操作；2. 2. 4. 3洗涤将细菌沉淀用I X结合缓冲液500 μ L洗涤I次，6000rpm离心，弃
上清，取菌沉淀；2. 2. 4. 4与酶标兔抗地高辛抗体结合在菌沉淀中加入100 μ L I 900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应IOmin,使之与菌沉淀中的地高辛标记的 ssDNA结合；所述TBS为O. 5M Tris-NaCl溶液，配制方法为先水溶8. 5 9g NaCl,再加 Tris-HCKO. 5M, ρΗ7· 6)溶液 100ml，最后加水定容至 IL ；0. 5M Tris-HCl (ρΗ7· 6，IOOml) 溶液配制方法称取Tris 6. 06g,加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7. 6，定容至IOOmlo2. 2. 4. 5洗涤6000rpm离心，去上清，再用I X结合缓冲液500 μ L洗涤3次，得
菌沉淀；2.2.4.6 TMB (四甲基联苯胺)显色加入400 μ L双蒸水重悬菌沉淀，再加入 200 μ L TMB显色液，避光显色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ L终止反应，测定450nm处的吸光值OD45tl,该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即ODg纟，空白同样进行上述步骤 2. 2. 4. 3，2. 2. 4. 4，2. 2. 4. 5和2. 2. 4. 6，得到空白相应的吸光度OD空白；所述TMB显色液的配制方法为lmg/ml TMB :底物缓冲液30%过氧化氢= 100 900 I (V/V)，现配现用，其中lmg/ml TMB是将TMB用无水乙醇配成lmg/ml ;底物缓冲液的配制称取O. 5103g柠檬酸、I. 84g Na2HPO4 ·12Η20与烧杯中，溶解后加入蒸馏水定容至IOOml02. 2. 4. 7测定PCR产物中DNA的摩尔浓度取步骤2. 2. 4. I扩增所得的PCR产物， 以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出IOOyL PCR产物中的DNA摩尔数。
— OZ)申白2. 2. 4. 8计算相应文库的亲和力亲和力=-^―-———
100μ PCi 广物中ZWJ的摩尔数2. 3重复筛选，具体方法为以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤 2. 2，直到亲和力不再上升为止，则最后一轮筛选得到的ssDNA次级文库即为筛选获得的适配子富集文库。在步骤3中，所述克隆测序的具体方法如下将步骤2筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增，扩增条件同步骤 2. 2. 3，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序，可以得到一系列具有如下结构的寡核苷酸序列或ssDNA :5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT
TC-NNNN......NNN-GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'(其中 N 为 ATCG 中四种核苷
酸中的任何一种)，选择具有这种结构的ssDNA。在步骤4中，所述“选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证， 筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列”的具体方法如下4. I高拷贝的ssDNA的选择对步骤3)获得的一系列ssDNA进行比较分析，若发现有2或2个以上的ssDNA的全部序列是完全相同的，或者说在测序结果中发现有2个以上的拷贝数的ssDNA，则进入下一步骤；若没有发现多拷贝ssDNA，则重复步骤3)，继续克隆测序，直到获得至少一个多拷贝的ssDNA，然后选择拷贝数较多且至少有2个以上拷贝数的 ssDNA进行后续操作；4. 2对步骤4. I获得的多拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，最终获得4条对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)，具体方法如下4. 2. I合成需要进行验证的ssDNA序列(由上海生工生物工程技术有限公司合成)，并在5’端标记地高辛；4. 2. 2微生物的准备
选取水产养殖环境常见的病原微生物——嗜水气单胞菌(AeiOmonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，将哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和这两种对照菌,在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，30°C下IOOrpm摇床培养8 IOh ;然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1\108 9\108个/!^，-201低温保存备用；4.2.3亲和特异性的验证4.2.3.1与菌结合取合成出的ssDNA序列IOpmol用2X结合缓冲液稀释到 100μ 1，95°C变性5min，冰浴IOmin后，分别与嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌、溶藻弧菌这4种菌液各100 μ I混合(菌数量约为3 X IO8个)，在30°C、IOOrpm摇床结合30min,然后6000rpm离心5min,分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA的空白(即用2 X结合缓冲液代替ssDNA，同样进行步骤4. 2. 3. I的操作)；4. 2. 3. 2洗涤将上述细菌沉淀用IX结合缓冲液500 μ I洗涤，6000rpm离心 5min,弃上清,取细菌沉淀；4.2.3.3与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合在空白及实验组菌沉淀中加入100 μ I I 1000TBS稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体(辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体购于北京博奥森生物技术公司，与TBS的体积比为I : 1000)，充分混合反应IOmin ；所述TBS为0. 5Μ Tris-NaCl溶液，配制方法为先水溶8. 5_9g NaCl，再加 Tris-HCKO. 5M、ρΗ7· 6)溶液 100ml,最后加水定容至 IL ；0. 5M Tris-HCl (pH7. 6，100ml) 溶液配制方法称取Tris 6. 06g,加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7. 6，定容至 IOOml。4. 2. 3. 4洗漆6000rpm离心5min,再用I X结合缓冲液500 μ I洗漆,弃上清,取
细菌沉淀；4.2.3.5显色加入400 μ I双蒸水重悬细菌沉淀，再加入200 μ I TMB显色液，避光显色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ I终止反应，测定450nm处的吸光值OD450,该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为空白同样进行上述步骤4. 2. 3. 2,4. 2. 3. 3、
4.2. 3. 4和4. 2. 3. 5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力=OD结合-OD空白；4. 2. 3. 6数据处理分析用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率P < 0. 05为显著差异，P < 0. 01为极显著的差异，统计分析后获得ssDNA对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌和溶藻弧菌等4种菌的识别效果。若ssDNA对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和力均显著高于对其它两株菌(嗜水气单胞菌、迟缓型爱德华氏菌) 的亲和力(P < 0. 05)，则这个ssDNA就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，它对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；若经过亲和特异性验证和统计分析后，没有发现能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，则重复步骤3和4，进一步进行克隆测序，从中选择新的高拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，直到获得对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著亲和特异性的ssDNA，则这个ssDNA序列就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测。
本发明所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，具有识别检测哈维氏弧菌和溶藻弧菌的功能，且采用所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列中的任意一条就能够单独应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的检测。所述四条寡核苷酸序列的5'端均标记有地高辛。所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列可用于各类样品中哈维氏弧菌及溶藻弧菌的识别检测。具体检测方法如下(I)待测菌液制备取样品，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB) 培养基中，30°C下IOOrpm摇床培养8 10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到IX 108 9X 108个/mL，_20°C低温保存备用。(2)亲和特异性检测然后用5'端标记有地高辛的上述四条寡核苷酸序列中的任意一条按说明书制备步骤4. 3. 2的亲和特异性验证方法对待测菌液进行亲和力的检测； 同时分别用哈维氏弧菌和溶藻弧菌代替待测菌液，同样按说明书制备步骤4. 3. 2的亲和特异性验证方法进行亲和力检测，得到阳性对照1、2 ;用无菌蒸馏水代替待测菌液，同样按说明书制备步骤4. 3. 2的亲和特异性验证方法进行亲和力检测，得到阴性对照；结果显示阳性对照组颜色为黄色，阴性对照组不显色；若待测样品检测结果呈现黄色，则说明样品中有哈维氏弧菌或溶藻弧菌，或两株菌均有，为阳性；若待测样品检测结果不显色，则说明样品中既没有哈维氏弧菌，也没有溶藻弧菌。本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且合成制备容易，制备周期较短。
图I为SELEX筛选流程图。图2为亲和力的测定流程图。图3为本发明实施例I中SEQ ID No. I适配子对4种菌的识别效果图。在图3中， 横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。图4为本发明SEQ ID No. 2适配子对4种菌的识别效果图。在图4中，横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。图5为本发明SEQ ID No. 3适配子对4种菌的识别效果图。在图5中，横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。图6为本发明SEQ ID No. 4适配子对4种菌的识别效果图。在图6中，横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。在图3 6中，柱形上的标记分别代表与嗜水气单胞菌组、迟钝爱德华氏菌组比较达到极显著水平(P < O. 01)。
具体实施例方式实施例I本实施例的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备步骤主要包括I、弧菌菌液的制备
用生理盐水将哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围1 X IO8 9X IO8个/ml，于_20°C低温保存备用；2、适配子的SELEX筛选2. I ssDNA与哈维氏弧菌的结合、分离取ΙΟΟμΜ的ssDNA寡核苷酸文库4 μ L，用2X结合缓冲液稀释至100 μ 1，95 °C变性5min，冰浴IOmin后加入100 μ I自然室温恢复的哈维氏弧菌菌液，摇床结合30min，再 6000rpm离心5min,弃上清,然后用IX结合缓冲液洗沉淀,弃上清；在沉淀中再加入IX结合缓冲液100 μ L,96°C加热5min,然后15000rpm离心IOmin,取上清液,对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与哈维氏弧菌有亲和力的ssDNA次级文库；所述2 X结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX 结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20X结合缓冲液配方为 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。2.2 ssDNA与溶藻弧菌的结合、分离将步骤2. 2. I分离得到的能与哈维氏弧菌结合的ssDNA，再与100 μ I自然室温恢复的溶藻弧菌菌液，摇床结合30min，后续步骤同2. 1，则可分离到与溶藻弧菌和哈维氏弧菌都有亲和力的ssDNA次级文库。2. 3 不对称 PCR 扩增 ssDNA对2. 2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增。总体积为25 μ I的不对称PCR扩增体系为IOXPCR 缓冲液2 μ I (可购于 Fermentas 公司)；Pl (10 μ Μ) : I μ I (可购于上海生物工程公司);Ρ2 (O. 2 μ Μ) : I μ I (可购于上海生物工程公司);dNTP (各 2. 5mM) :0. 4 μ I (可购于 Takara 公司);MgCl2 (25mM) : I. 2 μ I (可购于 Fermentas 公司)；ssDNA 模板(O. 2 μ g/ μ I) 2 μ I ；Taq DNA 聚合酶(5u/ μ I) 0. 2 μ I (可购于 Fermentas 公司)；双蒸水17.2μ I;PCR反应参数94°C预变性4min，然后进行40个循环(94°C变性30s，58°C退火 30s，72。。延伸 20s)，最后 72°C延伸 7min ；2. 4亲和力的测定(操作流程如图2)2. 4. I扩增用带有地高辛标记的引物Pl不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2. 3的不对称PCR扩增体系和参数相同；2. 4. 2与菌结合取步骤2. 2. 4. I扩增所得的PCR产物ΙΟΟμ L，95°C变性5min， 冰浴IOmin后加入到室温恢复的100 μ L菌液中，充分混合，在室温下结合30min,然后 6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的 ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2 X结合缓冲液代替 PCR产物，同样进行上述操作；2. 4. 3洗涤将上述细菌沉淀用I X结合缓冲液500 μ L洗涤I次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；2.4.4与酶标兔抗地高辛抗体结合在菌沉淀中加入IOOyL I 900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应IOmin,使之与菌沉淀中的地高辛标记的 ssDNA结合；TBS为O. 5M Tris-NaCl溶液，配制方法为先水溶8. 5_9g NaCl,再加 Tris-HCKO. 5M, ρΗ7· 6)溶液 100ml，最后加水定容至 IL ；0. 5M Tris-HCl (ρΗ7· 6，IOOml) 溶液配制方法称取Tris 6. 06g,加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7. 6，定容至 IOOmlo2. 4. 5洗涤6000rpm离心，去上清，再用I X结合缓冲液500 μ L洗涤3次，得菌
沉淀；2.4.6 TMB (四甲基联苯胺)显色加入400 μ L双蒸水重悬菌沉淀，再加入200 μ L TMB显色液，避光显色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ L终止反应，测定450nm处的吸光值 OD450,该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即ODg纟，空白同样进行上述步骤2. 2. 4. 3， 2. 2. 4. 4,2. 2. 4. 5和2. 2. 4. 6，得到空白相应的吸光度OD空白；TMB显色液配制方法为lmg/ml TMB 底物缓冲液30 %过氧化氢= 100 900 1(V/V)，现配现用。其中lmg/ml TMB是将TMB用无水乙醇配成lmg/ml ;底物缓冲液的配制称取O. 5103g柠檬酸、I. 84g Na2HPO4 ·12Η20与烧杯中，溶解后加入蒸馏水定容至IOOml02. 4. 7测定PCR产物中DNA的摩尔浓度取步骤2. 2. 4. I扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出IOOyL PCR产物中的DNA摩尔数。
权利要求
1.一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，其特征在于包括SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4四条寡核苷酸序列，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；所述 SEQ ID No. I 为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGA GGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述 SEQ ID No. 2 为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCAC AAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述 SEQ ID 吣.3为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACMGA GGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'；所述 SEQ ID No. 4 为5' -TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCA CAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3'。
2.如权利要求I所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3')，其中 N35 为 35 个随机寡核苷酸；2)将寡核苷酸文库分别与哈维氏弧菌、溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；3)SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；4)选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体方法为·2. I弧菌菌液的制备用生理盐水将哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围1X IO8 9X IO8个/ml，于-20°C低温保存备用；·2. 2适配子的SELEX筛选，具体方法如下·2. 2. I ssDNA与哈维氏弧菌的结合、分离，具体方法如下取IOOyM的ssDNA寡核苷酸文库4yL，用2X结合缓冲液稀释至100μ1，95 变性5min，冰浴IOmin后加入100 μ I自然室温恢复的哈维氏弧菌菌液，摇床结合30min，再 6000rpm离心5min,弃上清,然后用IX结合缓冲液洗沉淀,弃上清；在沉淀中再加入IX结合缓冲液100 μ L,96°C加热5min,然后15000rpm离心IOmin,取上清液,对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与哈维氏弧菌有亲和力的ssDNA次级文库；所述2X结合缓冲液为20X结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述IX结合缓冲液为20 X结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20 X结合缓冲液配方为IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7. 4 ；·2.2.2 ssDNA与溶藻弧菌的结合、分离，具体方法如下将步骤2. 2. I分离得到的能与哈维氏弧菌结合的ssDNA，再与100 μ I自然室温恢复的溶藻弧菌菌液，摇床结合30min，后续步骤同步骤2. 2. 1，则可分离到与溶藻弧菌和哈维氏弧菌都有亲和力的ssDNA次级文库；·2. 2. 3不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下对步骤2. 2. 2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25 μ I的不对称PCR扩增体系为·10 X PCR 缓冲液2μ I ；Ρ1,10μΜ1μ I ；Ρ2，0·2μΜ:1μ I ； dNTP，各 2. 5mM 0. 4μ I ；MgCl2,25mM 1. 2μ I ；ssDNA 模板，0.2yg/yl:2yl;Taq DNA 聚合酶，5u/ μ I :0. 2 μ I ; ddH20 17. 2μ I ；PCR反应参数94°C预变性4min，然后进行40个循环，94°C变性30s，58 °C退火30s， 72°C延伸20s，最后72°C延伸7min ；·2.2.4亲和力的测定，具体方法如下·2. 2. 4. I扩增用带有地高辛标记的引物Pl不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2. 2. 3的不对称PCR扩增体系和参数相同；·2. 2. 4. 2与菌结合取步骤2. 2. 4. I扩增所得的PCR产物100 μ L，95°C变性5min，冰浴 IOmin后加入到室温恢复的100 μ L菌液中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm 离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2 X结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作；·2.2.4.3洗涤将细菌沉淀用IX结合缓冲液500 μ L洗涤I次，6000rpm离心，弃上清， 取菌沉淀；·2.2.4.4与酶标兔抗地高辛抗体结合在菌沉淀中加入IOOyL I 900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应IOmin,使之与菌沉淀中的地高辛标记的 ssDNA结合；所述TBS为O. 5M Tris-NaCl溶液，配制方法为:先水溶8. 5 9g NaCl，再加Tris-HCl， O. 5Μ，ρΗ7· 6，溶液100ml，最后加水定容至IL ；0. 5M Tris-HCl溶液，pH7. 6，100ml，溶液配制方法称取Tris 6. 06g,加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7. 6，定容至IOOml ；·2. 2. 4. 5洗涤6000rpm离心，去上清，再用I X结合缓冲液500 μ L洗涤3次，得菌沉淀；·2.2.4.6 TMB (四甲基联苯胺)显色加入400 μ L双蒸水重悬菌沉淀，再加入200 μ L TMB显色液，避光显色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ L终止反应，测定450nm处的吸光值 OD450,该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即ODg纟，空白同样进行上述步骤2. 2. 4. 3， 2. 2. 4. 4,2. 2. 4. 5和·2. 2. 4. 6，得到空白相应的吸光度OD空白；所述TMB显色液的配制方法为按体积比，lmg/ml TMB :底物缓冲液30%过氧化氢 =100 900 1，其中lmg/ml TMB是将TMB用无水乙醇配成lmg/ml ;底物缓冲液的配制 称取O. 5103g柠檬酸、I. 84g Na2HPO4 · 12H20与烧杯中，溶解后加入蒸馏水定容至IOOml ；·2. 2. 4. 7测定PCR产物中DNA的摩尔浓度取步骤2. 2. 4. I扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出100 μ L PCR产物中的DNA摩尔数； ·2.2.4.8计算相应文库的亲和力
4.如权利要求2所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述克隆测序的具体方法如下将步骤2筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增，扩增条件同步骤2. 2. 3， 扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序，可以得到一系列具有如下结构的寡核苷酸序列或ssDNA 5 ' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC-NNNN......NNN-GCACAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'(其中 N 为 ATCG 中四种核苷酸中的任何一种)，选择具有这种结构的ssDNA。
5.如权利要求2所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述“选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列”的具体方法如下·4.1高拷贝的ssDNA的选择对步骤3)获得的一系列ssDNA进行比较分析，若发现有2 或2个以上的ssDNA的全部序列是完全相同的，或者说在测序结果中发现有2个以上的拷贝数的ssDNA，则进入下一步骤；若没有发现多拷贝ssDNA，则重复步骤3)，继续克隆测序， 直到获得至少一个多拷贝的ssDNA，然后选择拷贝数较多且至少有2个以上拷贝数的ssDNA 进行后续操作；·4. 2对步骤4. I获得的多拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，最终获得4条对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好亲和特异性的寡核苷酸序列，具体方法如下·4. 2. I合成需要进行验证的ssDNA序列，并在5’端标记地高辛；·4. 2. 2微生物的准备选取水产养殖环境常见的病原微生物-嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，将哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和这两种对照菌，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30°C下IOOrpm摇床培养8 10h ;然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释至IJ IX IO8 9X IO8个/mL, _20°C低温保存备用；·4. 2. 3亲和特异性的验证·4. 2. 3. I与菌结合取合成出的ssDNA序列IOpmol用2 X结合缓冲液稀释到100 μ 1， 95°C变性5min，冰浴IOmin后，分别与嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌、溶藻弧菌这4种菌液各100 μ I混合，菌数量为3父108个，在301、100印111摇床结合301^11，然后.6000rpm离心5min，分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA的空白，即用2 X结合缓冲液代替ssDNA，同样进行步骤4. 2. 3. I的操作；.4. 2. 3. 2洗涤将上述细菌沉淀用IX结合缓冲液50(^1洗涤，6000印111离心51^11，弃上清，取细菌沉淀；.4. 2. 3. 3与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合在空白及实验组菌沉淀中加入 100 μ I I 1000 TBS稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体，充分混合反应IOmin ;所述TBS为O. 5Μ Tris-NaCl溶液，配制方法为先水溶8. 5 9g NaCl，再加Tris-HCl 溶液100ml, O. 5Μ，ρΗ7· 6，最后加水定容至IL ；0. 5Μ Tris-HCl溶液100ml, ρΗ7· 6，溶液配制方法称取Tris 6. 06g,加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7. 6，定容至IOOml ；.4. 2. 3. 4洗涤6000rpm离心5min，再用I X结合缓冲液500 μ I洗涤，弃上清，取细菌沉淀；.4. 2. 3. 5显色加入400 μ I双蒸水重悬细菌沉淀，再加入200 μ I TMB显色液，避光显色IOmin后，以2mol/L H2SO4 200 μ I终止反应，测定450nm处的吸光值OD45tl，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为空白同样进行上述步骤4. 2. 3. 2,4. 2. 3. 3,4. 2. 3. 4 和4. 2. 3. 5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力=OD结合-OD空白；.4. 2. 3. 6数据处理分析用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率P < O. 05为显著差异，P <0.01为极显著的差异，统计分析后获得ssDNA对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌和溶藻弧菌等4种菌的识别效果；若ssDNA对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和力均显著高于对嗜水气单胞菌和迟缓型爱德华氏菌的亲和力，P<O. 05，则这个ssDNA就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，它对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；若经过亲和特异性验证和统计分析后，没有发现能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，则重复步骤3和4，进一步进行克隆测序，从中选择新的高拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，直到获得对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著亲和特异性的ssDNA，则这个ssDNA序列就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测。
全文摘要
一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法，涉及哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.1～4。合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)；将寡核苷酸文库分别与哈维氏弧菌、溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。
文档编号C12Q1/68GK102605075SQ201210079530
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者郑江, 郝聚敏 申请人:集美大学