专利名称：转基因玉米标准样品、其建立方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及转基因玉米MIR162的标准样品制备、其建立方法及其在检测转 基因玉米MIR162中的应用。
背景技术：
玉米是世界上重要的粮食作物之一，其单位面积产量位居榜首。世界范围内玉米害虫高达350多种，其中以鳞翅目的玉米螟分布最广、危害最重，是世界性的重要玉米害虫，其严重影响着玉米的产量和品质。近十多年来，转基因植物培育取得突破，推出了一批新品种，在改善农作物生产中发挥了明显的作用，也显露出巨大的潜力。然而，人们对转基因玉米的安全性存在着很多的争论。面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因玉米进行检测具有重要的现实意义。2009年，我国已经解除了对玉米进口的限制，大批量的玉米已经涌入中国。这势必对我国的农业安全带来冲击。开展转基因成分检验标准样品的研制在保证测试结果的可比性和溯源性，保障食品安全，解决贸易争端，促进经济发展等方面均具有重要的意义。在所有的商品化的转基因作物中，转基因玉米的品系最多，共有28个品系。我国尚未批准进境的转基因玉米品系有7种MIR162品系，MON 89034品系，DBT418品系，LY038品系，ES3272品系，BtlO品系，DP98140品系。2010年我国深圳等口岸已陆续截获违禁品系，MIR162品系就是其中的一种。转基因玉米MIR162是先正达种苗公司的产品，在美国被批准食用的时间为1997年，在加拿大被批准食用的时间为1997年，在澳大利亚被批准食用的时间为2002年。转基因玉米MIR162所含的外源基因有I)抗鳞翅目昆虫基因vip3Aa20，2)选择性标记基因pmi。国内很多检测机构开始大量地开展玉米中转基因成分的检测，但国内外市场却始终没有转基因MIR162品系的标准样品。
发明内容
鉴于国内转基因MIR162品系标准样品紧缺的状况，我们研制了转基因玉米MIR162品系标准样品，本项标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。转基因玉米MIR162品系简介转基因玉米MIR162所含的外源基因有1)抗鳞翅目昆虫基因vip3Aa20，2)选择性标记基因pmi。质粒图谱如图I :本发明通过以下技术路线实现本发明的一方面在于转基因玉米MIR162标准样品的制备方法，其具体步骤如下(I)将原料研磨成粉末，过100目筛，将过筛后的粉末收集，向粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置lh，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉；(2)以转基因玉米MIR162为原料，按照步骤(I)所述方法制备的冻干粉为添加原料；(3)以非转基因玉米为原料，按照步骤(I)所述方法制备的冻干粉为基质原料；(4)将步骤(2)制备的添加原料与步骤(3)制备 的基质原料按I : 100的重量比例混合，向混合粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置lh，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉并分装，0°C 4°C贮存；上述步骤(I) (4)中任一项所述的冻干，其具体步骤如下冷冻干燥程序①样品预冻先把样品在_80°C冷冻2h ；②冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35°C时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至_40°C时，将步骤①处理的样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；当真空度降至O. 5T0rr时，结束冷冻过程；③样品干燥干燥室的温度设置为15°C，当真空度降至O. ITorr时，样品已干燥好;④关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。混合粉状样品按以上冷冻干燥程序制成冻干粉，即转基因玉米粉状标准样品；分装后的样品加贴唯一性标识，放置于_20°C中避光贮存。本发明的另一方面在于公开一种转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒，包括转基因玉米MIR162检测基因和阳性标准对照品，其中，阳性标准对照品是利用上述方法制备的转基因玉米MIR162标准样品；转基因玉米MIR162检测基因，包括
系鉴y w的检测 物和探针序列:__
ι1·； _ I 物 5’-CACCTTCAGCAACCCGAACTA-3”__SEQ ID NO I
Li. 1· 彌 S^GCTTAGCCTCCACGATCATCTT-3'__SEQ ID NO: I
m\- S^-FAM- GTCCTCG丁CGCTGCCCTTCACCTTAMRA-3’__SEQ ID MO·· 3
zSSIIb坫W的检测兰I物IlIMH f列:__
Il-；! ■]引物.V-CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C'V__SEQ IDNO= 4
反 I 物 5’-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3’__SEQIDMCh 5
探针 S^FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAATGC A-TAMRA-3* SEQ ID NO 6其中FAM为6-carboxyfluorescein, TAMRA为 6_carboxytetramethylrhodamine。本发明中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。试剂盒的使用方法是以待测样品的基因组为模板，利用转基因玉米MIR162检测基因，经过Real-Time PCR反 应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量。或者通过PCR特异性的引物和探针序列，扩增待测样品与阳性标准对照品，并将扩增的结果进行比对，确认样品中是否含有转基因玉米MIR162品种，具体制作和检测方法参照实施例。上文所描述的使用方法，是本领域技术人员常用的方式，以此为例，本领域技术人员可以通过结合现有技术的公知常识进行更多拓展。本发明的创新特征是本项标准样品的制备完成及其制备方法的建立，对解决转基因MIR162品系检测分子标准样品的制备技术和稳定性保证技术，开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义及应用价值。
图I :转基因玉米MIR162的质粒图谱；所含的外源基因有1)抗鳞翅目昆虫基因vip3Aa20, 2)选择性标记基因pmi。
图2 :转基因玉米MIR162标准样品制备、检测工艺流程。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。制备转基因玉米MIR162品系标准样品的原料购于AOCS ；研钵，100目标准筛，DNA提取试剂和PCR反应试剂均购于宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司(货号D9093)；TaqMan Universal Master Mix :购于 ABI 公司；引物和探针宝生物工程(大连)有限公司合成；实时荧光定量PCR仪ABI 7500型；核酸蛋白分析仪日本日立公司。实施例I转基因玉米粉状标准样品的制备步骤(a)取原料放在研钵中，用研棒搅拌、研磨成粉末。将粉末过100目标准筛。将过筛后的粉末收集于磨口瓶中，密封，备用。(b)将粉末加约一倍的水，使用搅拌机搅拌30min使其均匀后，静置lh，弃上清，将浆糊放置于中试冻干机内，按如下冻干程序，去除水分，制备成冻干粉。(c)转基因玉米MIR162冻干粉作为添加原料；非转基因玉米冻干粉作为基质原料。两种原料制备程序和冻干程序完全相同，但分别独立、隔离制备完成。(d)在恒温恒湿、无菌操作间中，称取5. Og转基因玉米MIR162粉添加原料和495. Og非转基因玉米粉基质原料，按1%的添加比例混合，将混合粉末加约一倍的水，使用搅拌机搅拌30min，混匀上述混合样品，均匀后，静置lh，弃上清；(e)将混合浆糊样品放置于中试冻干机中，按照冻干程序，进行低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉；(f)将混合冻干粉样品分装于经160°C干热处理2h的洁净的7mL棕色玻璃瓶中封盖密封，每瓶内装混合冻干粉样品lg。(g)获500瓶I. 0%添加含量的转基因玉米粉MIR162标准样品。瓶装后的样品加贴唯一性标识，放置于阴凉干燥处0°c 4°C贮存。其中，步骤(a) (h)中所述的冻干程序，其具体步骤如下 (I)样品预冻先把混合粉状样品溶液在_80°C低温冷冻2h。(2)冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至_35°C时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至_40°C时，将预冻的标准品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空，真空表显示值开始下降；待真空度降至O. 5Torr时，结束冷冻过程。(3)样品干燥对干燥室加热，提高样品干燥速度；干燥室的温度设置为15°C。当真空度降至O. ITorr或更低时,表示样品已干燥好。(4)关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。混合粉状样品按以上冷冻干燥程序制成冻干粉，即转基因玉米MIR162粉状标准样品；分装后的样品加贴唯一性标识，放置于_20°C中避光贮存。实施例2定值方法采用实时荧光定量PCR法《转基因成分检测玉米检测方法》SN/T 1196-2011和GB/T19495. 5-2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》进行测定转基因玉米MIR162品系和定值。检测转基因玉米MIR162品系特异性及玉米内源zSSIIb基因的引物序列和探针序列见下表I。表I检测转基因玉米MIR162品系特异性基因的引物序列和探针序列
权利要求
1.一种转基因玉米MIR162标准样品，其特征在于，制备方法包括 (1)将原料研磨成粉末，过100目筛，将过筛后的粉末收集，向粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置lh，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉； (2)以转基因玉米MIR162为原料，按照步骤(I)所述方法制备冻干粉； (3)以非转基因玉米为原料，按照步骤(I)所述方法制备冻干粉； (4)将步骤(2)制备的冻干粉与步骤(3)制备的冻干粉按I: 100的重量比例混合，向混合粉末中加入等质量的水，搅拌均匀后，静置lh，弃上清，将沉淀物制备成冻干粉并分装，(TC 4°C贮存； 上述步骤(I) (4)中任一项所述的冻干粉，其具体制备步骤包括 ①样品预冻先把样品在_80°C冷冻2h； ②冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至_35°C时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至_40°C时，将步骤①处理的样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；当真空度降至O. 5Torr时，结束冷冻过程； ③样品干燥干燥室的温度设置为15°C，当真空度降至O.ITorr时，样品已干燥好； ④关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。
2.—种转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒，其特征在于，包括转基因玉米MIR162检测基因和阳性标准对照品 阳性标准对照品是权利要求2所述的转基因玉米MIR162标准样品； 转基因玉米MIR162检测基因，包括 品系鉴定基因的检测引物和探针序列 正向引物SEQIDN0:1 反向引物SEQ ID NO :2 探针SEQ ID NO 3 zSSIIb基因的检测引物和探针序列 正向引物SEQ ID NO :4 反向引物SEQ ID NO :5 探针SEQ ID NO :6。
全文摘要
本发明公开一种转基因玉米MIR162的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因玉米MIR162中的应用，分别以转基因玉米MIR162或非转基因玉米为原料，将原料研磨、过筛、加水，搅拌、静置、将沉淀物制备成冻干粉；再将二者以科学的比例混合，并重复“加水，搅拌、静置、将沉淀物制备成冻干粉”的过程，分装,0℃~4℃贮存；通过上述方法获得转基因玉米MIR162的标准样品，也可以应用于转基因玉米MIR162的Real-Time PCR检测试剂盒。这对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
文档编号C12Q1/68GK102719534SQ20121017212
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者于兵, 徐君怡, 曹际娟, 赵昕 申请人:于兵, 徐君怡, 曹际娟, 赵昕