专利名称：一种脊尾白虾微卫星标记的3重pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及脊尾白虾微卫星标记的PCR检测方法，具体涉及一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法。
背景技术：
微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simplesequence repeats, SSR)是指由I 6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都
发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。多重PCR(MultiplexPCR)是在同一个反应中同时扩增两个或多个位点的聚合链式反应。它具有提高效率，避免样品浪费，快速周转时间，并可大大节约实验成本的优点。微卫星多重PCR技术在水产动物中已有广泛应用，主要进行亲子鉴定和遗传多样性分析，Patricia Novel 等已在狼S卢(Dicentrarchus labrax)、L.ei_ceteau-IC0hler等在褐蹲(Salmo trutta)、Javier Porta 等在塞内加尔鳎(Solea senegalensis)、Yan Wang等在牡虫厉(Crassostrea virginica Gmelin)、GAO Huan 等在中国对虫下(Fenneropenaeuschinensis)、Yutao Li等在斑节对奸(Penaeus monodon)和任宪云等在三抚梭子蟹(Portunus trituberculatus)中有相关报道。随着脊尾白虾人工养殖业的迅速发展，其基础研究工作近年来逐渐开展起来，截止到目前为止，脊尾白虾还未见有微卫星多重PCR体系建立等方面的技术。
发明内容
针对现有技术中脊尾白虾基础研究工作缺失，给家系建立过程中遗传参数的评估带来困难等缺点，本发明提供了一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，本发明在大量微卫星分子标记的基础上构建了 3重PCR检测体系，大大缩短实验时间，提高了实验效率，所得结果可同时反映出脊尾白虾在多个微卫星位点的遗传变异。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，它包括(I)设计并合成3重PCR引物；⑵提取基因组DNA ; (3) 3重PCR反应；(4)检测PCR产物；其特征在于所述3重PCR反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序，所述3重PCR反应体系的引物为EC7、EC54和EC709的组合，所述各引物序列如下EC007 F:AATATGCAGTGGCAAGCT ；R: TTCCCATCATCTTCCTCC ；EC054 F:CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC ；R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT ；
EC709 F:GGCTGTCCCTTGGAACTA ；R:ACGAAATCCGAATAACCC 进一步的，所述3 重 PCR 反应体系为10XBuffer 2. O μ L ；25mmol/LMgCl2L 2μ L ；10mmol/L dNTP I. 5μ L ;所述 5mmol/L 引物 EC007:F: I. 5 μ L+R: I. 5 μ L、EC054:F:05y L+R:0. 5μ L、EC709 F: I. 5 μ L+R: I. 5 μ L ；50ng/y L 脊尾白虾基因组 DNA2· 0 μ L ;5U/ μ LTaq 聚合酶 O. 2 μ L ；ddH20 补充至 20 μ L。再进一步的，所述PCR反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸45s，共进行25次循环；最后72°C延伸5min ;4°C保存并结束反应。
其中，本发明采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是I、微卫星标记由于其多态性丰富、易于检测、呈孟德尔共显性遗传等优点，是进行系谱分析和群体遗传多样性研究的一种比较理想的工具，但常规PCR扩增在一个脊尾白虾检测中只能获得f 2个点位基因。本发明所述检测方法是在多个多态性微卫星标记的基础上进行标记间组合、搭配以及实验方法优化，获得更简便、快捷的PCR检测方法，大大缩短了实验时间，它与常规的PCR方法相比效率提高了 3倍左右，且所得结果可同时反映出脊尾白虾在多个微卫星位点的遗传变异。2、本发明可以在脊尾白虾群体遗传多样性分析、亲子鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
λ·Μ
/E. ο
图I是本发明的微卫星标记3重PCR检测方法对脊尾白虾8个个体的检测图谱，1-8 是 8 个脊尾白虾个体，M 为 MD206-pBR322DNA/MspI DNA 分子 Marker。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例I本发明提供的脊尾白虾微卫星标记的3重PCR构建方法如下I、以本发明提供的脊尾白虾微卫星富集文库中的微卫星核心序列为基础，使用Primer Premier 6. O软件在其微卫星核心序列的两端设计相应的PCR引物,获得一系列具有PCR扩增产物大小不等的SSR标记。2、利用Primer Premier 6· O软件进行引物间的评价,对显示大部分的AG (能量变化的Gibbs)值在-4以上的引物选出备用，AG (能量变化的Gibbs)值在-4以上主要说明多重PCR体系中单对引物之间不易形成引物二聚体以及具有低发夹结构，以免影响PCR反应效率。通过对多对微卫星标记引物间的搭配、组合，对其进行多重PCR体系的构建及测试，并对PCR实验的反应条件和加样参数进行优化，从而建立了本发明所述的I组3重微卫星PCR检测方法。本发明的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法具体步骤如下
(I)、本发明所选用的3种引物序列如下
权利要求
1.一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，它包括(1)设计并合成3重PCR引物；(2)提取基因组DNA ; (3) 3重PCR反应；(4)检测PCR产物；其特征在于所述3重PCR反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序，所述3重PCR反应体系的引物为EC007、EC054和EC709的组合，所述各引物序列如下EC007 F: AATATGCAGTGGCAAGCT ； R:TTCCCATCATCTTCCTCC ；EC054 F: CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC ； R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT ；EC709 F: GGCTGTCCCTTGGAACTA ；R:ACGAAATCCGAATAACCC。
2.根据权利要求I所述的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于所述 3 重 PCR 反应体系为10 XBuffer 2. O μ L ;25mmol/L MgCl2 I. 2 μ L ; 10mmol/L dNTPI.5μ L ;所述 5mmol/L 引物 EC007: F: I. 5 μ L + R: I. 5 μ L、EC054: F: 05 μ L + R: O. 5 μ L、EC709 F: I. 5μ L + R: I. 5 μ L ;50ng/μ L 脊尾白虾基因组 DNA 2. O μ L ；5U/y L Taq 聚合酶 O. 2 μ L ；ddH20 补充至 20 μ L。
3.根据权利要求I所述的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应程序为95 °C预变性5min ;95°C变性45 s，56°C退火45 s，72°C延伸45 s，共进行25次循环；最后72°C延伸5min ;4°C保存并结束反应。
4.根据权利要求I所述的一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，其特征在于采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。
全文摘要
本发明提供了一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法，它包括设计并合成3重PCR引物；提取基因组DNA；3重PCR反应；检测PCR产物；PCR反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序。本发明建立了进行脊尾白虾家系和亲子鉴定的3重PCR反应体系，实现了在一个PCR反应中同时检测3个微卫星位点，因此与原有的PCR方法相比效率提高了3倍。本发明具有高效、经济、简便易行等特点，可以在脊尾白虾遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102676689SQ20121019058
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者刘萍, 李健, 贾舒雯 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所