合成双功能复合物的方法

专利名称：合成双功能复合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于得到包含展示分子部分和编码部分的双功能复合物的方法。本发明还涉及一种用于生成双功能复合物库的方法，一种用于鉴定具有预选性能的展示分子的方法。
背景技术：
已经开发出能够对多肽和其它生化聚合物进行合成编码的方法。该方法的一个例子公开于US 5，723，598，其中涉及双功能分子库的生成。双功能复合物的一个部分是多肽且另一部分是包含用于编码和鉴别已参与形成多肽的氨基酸的核苷酸序列的标识符寡核苷酸。在生成双功能分子的库之后，在对靶亲和性方面进行分配且双功能分子的标识符寡核苷酸部分利用PCR进行扩增。最终，PCR扩增子被测序和解码用于鉴别具有靶亲和性的多肽。双功能复合物库通过一种通常称作分开-和-混合的方法而制成。该方法意味着接头分子被分开至空间分离的隔室中并在每个隔室中在一端与特定氨基酸前体反应并在另一端通过正交化学反应添加编码该特定氨基酸前体的核酸标签。随后，收集(混合)各隔室的内容物并随后再次分开至数个隔室，用于新一轮的与氨基酸前体和核苷酸标签的交替反应。继续该分开-和-混合法直至多肽达到所需长度。该已有技术方法在其应用中受到局限，因为用于加入化学单元或用于加入核苷酸或寡核苷酸序列的两种交替合成步骤之间必须存在相容的化学。根据已有技术，合成相容性问题通过在合成交替聚合物时正确选择相容的保护基团，和通过正确选择用于在一种生长中的聚合物保持被封闭的同时选择性地去保护另一生长中的聚合物的方法而解决。Halpin和Harbury在WO 00/23458中建议了另一方案，其中所形成的分子不仅被核酸标签鉴别而且被它指导。该方案也基于分开-和-混合技术，其中使用两个或多个合成步骤得到组合库。使用多个核酸模板，其中每个在一端具有化学反应部位点和在整个链中分散多个密码子区域，每个所述密码子区域又规定不同的密码子。模板通过密码子杂交至固定化探针上而分离和随后每个链在化学反应部位与特定选择的试剂反应。随后，所有的链被集中并基于第二密码子区域进行第二分配。该分开-和-混合法进行合适的次数以得到通常IO3至IO6种不同的化合物的库。该方法的缺点在于必须提供大量的核酸模板。如果需要IO6种不同化合物的最终库，必须合成总共IO6个核酸模板。这种合成一般麻烦或昂贵，因为核酸模板必须具有相当的长度以确保密码子区域和探针之间足够的杂交。
在WO 02/074929中，公开了一种用于合成化合物的方法。这些化合物通过起始将包含反密码子和反应性单元的转移单元与具有与其相连的反应性单元的模板在允许反密码子杂交至模板上的条件下接触和随后使反应性单元反应而合成。另外，该方法的缺点在于，必须起始提供大量的核酸模板。使用模板的已有技术方法的缺点在于，编码取决于反密码子和模板之间的鉴别。两种寡核苷酸之间的杂交可在两者之间存在足够互补性时发生。有时，杂交甚至在寡核苷酸之间不存在完全匹配的情况下发生。其后果是，如果存在多个转移单元，那么有时模板的密码子序列不对应于实际反应的反应性单元。该不希望的后果在希望形成库时甚至更加明显，因为多个模板和构件被估计在反应介质中相互寻找。如果杂交步骤不完全适当，会产生被在模板上的不正确密码子编码的分子。这对针对该库进行的选择方法产生两种主要作用。首先，具有编码结合配体的密码子组合的模板会在选择过程中损失。第二，而且更重要的是，具有编码非结合性配体的密码子组合的模板将被富集。本发明的一个方面的目的是提供一种用于得到被编码分子的非模板依赖性方法，所述方法使得多种化学能够被应用于被编码分子的形成，因为可避免相容的正交保护基团在被编码分子和寡核苷酸标签的交替形成中的应用。本发明在一个优选方面意欲改进以前 在密码子鉴别过程中显示的易错杂交方法。另外，本发明的目的是减少所形成的非特异性反应产物。因此，在本发明的一个方面，本方法具有固有校正性质以确保表现型被基因型准确地编码。

发明内容
本发明涉及一种用于得到包含展示分子(display molecule)部分和编码部分的双功能复合物的方法，其中包含化学反应部位和用于酶加入标签(tag)的引发部位(priming site)的新生双功能复合物在化学反应部位与一种或多种反应物反应,并且在引发部位上使用一种或多种酶给该复合物提供标识反应物的各自的标签。酶一般是底物特异性的，因此标签至引发部位上的酶加入不可能干扰正在形成的展示分子。因此，保护基团在编码部分以及新生展示分子上的应用因此可被避免。但可因为其它原因需要保护正生长中的展示分子。可得到在含水和有机介质中具有活性的酶。但大多数酶在水介质中具有高于在有机介质中的活性。因此，在提供标签之前或之后，可能需要改变介质以得到可用于反应物在化学反应部位上反应的条件。一般，展示分子部分通过一种或多种反应物和化学反应部位之间一轮以上的反应而形成。在本发明的某些方面，与一种或多种反应物反应和提供有各自的标签的新生双功能复合物进一步一次或多次与一种或多种反应物反应和向其提供各自的标识标签，得到作为双功能复合物的一部分的反应产物和包含标签的标识部分，所述标识部分编码已参与形成反应产物的反应物的身份(identity)。在本发明的某些方面，反应的轮或周期是指，单个反应物与化学反应部位反应且用于标识反应物的各自的标签被提供在用于酶加入的引发部位上。在本发明的另一方面，一轮反应意味着多个反应物在化学反应部位上反应且用于标识一种或多个，但不必所有的，反应物的标签被提供在用于酶加入的引发部位上。在化学反应部位上的反应和标签的加入可按照任何顺序发生，即反应可在标签加入之后，同时，或之前发生。对顺序的选择可取决于酶种类，反应条件，和反应物种类，以及其它。新生双功能复合物包含化学反应部位和用于标签的酶加入的引发部位。任选地，新生双功能复合物还包含连接部分(linking moiety),它连接化学反应部位与引发部位。连接部分可用于各种目的，如使引发部位与化学反应部位彼此相距足够远以允许酶进行标签加入和提供杂交区域。在本发明的一个方面，连接部分是核酸序列。寡核苷酸的长度优选适用于与互补性寡核苷酸杂交，即连接部分中的核苷酸的数目合适地是8或以上。在某些实施方案中，连接部分通过间隔基连接到化学反应部位上，间隔基包含可选择性地断裂的接头以使展示分子能够在形成最终双功能复合物之后的步骤中脱离编码部分。新生双功能复合物也被称作生长中的复合物和表示待根据本发明方法处理的起始或中间复合物。中间复合物表示已进行一轮或多轮反应物反应和标签加入的起始复合物。化学反应部位可包含单个或多个能够与一种或多种反应物反应的反应基团。在某些方面，化学反应部位包含连接有一个或多个反应基团的支架(scaffold)。合适的反应基团的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，醛，和羟基基团。支架的例子包括苯并二氮杂笨类，甾族’乙内酰脲类(hydantiones)，哌嗪类，二酮哌嗪类，吗啉类,托烷类,香豆素类,喹啉类,吲哚类，呋喃类，吡咯类，藝唑类，氨基酸前体，和噻唑类。另外，化学反应部位的反应基团可以是在可与反应物进行反应之前必须被活化的前形(pro-form)。例如，反应基团可用合适的基团保护，后者需要在可与反应物进行反应之前被去除。本说明书或权利要求中的展示分子表示已与一种或多种反应物反应的化学反应部位。本发明的反应物包括游离反应物以及包含功能实体(funcitional entity)和核酸序列的反应物。游离反应物参与与化学反应部位的反应和可得到最终展示分子的化学结构。连接到核酸上的功能实体在本文中可被称作构件(building block)和表示功能实体能够在化学反应部位上反应的化学实体。在本发明的某些方面，功能实体从核酸部分上分开和转移至化学反应部位。构件的寡核苷酸可具有或不具有关于功能实体身份的信息。在本发明的某些实施方案中，反应物是包含与连接部分足够互补从而能够杂交的寡核苷酸，可转移的功能实体，和用于标识该功能实体的反密码子的构件。游离反应物一般不连接到核酸上，除非在最终展示分子中需要核酸组分。游离反应物可具有任何化学结构和优选包含反应基团或其前体，它们能够与化学反应部位反应。反应基团的例子包括羟基基团，羧酸基团，硫醇，异氰酸酯，胺，酯，和硫酯。任选地，可存在其它的反应物介导游离反应物和化学反应部位之间的连接。构件的功能实体就与化学反应部位反应的要求而言类似游离反应物。但是，另外，在大多数情况下需要在该反应之后断开功能实体和核酸之间的连接。任选地，反应和断裂可在单个步骤中发生。以下详细公开各类构件。在本发明的某些方面，游离反应物或功能实体不包括核苷酸。新生双功能复合物的编码部分通过使用一种或多种酶向引发部位加入至少一个标签而形成。进一步的标签可连接到以前的标签上以得到直链或支链标识符(identifier)。只要标识符的至少一个标签通过酶催化反应而连接,进一步的标签可使用化学方式或酶方式根据试验者的意愿而提供。在本发明的某些实施方案中，所有的标签使用酶催化反应而提供。标签合适地包含识别单元，即可被识别基团识别的单元。识别单元具有携带信息以标识反应物的能力。实际上存在各种不同种类的识别。例子是识别表位的抗体，识别另一蛋白质的蛋白质，识别蛋白质的mRNA，和识别互补性寡核苷酸序列的寡核苷酸。一般优选的是，标签是核苷酸序列。双功能复合物的编码部分在本发明的优选方面是可扩增的。被扩增的能力使得能够在选择过程中使用低量的双功能复合物。如果标签是蛋白质，该蛋白质可通过连接已编码其合成的mRNA，由mRNA生成cDNA和使所述mRNA经受翻译体系而扩增。这些体系公开于WO 98/31700，其内容在此通过参考并入本发明。用于扩增蛋白质标签的另一方法是使用噬菌体展示的蛋白质。但一般来说，标签是可使用标准技术如PCR扩增的核苷酸序列。如果两个或多个标签存在于线性标识性寡核苷酸中，所述寡核苷酸一般由某一种类的主链结构组成，以允许酶识别该寡核苷酸作为底物。例如，主链结构可以是DNA或RNA。新生双功能复合物的引发部位能够接受标签。引发部位的化学身份取决于所用的标签和特定酶的种类以及其它。如果标签是多核苷酸，引发部位一般包含接受性核苷酸的3’ -OH或5’ -磷酸基团，或这些基团的功能衍生物。可用于将标签酶促加入引发部位上的酶包括选自聚合酶，连接酶，和重组酶，和这些酶的组合的酶。
化学反应部位和一种或多种反应物之间的反应可在有利于该反应的合适的条件下进行。在本发明的一些方面，该反应在杂交条件下进行，即在反应条件下保持两种互补性寡核苷酸之间的退火。在本发明的其它方面，该反应在变性条件下进行以使条件合适反应发生。如果生长中的复合物的编码部分包含寡核苷酸；所述寡核苷酸在本发明的一个方面在反应过程中是双链形式以减少寡核苷酸的组分和反应物之间副反应的可能性。用于标识反应物的标签可使用任何合适的酶而加至引发部位。在某些实施方案中，标签采用酶延伸反应被提供在新生双功能复合物的引发部位。延伸反应可通过聚合酶或连接酶或其组合而进行。使用聚合酶的延伸作用合适地使用反标签寡核苷酸(anti-tagoligonucleotide)作为模板而进行。反标签寡核苷酸在新生双功能复合物的寡核苷酸部分的3’端退火，并有一个包含能够标识反应物的反密码子的单链突出端。反标签的反密码子可使用聚合酶和dNTPs混合物被转录至标识符部分上。或者，连接酶用于使用一种或多种寡核苷酸作为底物而加入标签。连接可根据所用的酶在单链或双链态下进行。一般来说优选在双链态下连接，即所要连接在一起的寡核苷酸通过一种能够互补这两个寡核苷酸的末端的互补性寡核苷酸而保持在一起。合适的酶的例子包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，反转录酶，DNA连接酶，RNA连接酶，Taq DNA聚合酶，Pfu聚合酶，Vent聚合酶，IV-I反转录酶，Klenow片段,或任何能够催化互补性元件如单_，二-或多核苷酸的引入的其它酶。也可使用允许错配延伸的其它种类的聚合酶，例如 DNA 聚合酶 n (Washington 等人，(2001) JBC276 :2263-2266)，DNA 聚合酶I (Vaisman等人，(2001)JBC276 :30615-30622)，或允许延伸错配退火碱基对的任何其它酶。另一方面，如果使用连接酶，合适的例子包括Taq DNA连接酶，T4DNA连接酶，T4 RNA连接酶，T7 DNA连接酶，和大肠杆菌(E. coli)DNA连接酶。对连接酶的选择在一定程度上取决于所要连接在一起的末端的设计。因此，如果末端是平端，T4 RNA连接酶可以是优选的，而对于粘性末端连接，即其中每端上的突出端是相互互补的连接，Taq DNA连接酶可以是优选的。加至新生双功能复合物的引发部位上的标签具有有关反应物的信息。在本发明中以及权利要求书中，涉及反应物的信息被称作密码子。除了编码反应物身份的核苷酸的组合，标签可包含其它核苷酸。在本发明的某些方面，标签包含构架序列(framingsequence)。构架序列可用于各种目的，如用于反标签的退火区域和/或用作提供相关反应物已反应的合成历史的时间点信息的序列。密码子和反应物的身份之间的相关可根据所需输出而变化。在某些实施方案中，密码子用于编码几种不同的反应物。在随后的鉴定步骤中，展示分子的结构可根据对不同的连接化学，位阻，正交保护基团(orthogonal protection groups)的去保护,等的知识而推断。在另一实施方案中，同一密码子用于具有共性，如亲油性质，分子量，某些连接化学，等的一组反应物。但在一个优选实施方案中，密码子是独特的，即核苷酸的类似组合不标识另一反应物。在实际方案中，对于特定反应物，仅使用核苷酸的单个组合。在本发明的一些方面，可针对相同的反应物有利地使用几种不同的密码子。两种或多种标识相同反应物的密码子可携带有关不同的反应条件的其它信息。在本发明的另一方面，单个密码子指定两种或多种反应物。在本发明的一个方面，每种双功能复合物通过同时或顺序标记和反应物反应而制成，如以下方案所说明 χ-Χ — ax-XA — Iax-XAl大写字母表示反应物或化学反应部位。小写字母表示标签。支架“X”连接至标签“X”上。反应物连接至“X”上，如“A”，并连接针对该片段的标签，如“a”。合适地，标签是独特的。最终形成的双功能复合物的编码部分包含所有的密码子。每个密码子的序列用于破译已参与形成展示分子，即反应产物的反应物的结构。密码子的顺序也可用于确定反应物的引入顺序。这在形成线性聚合物时可具有特殊的意义，因为聚合物的准确序列可通过解码该编码序列而确定。通常，为了有助于解码步骤，恒定或结合区域与密码子一起被转移至双功能复合物上。该恒定区域可包含有关所相关的反应物在展示分子的合成路径中的位置的信息。本发明还涉及一种用于鉴定具有预选性能的展示分子的方法，包括步骤将根据上述方法制成的库经受一种条件，其中具有预定性能的展示分子或展示分子的子集与该库的剩余部分分开，和通过解码复合物的编码部分而鉴定具有预选功能的展示分子。一般称作选择的以上方法包括，将库经受一种条件以选择具有对该条件起反应的性能的展示分子。该条件可包括该库暴露于靶。具有对该靶的亲和性的双功能复合物可通过去除非结合复合物和随后在更严格的条件下洗脱已结合到靶上的复合物而与该库的剩余部分分开。或者，双功能复合物的编码部分可在去除非结合复合物之后从展示分子上切离并可将编码部分回收和解码以鉴定展示分子。可针对特定靶进行单轮或几轮选择，随后扩增所选的变型。所得的这些变型随后在合适的分析中分开测试。选择条件可以是严格的和特异的以在一轮选择中得到结合分子。可有利地使用单轮选择进行该方法，因为可能的结合物的数目或多样性与其中可能损失潜在结合物的使用更多选择的方法相比而言较大。在另一实施方案中，选择程序包括使用日益严格的条件进行几轮选择。在每次选择之间，可有益地扩增所选的复合物。编码部分可通过使用产生两个独特的切割位点的引物进行PCR扩增。这些切割位点可通过克隆到适用于测序的载体中而用于编码区域的多聚化。该方案能够对许多编码区域同时测序。或者，PCR产物使用例如TA克隆而被直接克隆到合适的载体中。在另一方案中，展示分子的身份通过将PCR产物应用于合适的微阵列而确立。本领域熟练技术人员完全能够构建寡核苷酸的所需设计。如果需要特定退火温度，那么建议合适的核酸单体的组成和其长度是标准步骤。合适设计的构建可通过软件，如Vector NTI Suite 或因特网地址 http://www. nwfsc. noaa. gov/protocols/oligoTMcalc.html上的公众数据库而辅助。两种寡核苷酸能够杂交的条件受许多因素的影响，包括温度，盐浓度，缓冲剂的种类，和酸度。本领域熟练技术人员完全能够选择合适的条件以确保两种寡核苷酸之间的接触在杂交条件下进行。两种单链寡核苷酸形成双螺旋时的温度被称作退火温度或融解温度。融解曲线通常是不尖锐的，表明退火在一温度范围内发生。本发明可按照两种基本模式进行。第一模式使用这样的反应物，其中密码子或反密码子共价连接至其所要标识的功能实体上。第二模式使用不共价连接到密码子或反密码子上的反应物。标签通过与反应物分开的实体被提供在双功能复合物的引发部位上。如果进行一轮以上，第一和第二模式可按照任何顺序结合。如果要生成不同的双功能复合物的 库，那么两种模式按照两种不同的方案进行。使用第一模式制成的库可在单个容器中进行，这在本文中称作一罐合成，而根据第二模式制成的库需要分开-和-混合合成，即针对每种复合物反应和标签加入必须在不同的隔室中进行。在本发明的某些实施方案中，在涉及两种或多种反应物和化学反应部位的反应之前或之后，提供一种或多种分别编码该两种或多种反应物的标签。模式I :本发明在第一模式中涉及一种用于编码被转移至双功能复合物上的化学实体的身份的方法，所述方法包括步骤a)提供包含反应基团和寡核苷酸标识符区域的新生双功能复合物，b)提供包含对标识符区域足够互补从而允许杂交的寡核苷酸，可转移的功能实体，和标识该功能实体的反密码子的构件，c)将新生双功能复合物和构件在杂交条件下混合形成杂交产物，d)通过涉及新生双功能复合物的反应基团的反应将构件的功能实体转移至新生双功能复合物上，和e)酶促延伸该寡核苷酸标识符区域，以得到连接到已接收该化学实体的双功能复合物上的密码子。本发明方法包括为被转移至复合物上的功能实体引入密码子。密码子的引入通过使用合适的酶，即对核酸有活性的酶在构件的反密码子上延伸而进行。编码区域的转录可通过酶，如聚合酶或连接酶而进行。一般来说优选使用对底物和最终产物特异性的酶，这样尽可能精确地转录反密码子。高度的特异性一般为核酸活性酶可得到，因为非特异活性可破坏活细胞存活的能力。根据本发明特别优选的酶是具有校正活性以用于精确编码但保存上游核酸碱基的聚合酶。酶延伸可在功能实体转移之后或同时或甚至在转移之前进行。但一般优选在转移步骤之后进行延伸步骤，这样避免酶和功能实体之间的任何可能相互作用。因为酶仅当标识符区域和互补性标识符区域已相互杂交形成双螺旋时进行延伸，所以确保功能实体和反应基团在给该复合物提供密码子时紧密靠近。与以前所建议的杂交方法相比，本发明的优点在于，通过非定向反应而提供功能实体的复合物不会被提供以密码子。因此，假阳性分子可由于不存在密码子而容易被检测。本发明还涉及一种用于得到由展示分子部分和编码部分组成的双功能复合物的方法，其中用于编码被转移至双功能复合物上的化学实体的身份的方法进一步包括步骤f)分开杂交产物的组成部分和回收该复合物。本发明可通过仅将单个功能实体和相应的密码子转移至新生双功能复合物上而进行。但一般来说，优选构建由两个或多个功能实体组成的展示分子。因此，在本发明优选方面，提供了一种用于得到由展示分子部分和编码部分组成的双功能复合物的方法，所述展示分子部分是功能实体和起始复合物的反应基团的反应产物，其中步骤c)至f)适当地重复。在制备双功能复合物的最终周期中，步骤f)可省去，尤其是在其中得到双链标识符寡核苷酸的情况下，因为双链核酸通常比相应的单链寡核苷酸更稳定。标识符寡核苷酸也可通过延伸过程而变成双链，其中引物被退火至该寡核苷酸的3’端和使用合适的聚合酶延伸。双链性在随后选择过程中可能是一个优点，因为单链核酸可按照一种类似于aptamers的方式进行与生物学靶的相互作用。在周期的重复过程中，以前周期中的所得双功能复合 物，即已接收功能实体和密码子的新生双功能复合物，在功能实体转移和密码子引入的下一周期中用作新生双功能复合物。根据本方法使用的寡核苷酸具有合理的长度。因此，一般避免在已有技术(在WO00/23458中，建议使用至少220和优选420个核苷酸的寡核苷酸)中建议的长预制模板。本发明还涉及一种用于产生双功能复合物库的方法，包括步骤a)提供一种或多种不同的包含反应基团和寡核苷酸标识符区域的新生双功能复合物，b)提供每个构件包含与标识符区域足够互补从而允许杂交的寡核苷酸，可转移的功能实体，和标识该功能实体的反密码子的多个不同的构件，c)将新生双功能复合物和多个构件在杂交条件下混合以形成杂交产物，d)通过涉及新生双功能复合物的反应基团的反应将构件的功能实体转移至新生双功能复合物上，e)酶促延伸该寡核苷酸标识符区域，以得到连接到已接收该化学实体的双功能复合物上的密码子，f)分开杂交产物的组分和回收复合物，g)适当地重复步骤c)至f) 一次或多次。与已有技术中所建议的杂交技术有关的缺点在考虑形成库时变得明显。即使两种双链寡核苷酸具有相同数目的核苷酸，也决不能确保它们具有相同的融解温度。这至少部分由于，不同的碱基对涉及不同数目的氢键(C-G对涉及三个氢键和A-T碱基对涉及两个氢键)。因此，确立用于将各种构件退火至模板的温度要兼顾避免错配和确保足够的退火。本发明意欲通过在本发明一个优选的实施方案中提供对所有构件具有类似亲和性的标识符区域而避免该缺点。如果使用一个以上的标识符序列，如在存在一种以上的反应基团或支架时，构件有时可被错退火至其上。但转移的功能实体实际上通过延伸过程被正确地编码在复合物上。该方案类似于自然中使用的安排在DNA水平上允许碱基错误掺入(与构件的错配退火相比)，得到多样性，但坚持对表型的正确编码(与复合物上的正确密码子的延伸相比)。
标识符和构件之间的退火可以是随机过程或通过标识符区域和互补性标识符区域中的序列而引导。随机过程可通过在所有的标识符区域和互补性标识符区域中使用相同的序列而实现。因此标识符和构件的混合物随机或半随机地退火并得到功能实体的独特组合。或者，随机或半随机过程可通过在与标识符核酸碱基相对的构件位置上使用通用碱基而实现，其中所述标识符核酸碱基编码特定支架或反应基团的身份。标识符寡核苷酸和构件寡核苷酸的序列可被优化以确保退火过程涉及的库中的序列以相等的退火程度组装，而与连接到构件上的功能实体无关。因此，在选择步骤中没有或较少有由于特定构件的不同的退火性能产生的偏差。另外，在每个退火步骤中和针对库中的每种杂交产物的退火过程类似性可确保为反应基团/支架同等地提供功能实体。这样提供用于转移步骤的最佳条件。新生双功能复合物包含寡核苷酸标识符区域和反应基团。反应基团可通过可断裂的接头连接至寡核苷酸上，允许最终反应产物与寡核苷酸分离。可存在单个反应基团或多个反应基团可作为支架的一部分而存在。支架可通过可断裂的接头连接到寡核苷酸，这样能够随后分离反应过的支架。反应基团可选自任何能够接受功能实体的基团。合适的反应基团的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，和羟基基团。另外，新生双功能复合物的反应基团可以 是在开始本发明的方法之前必需被活化的前形。新生双功能复合物也被称作生长中的复合物和表示要根据本发明方法进一步处理的起始或中间复合物。标识符分子的标识符区域中的核苷酸数根据标识符和构件之间的退火的强度和特异性而确定。较强的和更特异的退火过程一般使用较长的核苷酸序列而得到。通常约10-20个核苷酸足以实现特异和有效的退火。但在本发明的一些方面，该范围可以是2-1000，最优选15-30个核苷酸。标识符区域可在某些实施方案中包含有关新生双功能复合物的反应基团或支架的身份的信息。这些支架密码子的位置一般远离支架，这样允许在包含所要转移的功能实体和支架的部分形成稳定的双螺旋。支架密码子可具有任何长度，但一般选择为与规定功能实体的密码子相同的长度。标识符区域的后部一般提供有恒定或结合序列。结合序列在被退火至构件的合适部分上时提供酶进行延伸的底物。构件包含与至少一部分标识符区域足够互补从而允许杂交的寡核苷酸。构件的寡核苷酸可不完全与标识符互补，即，可允许一个或多个错配，但必须确保构件能够退火至标识符区域上。为简便起见，构件寡核苷酸的能够退火至标识符上的部分被称作互补性标识符区域。在本说明书和权利要求书中，术语杂交要理解为将两个单链寡核苷酸相互附着使得形成杂交产物的过程。构件还包含由寡核苷酸组成的反密码子区域。反密码子标识构件的功能实体的身份。在某些实施方案中，相同的反密码子用于编码几种不同的功能实体。在随后鉴定步骤中，展示分子的结构可根据对不同的连接化学，位阻，正交保护基团的去保护，等的认识而推断。在另一实施方案中，同一反密码子用于具有共性，如亲油性质，某些连接化学，等的一组功能实体。但在一个优选实施方案中，反密码子是独特的，即核苷酸的类似组合不出现在携带另一功能实体的另一构件上。在实际方案中，对于特定功能实体，仅使用核苷酸的单个组合。在本发明的一些方面，可有利地为相同的功能实体使用几种反密码子，其方式非常类似于自然界为单个氨基酸使用最高六个不同的反密码子。两种或多种标识相同的功能实体的反密码子可携带有关不同的反应条件的更多信息。各个反密码子与库中的另一反密码子的区别可仅在于单个核苷酸。但为了有助于随后解码过程，一般最好在特定的反密码子和出现在各种构件上的任何其它反密码子之间存在两个或多个错配。例如，如果选择5个核苷酸的密码子/反密码子长度，那么存在100个以上的核苷酸组合，其中出现两个或多个错配。对于密码子中的一定数目的核苷酸，一般希望优化特定密码子/反密码子相对于出现在该库中的任何其它密码子/反密码子的错配数。功能实体与互补性标识符区域的偶联可使用合适的偶联反应进行。本领域已知的这些反应的任何偶联反应或组合可适当地使用，这是本领域熟练技术人员所容易认识。连接至互补性标识符区域上的功能实体为优选包含至少一个反应基团从而允许键接至标识符的反应基团上的分子。反密码子的序列标识连接在相同的构件中的功能实体。该反密码子序列直接包括在构件序列中或例如使用聚合酶或连接酶连接到预先存在的构件上。在例如详细公开于实·施例7的某些实施方案中，在实施例中被称作载体oligo的互补性标识符区域最初用各种功能实体加载。每个加载的载体oligo随后使用夹板oligo (splint oligo)连接至反密码子oligo上以组装这两个寡核苷酸。连接反应用于将所要转移的功能实体与指定功能实体的结构的反密码子连接。反密码子oligo可按照各种方式设计。通常，允许夹板退火的区域被包括在该设计中。但一些连接酶如T4 RNA连接酶无需双链DNA的区段。因此，夹板和退火至夹板上的反密码子oligo的部分可在一些实施方案中可被省去。如果标识符区域包含编码支架的身份的密码子，那么反密码子oligo包含一串通用碱基，如次黄嘌呤核苷。如果与标识符区域上的结合区域互补的区域被包括在下游，那么通用碱可被省去。后一实施方案通常要求一部分标识符环出。互补性结合区域通常被选择使得聚合酶能够识别与新生双功能分子的结合区域所形成的双螺旋作为底物。反密码子合适地位于互补性结合区域的5’侧，这样它可通过延伸反应被转移至新生复合物上。合适地，设计互补性结合区域使得可鉴别出现在最后双功能复合物上的密码子序列中的特定密码子的位置。反密码子序列通过延伸过程被转录至标识符以形成在标识符分子上的密码子。这可通过本领域任何方法而进行，包括，但不限于，聚合酶延伸反应。聚合酶延伸反应通常需要在合适的缓冲剂中存在足够的聚合酶活性以及四种天然核苷酸三磷酸(ATP，CTP,GTPJPTTP)中的每一种。因此，当构件和标识符分子已退火并在功能实体和接受性反应基团之间进行反应时，特定反密码子的序列仅被转移至标识符上作为密码子。四种天然核苷酸可编码4N变型，其中N是密码子的长度。例如，果独特密码子是5个核苷酸的长度，那么用于不同的功能实体的可能编码的数目是1024。密码子也可在每个位置上使用四种天然核苷酸的子集而设计。这可有利地与通用核酸碱基结合使用。每个构件中的反密码子为相同的构件中的功能实体编码。该序列在本发明的一个方面可通过利用功能实体引物和反密码子引物的互补性标识符区域的PCR而引入。构件的功能实体所起的作用是用作最终被引入展示分子中的结构实体的前体。因此，在本申请和权利要求书中，如果叙述到功能实体被转移至新生双功能复合物上，这要理解为未必该原始功能实体的所有原子会出现在最终形成的展示分子中。另外，由于该连接所涉及的反应，功能实体的结构可在它出现在新生展示分子上时被改变。尤其，导致释放功能实体的断裂作用可产生在随后步骤中可参与形成新生展示分子和功能实体之间连接的反应基团。构件的功能实体优选包含至少一个能够参与反应的反应基团,该反应导致构件的功能实体和携带反应基团的标识符之间的连接。出现在功能实体上的反应基团的数目合适地是I至10。以仅一个反应基团为特征的功能实体用于例如聚合物或支架的末端位置，而具有两个反应基团的功能实体适用于形成能够进一步反应的聚合物或支架的体部分。意欲用于形成连接的两个或多个反应基团通常存在于支架上。支架是核心结构，构成用于产生多个变型的基础。支架的变型形式通常通过支架的反应基团与其它功能实体的反应基团，任选地在填入基团或催化剂的媒介下反应而形成。所要连接至支架上的功能实体可包含一个，两个或几个能够形成连接的反应基团。支架的例子包括留族，乙内酰脲类，苯并二氮杂草，等。构件的反应基团可以能够形成与标识符的反应基团的直接连接或构件的反应基团可以能够通过桥接填入基团而形成与标识符的反应基团的连接。可以理解，不是反应基团的所有原子必需保持在所形成的连接中。相反，反应基团要被认为是用于该连接结构的 前体。在形成连接之后或同时，进行断裂以使功能实体转移至标识符上。断裂可按照任何合适的方式进行。在本发明的一个方面，断裂包括试剂或和酶的使用。断裂导致功能实体转移至新生双功能复合物上或导致复合物转移至构件的功能实体上。在某些情况下，可有利地通过接头断裂而引入新化学基团。新化学基团可用于在随后周期中，直接或在已被活化之后进一步反应。在其它情况下，最好在断裂之后没有留下接头的痕迹(trace)。另一方面，连接和断裂作为同时反应而进行，即构件的功能实体或新生展示分子是该反应的离去基团。在本发明的一些方面，优选设计该体系使得连接和断裂同时发生，因为这样可减少步骤数和复杂性。同时连接和断裂也可设计使得没有留下接头的痕迹或使得用于进一步反应的新化学基团被引入，如上所述。在本发明其它方面，优选进行分开的交联和断裂步骤，因为逐步方案能够控制每个子步骤并能够减少非特异性转移的可能性。优选，至少一个接头在断裂步骤之后保持完整。该至少一个接头将新生展示分子连接至编码区域上。如果该方法基本上包括功能实体至支架或正形成的聚合物上的转移，那么最终支架上的分子或聚合物可与可选择性地断裂的接头连接。可选择性地断裂的接头设计使得它在导致功能实体转移至新生模板引导的分子上的条件下不断裂。可断裂的接头可选自大量的化学结构。接头的例子包括，但不限于此，具有酶断裂位点的接头，包含化学可降解组分的接头，和可通过电磁辐射而断裂的接头。特别有意义的可断裂的接头目前是可通过光断裂的接头。合适的实施例包括位于展示分子和标识符区域之间的O-硝基苄基基团。用于根据本发明的方法使用的构件可按照该构件所涉及的特定实体而设计。例如，反密码子可用聚乙二醇(PEG)接头连接到互补性标识符区域上且功能实体可直接连接到所述互补性标识符区域上。在另一和优选的实施例中，反密码子、互补性标识符区域和功能实体是邻接的线性寡核苷酸。在本发明的某些实施方案中，构件设计使得一部分标识符环出。常常发生标识符的环出，因为构件oligo不退火至整个长度的标识符上。通常，构件设计使得它能够退火至双功能复合物的至少标识符区域上和标识符后面部分的结合区域上。互补性标识符区域和反密码子可通过单个键直接连接，通过合适的长度的PEG接头，或核酸碱基序列而连接，其中所述核酸碱基序列可或可不包含与标识符上的各种密码子和结合区域互补的核酸碱基。在本发明的某些实施方案中，构件被设计成仅退火至结合区域上，通常在与已连接展示分子的末端相对的标识符末端。在本发明的一个方面，构件和/或新生标识符由两个或多个能够相互杂交以形成杂交复合物的单独的核苷酸组成。寡核苷酸之间的间隙可使用合适的酶活性，如聚合酶和连接酶填充以合适的核苷酸，得到连贯的标识符和/或构件。功能实体与互补性标识符区域的连接通常通过接头而进行。优选接头将功能实体与互补性标识符区域在末端核苷酸或寡核苷酸下游一个或两个核苷酸的核苷酸处连接。功能实体的连接可处于任何可用于连接的实体上，即功能实体可连接到寡核苷酸的核苷酸的核酸碱基上，或主链上。一般来说，优选在核苷酸间键的磷上或在核酸碱基上连接功能实体。在本发明的某些方面，功能实体的反应基团连接到接头寡核苷酸上。反应基团优选能够通过相应的反应基团之间的直接反应或通过使用合适的填入基团而产生与新生展 示分子的连接。将功能实体与接头偶联的反应基团优选在建立连接的同时被断裂。功能实体在一些情况下可包含能够在随后周期中涉及形成连接的第二反应基团。第二反应基团可在它能够参与形成连接之前需要活化。如果两个或多个功能实体要被转移至复合物上，密码子可被恒定区域或结合区域分开。结合区域的一个功能可以是确立一个聚合酶可在其上结合的平台。根据所形成的被编码分子，标识符可包含其它的密码子，如3，4，5，或更多的密码子。其它密码子每一个可通过合适的结合区域而分开。优选，标识符的所有的或至少大多数的密码子通过结合序列与相邻密码子分开。结合区域可具有任何合适数目的核苷酸，如I至20个。除了用作酶的底物，结合区域(如果有的话)可用于各种目的。在本发明的一种设置中，结合区域标识密码子的位置。通常，在密码子的上游或下游的结合区域包含允许确定密码子的位置的信息。在另一设置中，结合区域具有交替序列(alternating sequences),允许在形成库时由两个池(pool)加入构件。另外，结合区域可调节退火温度至所需水平。具有高亲和性的结合区域可通过引入一个或多个与相关核酸碱基形成三个氢键的核酸碱基而提供。具有该性能的核酸碱基的例子是鸟嘌呤和胞嘧啶。作为替代方案，或在此之外，结合区域可经受主链修饰。几种主链修饰提供较高亲和性，如核糖部分的2’-0_甲基取代，肽核酸(PNA)，和也被称作LNA(锁定的核酸)的核糖部分的2’-4’0_亚甲基环化。标识符可包含在密码子周围的侧翼区域。侧翼区域可包括信号基团，如荧光团或放射性活性基团从而能够检测复合物的存在或不存在或侧翼区域可包含可被检测的标记，如生物素。如果标识符包含生物素部分，标识符可容易被回收。侧翼区域也可用作扩增反应，如PCR的引发部位。通常，在形成双功能复合物的最后周期包括引发部位的引入。双功能复合物的标识符区域通常用作另一引发部位，这样允许对双功能复合物的编码区域进行PCR扩增。可以理解，当术语标识符用于本说明书和权利要求书时，标识符可以是有义或反义形式，即标识符可包含实际编码该分子的密码子的序列或可以是与其互补的序列。另外，标识符可根据需要是单链或双链的。
一般在活性反密码子之前包含一个或多个反密码子的那部分互补性标识符区域或构件寡核苷酸的设计可以是随机或半随机的且可允许与标识符区域的一个或多个错配。但尤其是当考虑库时，可有利地在与前面的密码子互补的区域中引入一个或多个非特异碱基配对的核酸碱基。非特异碱基配对的核酸碱基是当连接到主链上时能够与五种自然存在的核酸碱基(C，T，G，A，和U)中的至少两种配对的碱基。优选，此两种或多种天然核酸碱基和该非特异性碱基配对的核酸碱基之间的碱基配对基本上等能量地发生，即所形成的键具有同数量级的强度。术语“非特异性碱基配对的核酸碱基”在本文中可与术语“通用碱基”互换使用。在天然tRNA中，存在核酸碱基次黄嘌呤核苷。次黄嘌呤核苷具有与三种核酸碱基，即胞嘧啶，胸腺嘧啶，和腺嘌呤非特异性杂交的能力。以下描述次黄嘌呤核苷和具有与天然核酸碱基非特异性碱基配对的相同能力的其它合成化合物的例子通用碱基的例子
权利要求
1.新生双功能复合物，其包含 a)通过化学反应部位与反应物反应得到的反应产物， 其中，化学反应部位通过连接部分与标识该化学反应部位的第一寡核苷酸标签连接， 其中，第一寡核苷酸标签包括用于通过酶催化来加入第二寡核苷酸标签的引发部位， b)标识反应物的第二寡核苷酸标签，和 c)互补的寡核苷酸，它杂交到所述的第一核苷酸标签和第二寡核苷酸标签的每一个上。
2.权利要求I的新生双功能复合物，其中，连接部分是核酸序列。
3.权利要求I的新生双功能复合物，其中，连接部分中的核苷酸数目为8个或更多。
4.权利要求I的新生双功能复合物，其中，连接部分通过间隔基连接到化学反应部位上，间隔基包含可选择性地断裂的接头以使反应产物能脱离寡核苷酸标签。
5.权利要求I的新生双功能复合物，其中，反应产物通过共价键与第一核苷酸标签连接。
6.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是环加成产物。
7.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是烷基化产物。
8.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是芳基化产物。
9.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是酰基化产物。
10.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是酰胺键。
11.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是羧酸酯键。
12.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是磺酰胺键。
13.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是二硫键。
14.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是S-烷基键。
15.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是NR-烷基键。
16.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是O-烷基键。
17.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是芳基-乙烯基键。
18.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是炔-乙烯基键。
19.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是肟键。
20.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是亚胺键。
21.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是双环产物。
22.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是三唑。
23.权利要求5的新生双功能复合物，其中，共价键是己烯。
24.权利要求I的新生双功能复合物，其中，化学反应部位包含能与I种或多种反应物反应的单个反应基团。
25.权利要求I的新生双功能复合物，其中，化学反应部位包含能与I种或多种反应物反应的多个反应基团。
26.权利要求I的新生双功能复合物，其中，化学反应部位包含连接有一个或多个反应基团的支架。
27.权利要求24-26任一项的新生双功能复合物，其中，一个或多个反应基团选自胺基团、羧酸基团、硫基团、醛基团和羟基基团。
28.权利要求26的新生双功能复合物，其中，支架选自苯并二氮杂輩类、留族、乙内酰脲类、哌嗪类、二酮哌嗪类、吗啉类、托烷类、香豆素类、喹啉类、吲哚类、呋喃类、吡咯类、1 唑类、氨基酸前体和噻唑类。
29.权利要求I的新生双功能复合物，其中，可使用标准PCR技术扩增寡核苷酸标签。
30.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签由允许酶识别该寡核苷酸作为底物的主链结构组成。
31.权利要求30的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的主链结构是DNA或RNA。
32.权利要求I的新生双功能复合物，其中，引发部位包含3’-OH。
33.权利要求I的新生双功能复合物，其中，引发部位包含5’-磷酸基团。
34.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长2至100个核苷酸。
35.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长3至50个核苷酸。
36.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长4至20个核苷酸。
37.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签长5至15个核苷酸。
38.权利要求I的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的核苷酸由核酸碱基部分和主链单元组成，其中主链单元由糖部分和核苷间接头组成。
39.权利要求38的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的核酸碱基选自天然存在的核酸碱基以及非天然存在的核酸碱基。
40.权利要求38的新生双功能复合物，其中，核酸碱基选自嘌呤杂环、嘧啶杂环、以及其杂环类似物和互变异构体。
41.权利要求38的新生双功能复合物，其中，核酸碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黄嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6, N6-桥亚乙基-2，6- 二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和次黄嘌呤核苷。
42.权利要求38的新生双功能复合物，其中，核酸碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
43.权利要求38的新生双功能复合物，其中，主链单元选自
44.权利要求38的新生双功能复合物,其中，主链单元的糖部分是戍糖。
45.权利要求44的新生双功能复合物，其中，戊糖选自核糖、2’-脱氧核糖、2’ -O-甲基-核糖、2’ -氟-核糖和2’ -4’ -O-亚甲基-核糖(LNA)。
46.权利要求38-42任一项的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签的核苷酸的核酸碱基连接在戊糖的I’位上。
47.权利要求38的新生双功能复合物，其中，连接寡核苷酸标签中相邻的两个核苷酸的核苷间键选自磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、磷酸三酯键和~■硫代憐Ife酷键。
48.权利要求38的新生双功能复合物，其中，寡核苷酸标签包括通过磷酸二酯键连接的DNA及RNA家族天然存在的核苷。
49.权利要求48的新生双功能复合物，其中，脱氧核糖核苷选自脱氧腺苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧胸腺嘧啶核苷和脱氧胞苷；而核糖核苷选自腺苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞苷和次黄嘌呤核苷。
50.合成权利要求1-49任一项的新生双功能复合物的方法，所述的方法包括步骤 a)提供化学反应部位，其通过连接部分连接到标识该化学反应部位的第一寡核苷酸标签，所述的第一寡核苷酸标签包括用于酶加入第二寡核苷酸标签的引发部位； b)将反应物与化学反应部位反应，由此获得反应产物； c)提供标识所述反应物的第二寡核苷酸标签； d)提供在序列上与第一寡核苷酸标签和第二寡核苷酸标签互补的寡核苷酸，和 e)使该互补核苷酸与第一寡核苷酸标签和第二寡核苷酸标签杂交。
51.不同的权利要求1-49任一项的新生双功能复合物的库。
52.用于鉴定包含具有预选性质的反应产物的新生双功能复合物的方法，所述方法包括步骤 a)分开权利要求51的库,和 b)通过解码双功能复合物的寡核苷酸标签鉴定具有预选性质的反应产物。
53.权利要求1-49任一项的新生双功能复合物在制备用于治疗需要该治疗的个体的临床疾病的有潜力的药物候选物中的用途。
54.组合物，包含 a)能与包含连接有I个或者多个反应基团的支架的化学反应部位反应的反应物，所述的支架通过连接部分共价连接于用于标识该支架的第一寡核苷酸标签， b)包含连接有I个或者多个反应基团的支架的化学反应部位，所述的支架通过连接部分共价连接于用于标识该支架的第一寡核苷酸标签， c)标识所述反应物的第二寡核苷酸标签，和 d)能连接第一寡核苷酸标签和第二寡核苷酸标签的酶。
55.权利要求54的组合物，还包含能与所述的第一寡核苷酸标签和第二寡核苷酸标签的每一个杂交的互补寡核苷酸。
56.权利要求54的组合物，其中，连接部分是核酸序列。
57.权利要求54的组合物，其中，连接部分的核苷酸数目为8个或更多。
58.权利要求54的组合物，其中，连接部分通过间隔基连接到化学反应部位上，间隔基包含可选择性地断裂的接头以使反应产物能脱离寡核苷酸标签。
59.权利要求54的组合物，其中，所述I个或多个支架反应基团选自胺基团、羧酸基团、硫基团、醛基团和羟基基团。
60.权利要求54的组合物，其中，支架选自二氮杂輩类、留族、乙内酰脲类、哌嗪类、二酮哌嗪类、吗啉类、托烷类、香豆素类、喹啉类、吲哚类、呋喃类、吡咯类J恶唑类、氨基酸前体和噻唑类。
61.权利要求54的组合物，其中，可使用标准PCR技术扩增寡核苷酸标签。
62.权利要求54的组合物，其中，寡核苷酸标签由允许酶识别该寡核苷酸作为底物的主链结构组成。
63.权利要求62的组合物，其中，寡核苷酸标签的主链结构是DNA或RNA。
64.权利要求54的组合物，其中，引发部位包含3’-OH。
65.权利要求54的组合物，其中，引发部位包含5’-磷酸基团。
66.权利要求54的组合物,其中，寡核苷酸标签长2至100个核苷酸。
67.权利要求54的组合物,其中，寡核苷酸标签长3至50个核苷酸。
68.权利要求54的组合物，其中，寡核苷酸标签长4至20个核苷酸。
69.权利要求54的组合物,其中，寡核苷酸标签长5至15个核苷酸。
70.权利要求54的组合物，其中，寡核苷酸标签的核苷酸由核酸碱基部分和主链单元组成，其中主链单元由糖部分和核苷间接头组成。
71.权利要求70的组合物，其中，寡核苷酸标签的核酸碱基选自天然存在的核酸碱基以及非天然存在的核酸碱基。
72.权利要求71的组合物，其中，所述核酸碱基选自嘌呤杂环、嘧啶杂环、及其杂环类似物和互变异构体。
73.权利要求71的复合物，其中，核酸碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黄嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6，N6-桥亚乙基-2，6- 二氨基-嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5- (C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤和次黄嘌呤核苷。
74.权利要求71的组合物，其中，核酸碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
75.权利要求71的组合物，其中，主链单元选自
76.权利要求70的组合物，其中，主链单元的糖部分是戊糖。
77.权利要求76的组合物，其中，戊糖选自核糖、2’-脱氧核糖、2’ -O-甲基-核糖、2’ -氟-核糖和2’ -4’ -O-亚甲基-核糖(LNA)。
78.权利要求76或77的组合物，其中，寡核苷酸标签的核苷酸的核酸碱基连接在戊糖的I’位上。
79.权利要求70的组合物，其中，连接寡核苷酸标签中相邻两个核苷酸的核苷间接头选自磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、氨基磷酸酯键、磷酸三酯键和二硫代磷酸酯键。
80.权利要求54的组合物，其中，寡核苷酸标签包括通过磷酸二酯键连接的DNA及RNA家族天然存在的核苷。
81.权利要求80的组合物，其中，脱氧核糖核苷选自脱氧腺苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧胸腺嘧啶核苷和脱氧胞苷；而核糖核苷选自腺苷、鸟嘌呤核甙、尿嘧啶核苷、胞苷和次黄嘌呤核苷。
82.权利要求54-81任一项的组合物在制备用于治疗需要该治疗的个体的临床疾病的有潜力的药物候选物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种合成包含反应产物和编码区域的双功能复合物的方法。该复合物是新生双功能复合物和构件之间的杂交产物。新生双功能复合物包含连接到寡核苷酸标识符区的连接实体，构件包含和与该标识符区足够互补以允许杂交的寡核苷酸连接的功能实体。然后，功能实体可通过化学反应转移到连接实体上。互补标识符区还包含独特密码子，它明确地标识该功能实体。该密码子在使用酶(例如聚合酶)延伸该标识符区域时用作模板以形成独特密码子。独特密码子可用于解码几轮功能实体转移后反应产物的合成历史。
文档编号C12N15/10GK102838654SQ20121022202
公开日2012年12月26日 申请日期2003年10月30日 优先权日2002年10月30日
发明者P-O·弗里斯克加德, T·弗朗奇, A·H·古利艾夫, M·D·伦多夫, J·费尔丁, E·K·奥尔森, A·霍尔特曼, S·N·雅克布森, C·萨姆斯, S·S·格莱德, K·B·延森, H·佩德森 申请人:纽韦卢森公司