芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(pldxs)基因及其编码产物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其编码蛋白与用途，该基因为首次利用构建cDNA文库从芍药中克隆而得，填补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因的空白。本发明所提供的芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因可以通过生物技术提高芍药中脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径代谢产物的含量，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。
【专利说明】芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因及其编码产物
和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，主要涉及利用芍药cDNA文库克隆脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、萜类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂、种类繁多，其中主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分，芍药Paeonia lactif 1ra不仅是名花,还是一味常用中药,其根可供药用。其中白苟具有镇痉、镇痛、通经等作用。芍药根中含有芍药苷、安息香酸等活性成分，其中芍药苷属于单萜类化合物，具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥、，解痉、解热、抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血糖、调节免疫、保护肝脏等作用(杨俊，方红编。芍药[M]。北京:中国中医药出版社，2001，113)。
[0003]脱氧木酮糖-5-憐酸合酶(l-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase, DXS)是位于质体中的萜类化合物生物合成途径脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径的起始酶，能将丙酮酸和甘油醛-3-磷酸转化生成DXP，现在普遍认为DXS是DXP途径的关键酶和限速酶，其表达量可能 与芍药苷等萜类成分的含量密切相关。芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因的克隆，为利用基因工程提高芍药活性成分含量提供重要物质基础，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利中请中所提及的芍药中脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因及其氨基酸序列。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因。
[0005]本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。
[0006]本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。
[0007]本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。
[0008]本发明所提供的芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因，为以下核苷酸序列之一:
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。[0011]该基因所编码的蛋白质为芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因，是以下氨基酸序列之一:
[0012](I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
[0014]本发明所提供的脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因是首次从芍药中克隆制备的，体外实验表明，PLDXS具有催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生成DXP的活性。利用本发明可以通过基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物质含量。
【专利附图】
【附图说明】:[0015]图1:PLDXS功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；
[0016]图2 =PLDXS系统进化树(邻接法)；
[0017]图3:表达载体pET32-PLDXS构建；
【具体实施方式】
[0018]实施例1、芍药cDNA文库的构建
[0019]1、芍药总RNA的分离和检测
[0020]取苟药(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研钵中用液氮快速研磨成粉末,快速转移至 65°C预热的 IOmL 提取缓冲液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol.l-1，EDTA25mmol.?Λ NaCl 2.0mol.?Λ PVP402%，亚精胺 0.5g/L，巯基乙醇 2% )，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的IOM LiCl，混匀后放置 4°C沉淀过夜；7500g 离心 20 分钟，沉淀用 500yL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol.?ΛTris-HCl (ρΗ8.0) IOmmol.?Λ EDTA lmmol.?Λ 在 65°C溶解 5 分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，_70°C放置2小时；4°C 13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于IOOy L DEPC处理的水中，用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定Α260、Α280比值和浓度。置于_80°C冰箱备用。
[0021]2、cDNA文库的构建
[0022]米用mRNA 纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分离 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Cat.N0.634903)进行建库，原理为 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。
[0023]实施例2:芍药相关基因的克隆
[0024]随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的IOul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次加入:Taq buffer 2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.8μ L, dNTP (2.5mM) I μ L, M13+ 引物(IOpmol) I μ L，M13-引物(IOpmol) I μ L，Taq SI 0.4 μ L0 PCR 反应条件为 94°C预变性 5 分钟后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分钟，35个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。待PCR反应进入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。选择条带单一扩增产物送至华大基因公司进行测序，获得芍药相关基因序列。[0025]实施例3、PLDXS基因的生物信息学分析
[0026]本发明涉及的芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因全长cDNA的长度为2160bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于l_2160bp。将芍药全长cDNA序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBankCDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的DXS有较高的同源性，同时具有典型的l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 结构域。如图1。
[0027]实施例4、PLDXS基因功能的研究
[0028]1.重组质粒的构建
[0029]以PLDXS cDNA 为模板，利用引物 Pl:5' -GGATCCATGGGTACTGCTTCTGCTCATTAC-3',P2:5/ -GGTACCCTAGCACATCAAAAGGAGAGCTTCA-3'进行 PCR 反应，反应体系同实验例 2。取5ul扩增产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为2172bp。用BamH I和Kpn I在37°C下双酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH I和Kpn I在37°C下酶切pMD19_T载体2小时，加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用回收试剂盒回收片段。
[0030]回收片段经T4连接酶在8°C连接过夜。电击转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。含PLDXS克隆的pMD19质粒经PCR和限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pMD 19-PLDXS。
[0031]2.原核表达及载体构建
[0032]BamH I和Kpn I双酶切pMD 19-PLDXS质粒和pET 32a质粒，分别回收目标片段PLDXS和开环的pET32a片段。回收片段PLDXS和pET 32a于16°C连接过夜，获得重组质粒，经PCR和限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析，证明含有正确序列的PLDXS，该表达载体命名为 pET32-PLDXS(图 3)。
[0033]用目标质粒pET32-PLDXS利用CaCl2方法转入E.coli BL21感受态细胞，培养筛选含有pET32-PLDXS质粒的阳性菌株。挑取单菌落的工程菌于3ml含100 μ g/ml氨苄青霉素LB培养基中振摇培养过夜，按1: 100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100 μ g/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至0D600达0.5后，取Iml菌液作为诱导前对照，然后加入终浓度为lmmol/L的异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，在37°C振荡培养中诱导工程菌表达，于诱导3h后取样1ml，以含有pET32a空载体的E.coli BL21培养物为阴性对照。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为78.89kD处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致。
[0034]3.PLDXS基因功能分析
[0035]BamH I和Kpn I双酶切pMD 19-PLDXS质粒和pTrc-AtlPI质粒，分别回收目标片段PLDXS和大片段pTrc骨架，于16°C连接回收片段，获得重组质粒，经PCR和限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析，证明含有正确序列的PLDXS，
[0036]将pTrc-PLDXS转化携带pAC_LYC质粒的大肠杆菌XLl-Blue，并在含有Amp (100 μ g/ml)和Cm(50 μ g/ml)的LB培养基上筛选阳性克隆。
[0037]将携带番茄红素生物合成途径上香叶基香叶基焦磷酸合成酶(crtE)、八氢番茄红素合成酶(crtB)、八氢番茄红素脱饱和酶(crtl)3个关键酶基因的原核表达载体pAC-LYC导入大肠杆菌菌株XLl-Blue后，可以在本底水平上表达番茄红素。当把pTrc-PLDXS导入上述重组菌后，由于突破了上游途径的代谢瓶颈，推动代谢流向番茄红素合成的方向流动，使该菌能大量积聚番茄红素。
[0038]本发明挑取分别含有Ll-Blue+pTrc-PLDXS、XLl-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC 的大肠杆菌单克隆，在含有Απιρ(100μ g/ml)和Cm(50yg/ml)的LB培养基上，于28 °C倒置暗培养，2~3天后观察菌落颜色变化情况。以含有XLl-Blue、XLl-Blue-+pAC-LYC、XLl-BIue+pTrc+pAC-LYC大肠杆菌单克隆为对照。
[0039]实验结果表明，72h培养后，XLl-Blue 空菌、XLl-Blue+pTrc-PLDXS、XLl-Blue+pAC-LYC都不能生长；XLl-Blue+pTrc+pAC_LYC未携带PLDXS，不能过量表达番茄红素，所以菌落仍呈现XL1-Blue本身的淡黄色；只有XLl-Blue+pTrc-PLDXS+pAC-LYC由于能大量表达番茄红素，经培养后，菌落呈现番茄红素特有的红色。从而证明了 PLDXS可以推动代谢流向番茄红素合成的方向流动，使该菌能大量积聚番茄红素。
[0040]4.突变DXS活性测定
[0041]以PLDXS cDNA 为模板，利用突变引物 P3:5' -GGATCCATGGGTACCGCTTCTGCTCATTAC-3/ , P4:5/ -GGTACCCTAGCACATCAAAAGGAGAGCTTCA-3'进行 PCR 反应，重组质粒的构建、原核表达及载体构建、PLDXS功能分析方法同上，结果表明突变PLDXS转基因工程菌株与正常PLDXS没有显著差异。
【权利要求】
1.一种芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—种芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
3.重组载体，其特征在于:含有权利要求1所述的芍药脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(PLDXS)基因全序列或部分序列。
【文档编号】C12N9/10GK103627717SQ201210296844
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月21日 优先权日:2012年8月21日
【发明者】黄璐琦, 袁媛, 汪周勇 申请人:中国中医科学院中药研究所