专利名称：鉴别抑制1－脱氧－d－木酮糖－5－磷酸生物合成途径的化学活性成分的方法以及所述 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴别适用于治疗由单细胞或多细胞寄生虫导致的寄生虫病的活性成分的方法。医学及制药工业是本发明的应用领域。本发明还涉及蛋白质、蛋白质片段和编码这些蛋白质和片段的DNA序列，这些DNA序列、蛋白质或其片段在鉴别作用于单细胞或多细胞寄生虫的物质中的应用，以及由此方式鉴别的活性成分及这些活性成分在生产药物组合物中的应用。
术语寄生虫包括单细胞寄生虫和多细胞寄生虫，包括蠕虫和anthropoidea。这些寄生虫导致人和动物中的传染性疾病。在本发明中，使用寄生虫的严格科学定义，即单细胞寄生虫是指原生动物门。
现已存在大量抗寄生虫病的制剂。由于很快产生抗性，现有的制剂在治疗人和动物时已变得无效。结果是有许多受疟疾寄生虫感染的区域对标准的药物如氯喹已有抗性。对治疗血吸虫病的标准制剂(吡喹酮)产生抗性也已有报道。这些抗性的产生和其他因素已导致疟疾和血吸虫病成为热带最常见的疾病。据估计有3-5亿人患有疟疾，200-250万人每年死于疟疾。另外，新药如甲氟喹的生产非常昂贵且有许多副作用。因此，非常需要治疗人和动物的药物组合物。
过去对开发抗寄生虫特别是抗疟疾和血吸虫病病原体的化疗组合物有许多尝试。其中之一是抑制所谓的类异戊二烯生物合成。类异戊二烯是从各个异戊二烯单位(异戊烯二磷酸)形成的分子，其在细胞中发挥重要功能。这些包括甾醇、泛醌和寄生虫寄生所需的其他分子。本申请中所进行的方法是基于在真菌和哺乳动物细胞中建立的模型。在真菌和哺乳动物细胞中，通过3个乙酰辅酶A分子缩合成HMG-CoA而形成亚单位异戊烯二磷酸。HMG-CoA然后从HMG-CoA还原酶转化成甲羟戊酸，甲羟戊酸然后由作为中间体阶段的甲羟戊酸磷酸酯转化成异戊烯二磷酸(见图7)。HMG-CoA还原酶抑制剂如洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀已被用作抑制寄生虫的生长。尽管用非常高剂量洛伐他汀和辛伐他汀可以获得体外抑制，但体内抑制失败了。用洛伐他汀治疗血吸虫感染的小鼠导致对这些寄生虫排卵的抑制，但是需使用非常高浓度的洛伐他汀以体内摧毁这些寄生虫中的一些。
令人惊奇地，已发现寄生虫特别是疟原虫和锥体虫(疟疾和昏睡病的致病因子)具有至少一个另外的代谢途径来合成类异戊二烯。这一代谢途径基于甘油醛与丙酮酸缩合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)。DOXP然后转化成2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸，后者转化成作为异戊烯二磷酸中间体阶段的2-C-甲基-赤藓糖醇-4-磷酸。这一代谢途径涉及DOXP合酶和DOXP还原异构酶(见图7)。过去，这一途径仅在植物、藻类和某些细菌中有描述(Sprenger等，PNAS,94(1997)12857-62,Kuzuyama等，四面体通信39(1998)4509-12)。
通过本领域技术人员已知的技术抑制上述DOXP代谢途径特别是DOXP合酶和DOXP还原异构酶适于在人和动物中防止和治疗由单细胞和多细胞寄生虫导致的感染。因为这一代谢途径在人中不发生，所以其可作为寄生虫的选择性化疗的理想靶。脱氧木酮糖-5-磷酸合酶和脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶特别适于作为化疗靶。已证明对疟疾的脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶的抑制具有特别低的副作用并且是合适的，因为人类不具有该酶的底物及其前体，也不具有酶的产物或酶本身。
本发明涉及获得抑制DOXP代谢途径的活性成分的方法，还涉及用于生产治疗和预防由单细胞或多细胞寄生虫导致的传染性疾病的药物组合物的这些活性成分。
本发明的目的是提供一种鉴别用于治疗人和动物中的寄生虫病的活性成分的新方法。另一个目的是开发获得选择性摧毁病原体并且具有很少副作用的药物的方法。
这一目的由权利要求1的方法实现。本发明的方法和所发现的活性成分的特征在于－在所谓的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸代谢途径中的类异戊二烯生物合成被抑制。
所述的代谢途径无一存在于人和动物中，仅存在于植物、藻类、某些真细菌和寄生虫如疟原虫中；因此这一治疗方法很少有副作用。
本发明还涉及参与此代谢途径的酶和这些酶的片段。这些酶是适用于进行本发明的鉴别活性成分的方法的蛋白质。本发明还涉及编码这些酶或这些酶的片段的DNA序列。
本发明涉及鉴别这些酶或其片段以及经重组技术产生酶或其片段的方法和抗体。
本发明还涉及这些酶或其片段或者编码这些酶或这些酶的片段的DNA序列在鉴别抗单细胞或多细胞病原体的活性物质中的应用。
本发明还涉及用本发明的酶发现的活性成分。
以下本发明将参照附图更详细地描述。
图1a示出编码来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的蛋白质1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的基因的核苷酸序列。
图1b示出编码来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的基因的核苷酸序列。
图2a示出编码来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的基因的核苷酸序列和相应氨基酸序列。
图2b示出编码来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的基因的核苷酸序列和相应氨基酸序列。
图3a示出来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的蛋白质1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的氨基酸序列。
图3b示出来自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的蛋白质1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的氨基酸序列。
图4a是图1b的核苷酸序列的详细说明。
图4b是图2b的核苷酸序列及相应氨基酸序列的详细说明。
图4c是图3b的氨基酸序列的详细说明。
图5示出用3剂下述物质之一治疗4天后寄生虫血症值的体外数据甲酰基，相应于3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐，以及乙酰基，相应于3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐。
图6a示出加入3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐(空心圆)以及3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐(实心圆)后对HB3株恶性疟原虫的生长的抑制。
图6b示出加入3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐(空心圆)以及3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐(实心圆)后对A2株恶性疟原虫的生长的抑制。
图6c示出加入3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐(空心圆)以及3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)-丙基-膦酸单钠盐(实心圆)后对Dd2株恶性疟原虫的生长的抑制。
图7示出经典乙酸/甲羟戊酸生物合成途径和旁路DOX-P-生物合成途径的比较。
DOXP合酶和DOXP还原异构酶的编码基因经遗传方法检测(图1a,1b,2a,2b)。在用聚合酶链反应从恶性疟原虫基因组富集后，将这些基因克隆到细菌质粒中并确定其核苷酸序列。序列数据显示这些基因与来自藻类、植物和细菌的相应基因具有高度同源性。这种非常高的同源性表明这3个基因编码恶性疟原虫的DOXP合酶和DOXP还原异构酶。
在异源系统中表达后，将所述的酶作为重组蛋白纯化并在无细胞系统中用于活性研究。DOXP合酶的活性通过将甘油醛-3-磷酸和丙酮酸转化成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸而测定。DOXP还原异构酶的活性通过在NADPH存在下将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸而测定。对NADPH浓度变化的测量经参数变化而进行。这一方法是本领域技术人员公知的。
这些酶可由编码它们的DNA序列(图1a,1b,2a,2b)及其衍生的氨基酸序列(图3a和3b)而定义。但是寄生虫之间各个寄生虫的酶可以有变化，这种氨基酸的差异通常是氨基酸交换。但是，总序列中也可有氨基酸的缺失、插入和添加。本发明的酶的大小和类型取决于表达其的细胞和细胞类型，其可以是糖基化的或非糖基化的。
本发明的酶或这些酶的片段通过在合适的表达系统如作为原核表达系统的细菌特别是大肠杆菌中，或真核表达系统特别是COS细胞或盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)中表达本发明的DNA而产生。
借助于本发明的核酸序列，可以在任何寄生虫的基因组中寻找该编码基因或其变体，并鉴别和分离编码所述酶的所需编码基因。这种方法和适合此目的的筛选方法是本领域技术人员公知的。
应用重组技术可以产生酶或酶片段的多个变体。这种衍生物可以被修饰，例如经取代、缺失或添加一或多个氨基酸而修饰。衍生可以经例如定点诱变而进行。本领域技术人员可容易地实施这种变异。仅仅需要保证酶的特性能得以保持。因此，本发明的另一主题是参与DOXP代谢途径的酶，特别是DOXP合酶和DOXP还原异构酶，其a)是外源DNA的原核或真核表达产物，b)由图1a,1b,2a和2b的序列编码，c)由与图1a,1b,2a和2b所示的DNA序列或这些DNA序列的片段(例如见图4a和4b)在编码成熟蛋白的DNA区域杂交的DNA序列编码，或者d)由与b)和c)定义的序列非经遗传密码简并性而杂交并编码具有相同氨基酸序列的多肽的DNA序列编码。
优选的酶是由图1a,1b,2a和2b的核苷酸序列所编码的酶，或由由于遗传密码简并性而编码具有相同氨基酸序列的多肽的DNA序列所编码的酶。
本发明的两种酶(图3a和3b的序列)可被视作单细胞和多细胞寄生虫，特别是单细胞寄生虫的特异蛋白质的新原型。
本发明涉及编码所述酶的核酸序列，其选自如下一组a)图1a,1b,2a和2b所示的DNA序列或其互补序列，b)与a)中的序列之一杂交的核酸序列，c)与a)或b)所述的序列之一非经遗传密码简并性而杂交的核酸序列。
本发明还涉及来自任何寄生虫的基本上将丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP合酶)并将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(DOXP还原异构酶)的酶。
这些酶可以与来自疟原虫的酶类似地如下获得，即用含有编码疟原虫酶序列的杂交探针经本领域技术人员熟悉的方法筛选，或经疟原虫的酶的DNA和蛋白质序列与其他寄生虫酶的DNA和蛋白质序列的比较而获得。
借助于核酸，可以可重复方式大量获得本发明的酶。通过本领域技术人员熟悉的方法将核酸整合进合适的表达载体中以在原核和真核生物体中表达。这种表达载体优选含有可调节/可诱导启动子。这些重组载体然后经已知方法导入用于表达的合适的宿主细胞，并在允许异源基因表达的条件下培养转化的、转染的或转导的宿主细胞。合适的宿主细胞包括原核细胞，如大肠杆菌，以及真核细胞，特别是酵母(例如酿酒酵母，粟酒裂殖糖酵母，巴斯德毕赤氏酵母)，昆虫细胞(例如黑腹果蝇的细胞系如S2细胞，苜蓿银纹夜蛾，粉纹夜蛾)，脊椎动物细胞系，特别是畸胎癌细胞系如CHO或COS细胞，以及植物细胞系。
本发明的酶还可在转基因植物和动物(如小鼠、绵羊、山羊、猪、豚鼠)中表达。有利的是，经本领域技术人员已知的技术安排表达系统，以使产生的酶经动物乳汁分泌，或可从容易获得的植物部分(果实、叶、花、根和茎部)获得。
特别合适作为脊椎动物细胞系表达载体的是从乳头瘤病毒(如SV40)、反转录病毒、新培斯病毒、巨细胞病毒和痘苗病毒衍生的系统。特别适用于昆虫细胞的表达载体是杆状病毒系统，对于植物，特别合适的是基于根癌农杆菌ti质粒的细胞系统，以及用由核酸包被的粒子轰击细胞。
本发明的酶的表达在粘菌如盘基网柄菌、Polysphondyliumpallidum和多头绒孢菌中特别显著，因为这些菌的细胞可在简单培养基上大量经济地培养。使用盘基网柄菌提供了另外的优点，因为这一微生物使用与恶性疟原虫类似的密码子编码各氨基酸，因此可实现本发明的酶的特别有效的产生。另外，用于盘基网柄菌的表达载体的可诱导启动子(例如由于缺少食物所致)是已知的。由此，重组酶产量可进一步提高。
特别适用于表达本发明的酶的宿主细胞和生物体本身没有将丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP合酶)和将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸反应成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(DOXP还原异构酶)的固有酶。符合条件的是古细菌、动物、真菌、粘菌和某些真细菌。重组酶的检测和纯化由缺少这些固有酶活性而大大促进。另外，第一次可以在宿主细胞粗提物中经济地测量本发明重组酶的活性，特别是各种化学物质和药物组合物对本发明重组酶活性的抑制。
当要进行翻译后修饰和多肽链的天然折叠时，有利的是本发明的酶在真核细胞中表达。另外，作为表达系统的功能，在基因组DNA序列表达过程中，内含子经DNA剪接而消除，酶以寄生虫特征性多肽序列产生。通过重组技术也可从待表达DNA序列中消除编码内含子的序列或可实验性插入。
通过本领域技术人员公知的技术可从宿主细胞或宿主细胞培养物上清中分离蛋白质。酶的体外再活化可能也是需要的。
为促进纯化，本发明的酶或酶片段可与各种肽链一起作为融合蛋白而表达。寡聚组氨酸序列和衍生自谷胱甘肽-S-转移酶，硫氧还蛋白或钙调蛋白结合肽的序列特别适于此目的。与硫氧还蛋白衍生序列的融合特别适合于原核表达，因为重组酶的可溶性由此提高。
另外，本发明的酶或酶的部分序列可与本领域技术人员已知的肽链表达，从而重组酶被转运至胞外环境或进入宿主细胞的某些小室。由此，酶的生物学活性的纯化和研究得以促进。
随着本发明酶的表达，可有利地改变具体的密码子。当寄生虫所用的密码子与异源表达系统所用的密码子不同时，为保证蛋白质的最佳合成，明智的是在编码区进行碱基的特异交换。缺失5＇或3＇非翻译区通常也是有利的，例如当多个导致不稳定性的序列基序ATTTA存在于DNA的3＇区时。这些在真核生物的优选表达中应缺失。这种变化包括碱基的缺失、添加或交换，并也是本发明的主题。
本发明的酶还可在标准化条件下经本领域技术人员公知的技术由体外翻译获得。适合于此的系统是兔网织红细胞和麦胚抽提物。另外，体外转录的mRNA也可在非洲爪蟾卵细胞中翻译。
通过化学合成，可以产生寡肽和多肽，其序列衍生自本发明的酶的肽序列。通过合适地选择序列，这种肽具有本发明的完整酶的特征性特征。这种肽可大量产生并特别适合于进行酶活性动力学、酶活性的调节、酶的三维结构、各种化学物质和药物组合物对酶活性的抑制、以及各种配体的结合几何学和结合亲和性的研究。
具有来自图1a,1b,2a和2b所示序列的核苷酸的DNA或图4a和4b的片段优选地用于重组产生本发明的酶。
本发明还涉及通过从寄生虫中分离而获得参与DOXP代谢途径的酶、特别是DXOP合酶和DOXP还原异构酶的方法。所述的酶经层析、电泳和其他本领域技术人员已知的技术从寄生虫提取物中分离。通过测定各自酶活性或与合适抗体的反应性而发现酶。
重组产生酶的转化的、转染的或转导的宿主细胞的检测和蛋白质的纯化优选通过与这些酶结合的抗体而进行。通过用本发明的酶或酶部分作为抗原或免疫原经已知方法可容易地获得这种抗体。
其他寄生虫的同源或交叉转化蛋白可用抗本发明蛋白的抗体经例如Western印迹试验而检测。
本发明还涉及确定DOXP酶、特别是DOXP合酶和DOXP还原异构酶的酶活性的方法，其可根据已知的指导(Sprenger等，PNAS,94(1997)12857-62和Kuzuyama等，四面体通信39(1998)4509-12)确定。在此方法中，检测丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP合酶)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(DOXP还原异构酶)。本发明还涉及用这些测定方法获得抑制相应酶活性的物质的用途。
应用重组技术可以多个酶或酶片段的变异体。这种衍生物可以例如经取代、缺失或添加而修饰一或多个氨基酸。例如，衍生可经定点诱变进行。本领域技术人员可容易地进行这种变异。仅必须保证酶的特征得以保留。
借助于本发明的酶及其同系物，可发现抗寄生虫的新的特异活性成分。
具体地，上述检测方法可用于合适的筛选物质的抗寄生虫活性的测试试剂盒中。这些包括本领域技术人员已知的并适合于筛选来自菌群和动物区系、植物、藻类、细菌或动物的天然物质及其衍生物，化学文库，以及经本领域技术人员已知技术产生的文库如组合文库的方法。(Pindur等，Pharmazie in unserer Zeit 26(1997)24-30；Broach等，自然384(1997)14-6；Lack等，Chimia50(1996)445-7；Czarnik und Ellmann，化学研究记录29(1996)；化学及工程新闻749(1996)28-73;Lorin等，化学综述96(1996)555-600;Weber等，Nachrichten aus Chemie,Technik und Laboratorium 42(1994)698-702)。
本发明还涉及蛋白质或这些蛋白质的片段包括有或无酶活性的蛋白质或蛋白质片段在本领域技术人员已知的确定蛋白质结构的技术、特别是鉴别适于开发对酶活性具有抑制效应的制剂的结合位点的方法中的应用。
用本发明的蛋白质获得的活性成分对于医学和兽医学有重要作用。
借助于本发明的蛋白质发现的活性成分具有有利的恒温动物毒性，其适合于对抗在人类和畜牧业以及在家养、育种、动物园、实验室饲养的动物，和实验动物和宠物中存在的病原性寄生虫。它们有效地抗破坏性寄生虫发育的所有或各个阶段，并且有效地抗抗性的和正常敏感的寄生虫。作为抗寄生虫的结果，疾病、死亡率和性质的降低(例如肉、奶、毛、皮、蛋等的产量)应降低，所以活性成分的应用使得畜牧业更容易且更经济。
用本发明的这些方法包括熟知的分析，可以证明DOXP还原异构酶的活性由3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸酯和衍生物3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸酯(fosmidomycin)抑制。两种物质均来自酰基羟基氨基烷基膦酸衍生物的化学文库。过去这一组化合物被描述为杀虫剂和杀细菌剂(US 4693742,DE2733658)。用于获得抗寄生虫活性成分的系统的有效性在本文显示。来自酶分析的结果可在疟疾培养(见实施例)和动物实验(见实施例)中证实。经这些酶分析发现的抑制剂能体外和体内抑制疟原虫的生长。对动物进行8天的治疗显示动物的康复。乙酰基形式的功效显示比甲酰基形式高3倍。这一结果是非常令人惊奇的，因为需要相当高(高1000倍)浓度的3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸酯抑制细菌的生长。
本发明的方法因此适用于鉴别活性成分，并且本发明的活性成分适用于对由寄生虫、真菌或病毒导致的人和动物的感染的治疗性和预防性治疗。所述的化合物适合预防和治疗由疟疾和昏睡病以及Chagas氏病、弓形体病、阿米巴性痢疾、利什曼病、毛滴虫病、肺囊虫病、肠袋虫病、隐孢子虫病、肉孢子虫病、棘阿米巴病、耐格里原虫病、球虫病、贾第鞭毛虫病和兰氏鞭毛虫病的病原体导致的感染。
本发明的方法和活性成分特别适用于治疗疟疾、昏睡病和利什曼病。
本发明的活性成分还适于抑制细菌和植物的代谢途径。根据本发明鉴别的作为DOXP代谢途径抑制剂的物质因此也适于用作除草剂以及用于治疗人和动物中的细菌感染。
适于治疗的家养动物和育种动物包括哺乳动物如牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、水牛、驴、兔、咸水鱼和淡水鱼如鲑鱼、鲤鱼和鳗鲡。合适的实验室动物和用于实验的动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、金仓鼠、狗、猫和猪。合适的宠物包括狗和猫。应用可以是预防性的和治疗性的。活性成分可直接应用或以本领域技术人员已知的合适剂型应用，如肠道用、非肠道用、皮用和鼻用制剂。
本发明的活性成分可与本领域技术人员已知的任何抗感染剂联合应用，这些包括具有抗细菌、抗寄生虫、抗病毒或杀真菌作用的物质。这些物质包括列于红目录和专家文献中的抗感染剂(Allegemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikololgie von Forth等，BI-Wissenschaftsverlag，曼海姆1998；Antibiotikatherapie vonSimon und Stille,Schattauer-Verlag，斯图加特1993)。
由于某些寄生虫同时具有甲羟戊酸代谢途径和DOXP代谢途径，本发明还涉及DOXP代谢途径的抑制剂与抑制脂肪代谢途径的制剂、包括脂类的合成或吸收的抑制剂特别是甲羟戊酸代谢途径的抑制剂的联合。HMG-CoA合酶的抑制剂和HMG-CoA还原酶的抑制剂特别制得关注。HMG-CoA还原酶的抑制剂中，特别包括洛伐他汀及衍生物、美伐他汀及衍生物、Compactin及衍生物、辛伐他汀及衍生物、普伐他汀及衍生物、Atorvastatin及衍生物、Fluvastatin及衍生物、Cerivastatin及衍生物。
实施例1编码DOXP还原异构酶的恶性疟原虫基因的表达克隆用相应的基因组DNA序列作为基质经PCR扩增克隆编码恶性疟原虫DOXP还原异构酶的基因。为获得基因组DNA，用Kerzentopf方法(Tranger und Jensen(1976)，科学193,673-675)培养恶性疟原虫株HB3。培养基是补加10％人血清、0.3微克/毫升庆大霉素和0.1mM次黄嘌呤的RPMI 1640(含HEPES和L-谷氨酰胺，Gibco)，用人红细胞调节血细胞比容为5％。将具有约4％寄生虫血症的各含有35毫升培养物体积的15个培养皿用于制备DNA。离心收集感染的红细胞并在载体缓冲液(57mM NaCl，58mM KCl，1mM NaH2PO4，7mM K2HPO4，11mM NaHCO3，14mM葡萄糖)中洗两次。通过在冰上用1O倍体积的在载体缓冲液中的1％皂苷溶液裂解细胞沉淀5分钟(根据Kilejian(1979)，美国科学院院刊76,4650-4653改进)而从红细胞中释放寄生虫。通过与在载体缓冲液中的1％BSA溶液离心而洗涤游离的寄生虫2次。根据标准程序从获得的游离寄生虫中制备DNA。然后用蛋白酶K消化寄生虫。用苯酚/氯仿抽提分析物4次，对TE过夜透析DNA溶液，然后用异丙醇沉淀。用下述引物进行PCR扩增PfYAEMfor 5＇-CTGAATTTCATATTACAAAATTAATAGATG-3＇PfYAEMrev 5＇-GTACTATGAAGAATTATGTTTGTTGTATAT-3＇下述分析用于PCR转化3微升10×PCR缓冲液2.4微升25mM MgSO42.4微升2.5mM Dntp2微升DNA基质(0.2微克/毫升)2微升引物1(7.5μM)2微升引物2(7.5μM)0.2微升taq聚合酶(5U/μl)1.6微升水扩增如下进行3个循环96℃1分钟48℃1分钟
72℃3分钟32个循环95℃40秒48℃1分钟72℃3分钟最后一个循环后，将分析物在72℃继续保温10分钟以延伸所有产物。合并这4个分析的PCR产物并用0.7％琼脂糖凝胶纯化。用DNA提取试剂盒(Millipore，货号S667)从凝胶块中洗脱DNA。用乙醇沉淀洗脱的DNA并溶于10微升水。然后用TA克隆试剂盒(Invitrogen)根据厂商指导克隆PCR产物。将20毫克插入DNA用于连接反应。经分析质粒制备和质粒的EcoRⅠ消化鉴别携带所需的重组质粒的细菌菌落。然后用标准正向和反向引物测序克隆的PCR产物，用Walkings引物技术完成序列。
将以相应方向存在于pCR2.1载体中的PCR产物重新克隆于表达载体pBK-CMV(Stratagene)中，用于在COS-7细胞中表达。用存在于两个载体的多接头的限制酶NotⅠ和BamHⅠ进行重新克隆。为转染COS-7细胞，经阴离子交换层析(Qiagen)以制备规模产生具有PCR产物的表达载体。
克隆用的所有方法详见J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis(1989)，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，美国。
在标准条件下，在含有10％FCS的DMEM培养基中培养COS-7细胞。每个细胞培养瓶装30毫升培养基。用约50％铺满的细胞进行转染，该细胞已在前一天分离。用DOTAP(Boehringer)作为转染试剂。将40微升DNA溶液(0.5微克/毫升)与110微升20mMHEPES(pH7.4)混合。在聚苯乙烯容器中将100微升DOTAP与230微升20 mM HEPES(pH7.4)混合。然后将DNA溶液转移至DOTP溶液中并在室温保温15分钟。之后将反应物与20毫升培养基混合，并用此混合物替换COS-7细胞的培养基。第二天，将细胞转移至具有新鲜培养基的新细胞培养瓶中。再保温48小时后，收获转染的COS-7细胞。刮下细胞并在分析缓冲液(100mM TrisHCl(pH7.5)，1mM MnCl2)中离心洗涤3次。将细胞重悬于最小体积的分析缓冲液中并(在液氮中)冻融3次而消化。在1.5毫升转化管中离心除去细胞碎片(13000rpm，10分钟，4℃)，并将上清直接用于测定酶活性或纯化酶。
实施例2恶性疟原虫的重组DOXP还原异构酶的纯化将在COS-7细胞中表达的恶性疟原虫的重组DOXP还原异构酶纯化至相当均质性进行更精确鉴定。纯化经亲和层析和凝胶渗透层析步骤进行。产生抗恶性疟原虫DOXP-还原异构酶的抗体以产生合适的亲和层析柱。从衍生自DNA序列的氨基酸序列选择预计具有特别高抗原效应的部分。合成合适的肽用于免疫兔。通过其与合成肽的反应性以及通过Western印迹测试证实所获得的抗血清的质量。对于Western印迹测试(BM Western印迹试剂盒，Boehringer)，使用来自恶性疟原虫和重组COS细胞的提取物。
消除低分子量胺的抗血清对PBS透析以产生亲和层析柱。将抗体与蛋白A-琼脂糖结合并用DMP交联(IgG定向试剂盒，Pierce)而共价偶联。蛋白提取物如实施例1所述由含有转染的COS-7细胞的55个细胞培养瓶中获得，并上样至用分析缓冲液平衡的柱。用过量分析缓冲液洗柱后，用洗脱缓冲液(100mM盐酸甘氨酸(pH2.8)0.4％CHAPS)洗脱柱。洗脱液立即用1M TrisHCl(pH7.5)中和。主要组分经Western印迹分析鉴别。用生物素化抗体检测以避免被从柱中小量洗脱的抗体破坏。合并主要组分，对分析缓冲液透析并超滤(30kDa,Amicon)浓缩。用分析缓冲液作为注入和洗脱缓冲液经凝胶渗透层析(Superdex 200,Pharmacia)进行进一步纯化。如上所述鉴别主要组分，合并并浓缩，与20℃甘油反应并在-70℃冻存。在还原条件下的SDS-PAGE(12％丙烯酰胺)和银染(Gel Code银染试剂盒，Pierce)的结果是，恶性疟原虫的DOXP还原异构酶作为54kDa的单一条带显示。
实施例3确定纯化的酶的活性并筛选抑制剂在一体外测试系统中证实纯化的酶的DOXP还原异构酶活性。含有0.3mM NADPH，0.3mM DOXP和10微克重组酶的100微升分析缓冲液用于一典型测试分析。通过将DOXP加入完整分析物中开始转化。NADPH的氧化通过在37℃在一微石英池中于340nm分光光度法测量。这一测试系统用于显示各种物质对恶性疟原虫的重组DOXP还原异构酶的抑制。在向转化分析中加入1μM 3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐和1μM 3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐时，观察到340nm处的吸收值无变化。在这些条件下，恶性疟原虫的DOXP还原异构酶被完全抑制。
实施例4体内测试物质抗疟疾的效果经改良的Peters试验测试各种衍生物。物质以四分之一半数致死量(LD50)应用。在测试分析中，用鼠疟疾的病原体文氏鼠疟原虫感染10只小鼠。经血液检查证实感染后，治疗4只小鼠，未治疗的6只小鼠用作对照。用1-1000mg/kg/d 3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐治疗3天导致对小鼠血液中的疟原虫的破坏。仅1天后治疗组即已无活寄生虫。对照小鼠在感染5天后寄生虫血症＞80％，不得不处死。进一步实验显示50mg/kg/d 3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐对寄生虫血症为80％的小鼠有疗效。这些小鼠在治疗1天后也无活寄生虫。3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐和3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐的进一步结果见图5所示。
实施例5在使用感染小鼠的实验中抗疟疾的保护作用用体重20-25克的雄性小鼠(BALB/c株)测试化合物体内抗疟疾的效果。在感染前1天，4只小鼠经腹膜内给予50mg/kg 3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐而处理，然后用文氏鼠疟原虫感染小鼠。事先未用所述物质处理的小鼠用作对照。在处理的小鼠中未检测到感染，而5天后对照小鼠的寄生虫血症超过80％。感染后8周处理的小鼠也无寄生虫。
实施例6根据IC50确定原则(寄生虫存活率降低一半时所需浓度)体外抑制疟原虫的生长为确定IC50值，在抑制剂存在下首先将疟原虫培养完整的48小时周期，在接下来的24小时经[3H]次黄嘌呤掺入测定存活率。将20微升等份的10倍连续稀释的3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)丙基膦酸单钠盐置于微滴板上，然后向每孔中加入180微升在培养基中的寄生虫悬液。使用约0.4％寄生虫血症和2％血细胞比容的非同步培养物。然后保温微滴板48小时，之后每孔加入30微升[3H]次黄嘌呤。保温24小时后，收获细胞并测定掺入的放射性。使用已知对其他抗疟疾药物有抗性的HB3、A2和Dd2株的结果见图6a,6b和6c所示。在所有株中，IC50值均低于0.5μM。这些株的抗性为恶性疟原虫HB3(洪都拉斯)抗乙胺嘧啶。
恶性疟原虫Dd2(印度支那)抗氯喹、奎宁、乙胺嘧啶、环氯胍和磺胺多辛。
恶性疟原虫A2(冈比亚)抗氯喹和环氯胍。
没有发现与抗疟疾制剂的交叉抗性。
序列表<110>朱马·哈桑<120>鉴别抑制1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生物合成途径的化学活性成分的方法及所述活性成分<130>15514<140>PCT/EP99/02463<141>1999-04-13<150>DE19843279.8<151>1998-09-22<150>DE19816196.4<151>1998-04-14<150>DE19828097.1<151>1998-06-24<150>DE19825585.3<151>1998-06-09<150>DE19831637.2<151>1998-07-15<150>DE19831639.9<151>1998-07-15<150>DE19831638.0<151>1998-07-15<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1467<212>DNA<213>恶性疟原虫<220><221>CDS<222>(1)..(1467)<220><221>基因<222>(1)..(1467)<220><221>mRNA<222>(1)..(1467)<400>1atg aag aaa tat att tat ata tat ttt ttc ttc atc aca ata act att48Met Lys Lys Tyr Ile Tyr Ile Tyr Phe Phe Phe Ile Thr Ile Thr Ile1 5 10 15aat gat tta gta ata aat aat aca tca aaa tgt gtt tcc att gaa aga96Asn Asp Leu Val Ile Asn Asn Thr Ser Lys Cys Val Ser Ile Glu Arg20 25 30aga aaa aat aac gca tat ata aat tat ggt ata gga tat aat gga cca 144Arg Lys Asn Asn Ala Tyr Ile Asn Tyr Gly Ile Gly Tyr Asn Gly Pro35 40 45gat aat aaa ata aca aag agt aga aga tgt aaa aga ata aag tta tgc 192Asp Asn Lys Ile Thr Lys Ser Arg Arg Cys Lys Arg Ile Lys Leu Cys50 55 60aaa aag gat tta ata gat att ggt gca ata aag aaa cca att aat gta 240Lys Lys Asp Leu Ile Asp Ile Gly Ala Ile Lys Lys Pro Ile Asn Val65 70 75 80gca att ttt gga agt act ggt agt ata ggt acg aat gct tta aat ata 288Ala Ile Phe Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Asn Ala Leu Asn Ile85 90 95ata agg gag tgt aat aaa att gaa aat gtt ttt aat gtt aaa gca ttg 336Ile Arg Glu Cys Asn Lys Ile Glu Asn Val Phe Asn Val Lys Ala Leu100 105 110tat gtg aat aag agt gtg aat gaa tta tat gaa caa gct aga gaa ttt 384Tyr Val Asn Lys Ser Val Asn Glu Leu Tyr Glu Gln Ala Arg Glu Phe115 120 125tta cca gaa tat ttg tgt ata cat gat aaa agt gta tat gaa gaa tta 432Leu Pro Glu Tyr Leu Cys Ile His Asp Lys Ser Val Tyr Glu Glu Leu130 135 140aaa gaa ctg gta aaa aat ata aaa gat tat aaa cct ata ata ttg tgt 480Lys Glu Leu Val Lys Asn Ile Lys Asp Tyr Lys Pro Ile Ile Leu Cys145 150 155 160ggt gat gaa ggg atg aaa gaa ata tgt agt agt aat agt ata gat aaa528Gly Asp Glu Gly Met Lys Glu Ile Cys Ser Ser Asn Ser Ile Asp Lys165 170 175ata gtt att ggt att gat tct ttt caa gga tta tat tct act atg tat576Ile Val Ile Gly Ile Asp Ser Phe Gln Gly Leu Tyr Ser Thr Met Tyr180 185 190gca att atg aat aat aaa ata gtt gcg tta gct aat aaa gaa tcc att624Ala Ile Met Asn Asn Lys Ile Val Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Ile195 200 205gtc tct gct ggt ttc ttt tta aag aaa tta tta aat att cat aaa aat672Val Ser Ala Gly Phe Phe Leu Lys Lys Leu Leu Asn Ile His Lys Asn210 215 220gca aag ata ata cct gtt gat tca gaa cat agt gct ata ttt caa tgt720Ala Lys Ile Ile Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys225 230 235 240tta gat aat aat aag gta tta aaa aca aaa tgt tta caa gac aat ttt768Leu Asp Asn Asn Lys Val Leu Lys Thr Lys Cys Leu Gln Asp Asn Phe245 250 255tct aaa att aac aat ata aat aaa ata ttt tta tgt tca tct gga ggt816Ser Lys Ile Asn Asn Ile Asn Lys Ile Phe Leu Cys Ser Ser Gly Gly260 265 270cca ttt caa aat tta act atg gac gaa tta aaa aat gta aca tca gaa864Pro Phe Gln Asn Leu Thr Met Asp Glu Leu Lys Asn Val Thr Ser Glu275 280 285aat gct tta aag cat cct aaa tgg aaa atg ggt aag aaa ata act ata912Asn Ala Leu Lys His Pro Lys Trp Lys Met Gly Lys Lys Ile Thr Ile290 295 300gat tct gca act atg atg aat aaa ggt tta gag gtt ata gaa acc cat960Asp Ser Ala Thr Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Thr His305 310 315 320ttt tta ttt gat gta gat tat aat gat ata gaa gtt ata gta cat aaa 1008Phe Leu Phe Asp Val Asp Tyr Asn Asp Ile Glu Val Ile Val His Lys325 330 335gaa tgc att ata cat tct tgt gtt gaa ttt ata gac aaa tca gta ata 1056Glu Cys Ile Ile His Ser Cys Val Glu Phe Ile Asp Lys Ser Val Ile340 345 350agt caa atg tat tat cca gat atg caa ata ccc ata tta tat tct tta 1104Ser Gln Met Tyr Tyr Pro Asp Met Gln Ile Pro Ile Leu Tyr Ser Leu355 360 365aca tgg cct gat aga ata aaa aca aat tta aaa cct tta gat ttg gct 1152Thr Trp Pro Asp Arg Ile Lys Thr Asn Leu Lys Pro Leu Asp Leu Ala370 375 380cag gtt tca act ctt aca ttt cat aaa cct tct tta gaa cat ttc ccg 1200Gln Val Ser Thr Leu Thr Phe His Lys Pro Ser Leu Glu His Phe Pro385 390 395 400tgt att aaa tta gct tat caa gca ggt ata aaa gga aac ttt tat cca 1248Cys Ile Lys Leu Ala Tyr Gln Ala Gly Ile Lys Gly Asn Phe Tyr Pro405 410 415act gta cta aat gcg tca aat gaa ata gct aac aac tta ttt ttg aat 1296Thr Val Leu Asn Ala Ser Asn Glu Ile Ala Asn Asn Leu Phe Leu Asn420 425 430aat aaa att aaa tat ttt gat att tcc tct ata ata tcg caa gtt ctt 1344Asn Lys Ile Lys Tyr Phe Asp Ile Ser Ser Ile Ile ser Gln Val Leu435 440 445gaa tct ttc aat tct caa aag gtt tcg gaa aat agt gaa gat tta atg 1392Glu Ser Phe Asn Ser Gln Lys Val Ser Glu Asn Ser Glu Asp Leu Met450 455 460aag caa att cta caa ata cat tct tgg gcc aaa gat aaa gct acc gat 1440Lys Gln Ile Leu Gln Ile His Ser Trp Ala Lys Asp Lys Ala Thr Asp465 470 475 480ata tac aac aaa cat aat tct tca tag1467Ile Tyr Asn Lys His Asn Ser Ser485<210>2<211>488<212>PRT<213>恶性疟原虫<400>2Met Lys Lys Tyr Ile Tyr Ile Tyr Phe Phe Phe Ile Thr Ile Thr Ile1 5 10 15Asn Asp Leu Val Ile Asn Asn Thr Ser Lys Cys Val Ser Ile Glu Arg20 25 30Arg Lys Asn Asn Ala Tyr Ile Asn Tyr Gly Ile Gly Tyr Asn Gly Pro35 40 45Asp Asn Lys Ile Thr Lys Ser Arg Arg Cys Lys Arg Ile Lys Leu Cys50 55 60Lys Lys Asp Leu Ile Asp Ile Gly Ala Ile Lys Lys Pro Ile Asn Val65 70 75 80Ala Ile Phe Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Thr Asn Ala Leu Asn Ile85 90 95Ile Arg Glu Cys Asn Lys Ile Glu Asn Val Phe Asn Val Lys Ala Leu100 105 110Tyr Val Asn Lys Ser Val Asn Glu Leu Tyr Glu Gln Ala Arg Glu Phe115 120 125Leu Pro Glu Tyr Leu Cys Ile His Asp Lys Ser Val Tyr Glu Glu Leu130 135 140Lys Glu Leu Val Lys Asn Ile Lys Asp Tyr Lys Pro Ile Ile Leu Cys145 150 155 160Gly Asp Glu Gly Met Lys Glu Ile Cys Ser Ser Asn Ser Ile Asp Lys165 170 175Ile Val Ile Gly Ile Asp Ser Phe Gln Gly Leu Tyr Ser Thr Met Tyr180 185 190Ala Ile Met Asn Asn Lys Ile Val Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Ile195 200 205Val Ser Ala Gly Phe Phe Leu Lys Lys Leu Leu Asn Ile His Lys Asn210 215 220Ala Lys Ile Ile Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys225230 235 240Leu Asp Asn Asn Lys Val Leu Lys Thr Lys Cys Leu Gln Asp Asn Phe245 250 255Ser Lys Ile Asn Asn Ile Asn Lys Ile Phe Leu Cys Ser Ser Gly Gly260 265 270Pro Phe Gln Asn Leu Thr Met Asp Glu Leu Lys Asn Val Thr Ser Glu275 280 285Asn Ala Leu Lys His Pro Lys Trp Lys Met Gly Lys Lys Ile Thr Ile290 295 300Asp Ser Ala Thr Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Thr His305 310 315 320Phe Leu Phe Asp Val Asp Tyr Asn Asp Ile Glu Val Ile Val His Lys325 330 335Glu Cys Ile Ile His Ser Cys Val Glu Phe Ile Asp Lys Ser Val Ile340 345 350Ser Gln Met Tyr Tyr Pro Asp Met Gln Ile Pro Ile Leu Tyr Ser Leu355 360 365Thr Trp Pro Asp Arg Ile Lys Thr Asn Leu Lys Pro Leu Asp Leu Ala370 375 380Gln Val Ser Thr Leu Thr Phe His Lys Pro Ser Leu Glu His Phe Pro385 390 395 400Cys Ile Lys Leu Ala Tyr Gln Ala Gly Ile Lys Gly Asn Phe Tyr Pro405 410 415Thr Val Leu Asn Ala Ser Asn Glu Ile Ala Asn ASn Leu Phe Leu Asn420 425 430Asn Lys Ile Lys Tyr Phe Asp Ile Ser Ser Ile Ile Ser Gln Val Leu435 440 445Glu Ser Phe Asn Ser Gln Lys Val Ser Glu Asn Ser Glu Asp Leu Met450 455 460Lys Gln Ile Leu Gln Ile His Ser Trp Ala Lys Asp Lys Ala Thr Asp465 470 475 480Ile Tyr Asn Lys His ASn Ser Ser485<210>3<211>3872<212>DNA<213>恶性疟原虫<220><221>CDS<222>(126)..(3740)<220><22l>基因<222>(1)..(3870)<22C><221>mRNA<222>(2)..(3870)<400>3ggtaatatac gtataatata tatataatat attcttacgt atgtatcatt tatgaatcat 60aataatattc taaatttacc ttccgttttt gctcgatctt ctcattttcg tttcagcttt 120tatca atg att ttt aat tat gtg ttt ttt aag aac ttt gta cca gtt gtt 170Met Ile Phe Asn Tyr Val Phe Phe Lys Asn Phe Val Pro Val Val5 10 15cta tac att ctc ctt ata ata tat att aac tta aat ggc atg aat aat 218Leu Tyr Ile Leu Leu Ile Ile Tyr Ile Asn Leu Asn Gly Met Asn Asn20 25 30aaa aat caa ata aaa aca gaa aaa att tat ata aag aaa ttg aat agg 266Lys Asn Gln Ile Lys Thr Glu Lys Ile Tyr Ile Lys Lys Leu Asn Arg35 40 45ttg tca agg aaa aat tcg tta tgt agt tct aaa aat aaa ata gca tgc 314Leu Ser Arg Lys Asn Ser Leu Cys Ser Ser Lys Asn Lys Ile Ala Cys50 55 60ttg ttc gat ata gga aat gat gat aat aga aat acg aca tat ggc tat 362Leu Phe Asp Ile Gly Asn Asp Asp Asn Arg Asn Thr Thr Tyr Gly Tyr65 70 75aat gtg aat gtt aaa aat gat gat att aat tcc tta cta aaa aat aat 410Asn Val Asn Val Lys Asn Asp Asp Ile Asn Ser Leu Leu Lys Asn Asn80 85 90 95tat agt aat aaa ttg tac atg gat aag agg aaa aat att aat aat gta 458Tyr Ser Asn Lys Leu Tyr Met Asp Lys Arg Lys Asn Ile Asn Asn Val100 105 110att agt act aat aaa ata tct ggg tcc att tca aat att tgt agt aga 506Ile Ser Thr Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ile Ser Asn Ile Cys Ser Arg115 120 125aat caa aaa gaa aat gaa caa aaa aga aat aaa caa aga tgt tta act554Asn Gln Lys Glu Asn Glu Gln Lys Arg Asn Lys Gln Arg Cys Leu Thr130 135 140caa tgt cac act tat aat atg tca cat gaa cag gac aaa cta gct aat602Gln Cys His Thr Tyr Asn Met Ser His Glu Gln Asp Lys Leu Ala Asn145 150 155gat aat aat agg aat aat aaa aag aat ttt aat tta tta ttt ata aat650Asp Asn Asn Arg Asn Asn Lys Lys Asn Phe Asn Leu Leu Phe Ile Asn160 165 170 175tat ttt aat ttg aaa cga atg aaa aat tct ctt cta aat aaa gac aat698Tyr Phe Asn Leu Lys Arg Met Lys Asn Ser Leu Leu Asn Lys Asp Asn180 185 190ttc ttt tac tgt aaa gaa aaa aaa ttg tca ttt ctg cat aag gcc tat746Phe Phe Tyr Cys Lys Glu Lys Lys Leu Ser Phe Leu His Lys Ala Tyr195 200 205aaa aaa aaa aat tgc act ttt caa aat tat agt tta aaa aga aaa tct794Lys Lys Lys Asn Cys Thr Phe Gln Asn Tyr Ser Leu Lys Arg Lys Ser210 215 220aat cgt gat tca cat aaa ttg ttt tct gga gaa ttt gac gat tat aca842Asn Arg Asp Ser His Lys Leu Phe Ser Gly Glu Phe Asp Asp Tyr Thr225 230 235aat aat aat gct tta tat gaa tcc gaa aaa aaa gaa tac att aca cta890Asn Asn Asn Ala Leu Tyr Glu Ser Glu Lys Lys Glu Tyr Ile Thr Leu240 245 250 255aat aat aat aat aaa aat aat aat aat aaa aat aat gat aat aaa aat938Asn Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn Lys Asn260 265 270aat gat aat aat gat tat aat aat aat aat agt tgt aat aat tta gga986Asn Asp Asn Asn Asp Tyr Asn Asn Asn Asn Ser Cys Asn Asn Leu Gly275 280 285gag aga tcc aat cat tat gat aat tat ggt gga gat aat aat aat cca 1034Glu Arg Ser Asn His Tyr Asp Asn Tyr Gly Gly Asp Asn Asn Asn Pro290 295 300tgt aat aat aat aat gac aaa tat gat ata gga aaa tat ttc aaa cag 1082Cys Asn Asn Asn Asn Asp Lys Tyr Asp Ile Gly Lys Tyr Phe Lys Gln305 310 315att aat acc ttt att aat att gat gaa tat aaa act ata tat ggt gat1130Ile Asn Thr Phe Ile Asn Ile Asp Glu Tyr Lys Thr Ile Tyr Gly Asp320 325 330 335gaa ata tat aaa gaa ata tat gaa cta tat gta gaa aga aat att cct1178Glu Ile Tyr Lys Glu Ile Tyr Glu Leu Tyr Val Glu Arg Asn Ile Pro340 345 350gaa tat tat gaa cga aaa tat ttt tca gaa gat att aaa aag agt gtc1226Glu Tyr Tyr Glu Arg Lys Tyr Phe Ser Glu Asp Ile Lys Lys Ser Val355 360 365cta ttt gat ata gat aaa tat aat gat gtc gaa ttt gaa aaa gct ata1274Leu Phe Asp Ile Asp Lys Tyr Asn Asp Val Glu Phe Glu Lys Ala Ile370 375 380aaa gaa gaa ttt ata aat aat gga gtt tat att aat aat ata gat aat1322Lys Glu Glu Phe Ile Asn Asn Gly Val Tyr Ile Asn Asn Ile Asp Asn385 390 395aca tat tat aaa aaa gaa aat att tta ata atg aaa aag ata tta cat1370Thr Tyr Tyr Lys Lys Glu Asn Ile Leu Ile Met Lys Lys Ile Leu His400 405 410 415tat ttc cca tta tta aaa tta att aat aat cca tca gat tta aaa aag1418Tyr Phe Pro Leu Leu Lys Leu Ile Asn Asn Pro Ser Asp Leu Lys Lys420 425 430tta aaa aaa caa tat tta cct tta tta gca cat gaa tta aaa ata ttt1466Leu Lys Lys Gln Tyr Leu Pro Leu Leu Ala His Glu Leu Lys Ile Phe435 440 445tta ttt ttt att gta aat ata aca gga ggt cat ttt tcc tct gtt tta1514Leu Phe Phe Ile Val Asn Ile Thr Gly Gly His Phe Ser Ser Val Leu450 455 460agc tct tta gaa att caa tta tta tta ttg tat att ttt aat caa cca1562Ser Ser Leu Glu Ile Gln Leu Leu Leu Leu Tyr Ile Phe Asn Gln Pro465 470 475tat gat aat gtt ata tat gat ata gga cat caa gca tat gta cat aag1610Tyr Asp Asn Val Ile Tyr Asp Ile Gly His Gln Ala Tyr Val His Lys480 485 490 495ata ttg acc gga aga aaa cta tta ttt cta tca tta aga aat aaa aaa1658Ile Leu Thr Gly Arg Lys Leu Leu Phe Leu Ser Leu Arg Asn Lys Lys500 505 510ggt att agt gga ttc cta aat att ttt gaa agt att tat gat aaa ttt 1706Gly Ile Ser Gly Phe Leu Asn Ile Phe Glu Ser Ile Tyr Asp Lys Phe515 520 525ggg gct ggt cac agt tcc act tca tta agt gct ata caa gga tat tat1754Gly Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ala Ile Gln Gly Tyr Tyr530 535 540gaa gcc gag tgg caa gtg aag aat aaa gaa aaa tat gga aat gga gat1802Glu Ala Glu Trp Gln Val Lys Asn Lys Glu Lys Tyr Gly Asn Gly Asp545 550 555ata gaa ata agt gat aac gca aat gtc acg aat aat gaa agg ata ttt1850Ile Glu Ile Ser Asp Asn Ala Asn Val Thr Asn Asn Glu Arg Ile Phe560 565 570 575caa aaa gga ata cac aat gat aat aat att aac aat aat att aat aat1898Gln Lys Gly Ile His Asn Asp Asn Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Asn580 585 590aat aat tat atc aat cct tca gat gtg gta gga aga gaa aat acg aat1946Asn Asn Tyr Ile Asn Pro Ser Asp Val Val Gly Arg Glu Asn Thr Asn595 600 605gta cca aat gta cga aat gat aac cat aac gtg gat aaa gta cac att1994Val Pro Asn Val Arg Asn Asp Asn His Asn Val Asp Lys Val His Ile610 615 620gct att ata gga gat ggt ggt tta aca ggt gga atg gca tta gaa gcg2042Ala Ile Ile Gly Asp Gly Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Leu Glu Ala625 630 635tta aat tat att tca ttc ttg aat tct aaa att tta att att tat aat2090Leu Asn Tyr Ile Ser Phe Leu Asn Ser Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Asn640 645 650 655gat aac gga caa gtt tct tta cca aca aat gcc gta agt ata tca ggt2138Asp Asn Gly Gln Val Ser Leu Pro Thr Asn Ala Val Ser Ile Ser Gly660 665 670aat aga cct ata ggt tct ata tca gat cat tta cat tat ttt gtt tct2186Asn Arg Pro Ile Gly Ser Ile Ser Asp His Leu His Tyr Phe Val Ser675 680 685aat ata gaa gca aat gct ggt gat aat aaa tta tcg aaa aat gca aaa2234Asn Ile Glu Ala Asn Ala Gly Asp Asn Lys Leu Ser Lys Asn Ala Lys690 695 700gag aat aac att ttt gaa aat ttg aat tat gat tat att ggt gtt gtg 2282Glu Asn Asn Ile Phe Glu Asn Leu Asn Tyr Asp Tyr Ile Gly Val Val705 710 715aat ggt aat aat aca gaa gag ctc ttt aaa gta tta aat aat ata aaa 2330Asn Gly Asn Asn Thr Glu Glu Leu Phe Lys Val Leu Asn Asn Ile Lys720 725 730 735gaa aat aaa tta aaa aga gct act gtt ctt cat gta cgt aca aaa aaa 2378Glu Asn Lys Leu Lys Arg Ala Thr Val Leu His Val Arg Thr Lys Lys740 745 750tcg aat gat ttt ata aat tca aag agt cca ata agt ata ttg cac tct 2426Ser Asn Asp Phe Ile Asn Ser Lys Ser Pro Ile Ser Ile Leu His Ser755 760 765ata aag aaa aat gag att ttc cct ttc gat acc act ata tta aat gga 2474Ile Lys Lys Asn Glu Ile Phe Pro Phe Asp Thr Thr Ile Leu Asn Gly770 775 780aat att cat aag gag aac aag ata gaa gaa gag aaa aat gtg tct tca 2522Asn Ile His Lys Glu Asn Lys Ile Glu Glu Glu Lys Asn Val Ser Ser785 790 795tct aca aag tat gat gta aat aat aag aat aat aaa aat aat gat aat 2570Ser Thr Lys Tyr Asp Val Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn800 805 810 815agt gaa att ata aaa tat gaa gat atg ttt tca aaa gag acg ttc aca 2618Ser Glu Ile Ile Lys Tyr Glu Asp Met Phe Ser Lys Glu Thr Phe Thr820 825 830gat ata tat aca aat gaa atg tta aaa tat tta aag aaa gat aga aat 2666Asp Ile Tyr Thr Asn Glu Met Leu Lys Tyr Leu Lys Lys Asp Arg Asn835840 845ata ata ttc cta tct ccc gct atg tta gga gga tca gga ttg gtt aaa 2714Ile Ile Phe Leu Ser Pro Ala Met Leu Gly Gly Ser Gly Leu Val Lys850 855 860att agt gag cgt tat cca aat aat gta tat gat gta ggt ata gca gaa 2762Ile Ser Glu Arg Tyr Pro Asn Asn Val Tyr Asp Val Gly Ile Ala Glu865 870 875caa cat tct gta act ttc gca gca gct atg gca atg aat aag aaa tta 2810Gln His Ser Val Thr Phe Ala Ala Ala Met Ala Met Asn Lys Lys Leu880 885 890 895aaa ata caa tta tgt ata tat tcg acc ttt tta caa aga gca tat gat 2858Lys Ile Gln Leu Cys Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp900 905 910caa att ata cat gat ctt aat tta caa aat ata cct tta aag gtt ata 2906Gln Ile Ile His Asp Leu Asn Leu Gln Asn Ile Pro Leu Lys Val Ile915 920 925att gga aga agt gga tta gta gga gag gat ggg gca aca cat caa ggt 2954Ile Gly Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asp Gly Ala Thr His Gln Gly930 935 940ata tat gat tta tct tat ctt ggg aca ctt aac aat gca tat ata ata 3002Ile Tyr Asp Leu Ser Tyr Leu Gly Thr Leu Asn Asn Ala Tyr Ile Ile945 950 955tct cca agt aat caa gtt gat ttg aaa aga gct ctt agg ttt gct tat 3050Ser Pro Ser Asn Gln Val Asp Leu Lys Arg Ala Leu Arg Phe Ala Tyr960 965 970 975tta gat aag gac cat tct gtg tat ata cgt ata ccc aga atg aac ata 3098Leu Asp Lys Asp His Ser Val Tyr Ile Arg Ile Pro Arg Met Asn Ile980 985 990tta agt gat aag tac atg aaa gga tat ttg aac att cat atg aaa aat 3146Leu Ser Asp Lys Tyr Met Lys Gly Tyr Leu Asn Ile His Met Lys Asn9951000 1005gag agc aaa aat atc gat gta aac gtg gat ata aac gat gat gta gat 3194Glu Ser Lys Asn Ile Asp Val Asn Val Asp Ile Asn Asp Asp Val Asp10101015 1020aaa tat agt gaa gaa tat atg gac gat gat aat ttt ata aaa tcg ttt 3242Lys Tyr Ser Glu Glu Tyr Met Asp Asp Asp Asn Phe Ile Lys Ser Phe102510301035att gga aaa tct aga att att aaa atg gat aat gaa aat aat aat aca 3290Ile Gly Lys Ser Arg Ile Ile Lys Met Asp Asn Glu Asn Asn Asn Thr1040 104510501055aat gaa cat tat tca agc aga gga gat aca cag aca aaa aaa aaa aaa 3338Asn Glu His Tyr Ser Ser Arg Gly Asp Thr Gln Thr Lys Lys Lys Lys10601065 1070gtt tgt atc ttt aac atg ggt agt atg ctt ttt aat gta att aat gct 3386Val Cys Ile Phe Asn Met Gly Ser Met Leu Phe Asn Val Ile Asn Ala10751080 1085ata aaa gaa att gaa aaa gaa caa tat att tca cat aat tat tct ttt 3434Ile Lys Glu Ile Glu Lys Glu Gln Tyr lle Ser His Asn Tyr Ser Phe10901095 1100tca att gtt gat atg ata ttt tta aat cct tta gat aaa aat atg ata 3482Ser Ile Val Asp Met Ile Phe Leu Asn Pro Leu Asp Lys Asn Met Ile1105 1110 1115gat cat gta ata aaa caa aat aaa cat caa tat tta att act tat gaa 3530Asp His Val Ile Lys Gln Asn Lys His Gln Tyr Leu Ile Thr Tyr Glu1120112511301135gat aat act ata ggt ggt ttt tct aca cat ttc aat aat tat tta ata 3578Asp Asn Thr Ile Gly Gly Phe Ser Thr His Phe Asn Asn Tyr Leu Ile1140 11451150gaa aat aat tat att aca aaa cat aac tta tat gtt cat aat att tat 3626Glu Asn Asn Tyr Ile Thr Lys His Asn Leu Tyr Val His Asn Ile Tyr1155 11601165tta tct aat gag cca att gaa cat gca tct ttt aag gat caa caa gaa 3674Leu Ser Asn Glu Pro Ile Glu His Ala Ser Phe Lys Asp Gln Gln Glu117011751180gtc gtc aaa atg gat aaa tgt agt ctt gtc aat aga att aaa aat tat 3722Val Val Lys Met Asp Lys Cys Ser Leu Val Asn Arg Ile Lys Asn Tyr1185 11901195ctt aaa aat aat cct aca tgatgtaaga taaatatata tttctaaaat 3770Leu Lys Asn Asn Pro Thr1200 1205tatttttttt ttatacttta atgtgtacaa taaaatatat atctaaatat attttatttg 3830tacgcttttt tttttttttt tttaattgtt atttttgtat at3872<210>4<211>1205<212>PRT<213>恶性疟原虫<400>4Met Ile Phe Asn Tyr Val Phe Phe Lys Asn Phe Val Pro Val Val Leu15 10 15Tyr Ile Leu Leu Ile Ile Tyr Ile Asn Leu Asn Gly Met Asn Asn Lys20 25 30Asn Gln Ile Lys Thr Glu Lys Ile Tyr Ile Lys Lys Leu Asn Arg Leu35 40 45Ser Arg Lys Asn Ser Leu Cys Ser Ser Lys Asn Lys Ile Ala Cys Leu50 55 60Phe Asp Ile Gly Asn Asp Asp Asn Arg Asn Thr Thr Tyr Gly Tyr Asn65 70 75 80Val Asn Val Lys Asn Asp Asp Ile Asn Ser Leu Leu Lys Asn Asn Tyr85 90 95Ser Asn Lys Leu Tyr Met Asp Lys Arg Lys Asn Ile Asn Asn Val Ile100 105 110Ser Thr Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ile Ser Asn Ile Cys Ser Arg Asn115 120 125Gln Lys Glu Asn Glu Gln Lys Arg Asn Lys Gln Arg Cys Leu Thr Gln130 135 140Cys His Thr Tyr Asn Met Ser His Glu Gln Asp Lys Leu Ala Asn Asp145 150 155 160Asn Asn Arg Asn Asn Lys Lys Asn Phe Asn Leu Leu Phe Ile Asn Tyr165 170 175Phe Asn Leu Lys Arg Met Lys Asn Ser Leu Leu Asn Lys Asp Asn Phe180 185 190Phe Tyr Cys Lys Glu Lys Lys Leu Ser Phe Leu His Lys Ala Tyr Lys195 200 205Lys Lys Asn Cys Thr Phe Gln Asn Tyr Ser Leu Lys Arg Lys Ser Asn210 215 220Arg Asp Ser His Lys Leu Phe Ser Gly Glu Phe Asp Asp Tyr Thr Asn225 230 235 240Asn Asn Ala Leu Tyr Glu Ser Glu Lys Lys Glu Tyr Ile Thr Leu Asn245 250255Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn Lys Asn Asn260 265 270Asp Asn Asn Asp Tyr Asn Asn Asn Asn Ser Cys Asn Asn Leu Gly Glu275 280285Arg Ser Asn His Tyr Asp Asn Tyr Gly Gly Asp Asn Asn Asn Pro Cys290 295 300Asn Asn Asn Asn Asp Lys Tyr Asp Ile Gly Lys Tyr Phe Lys Gln Ile305 310 315 320Asn Thr Phe Ile Asn Ile Asp Glu Tyr Lys Thr Ile Tyr Gly Asp Glu325 330 335Ile Tyr Lys Glu Ile Tyr Glu Leu Tyr Val Glu Arg Asn Ile Pro Glu340 345 350Tyr Tyr Glu Arg Lys Tyr Phe Ser Glu Asp Ile Lys Lys Ser Val Leu355 360 365Phe Asp Ile Asp Lys Tyr Asn Asp Val Glu Phe Glu Lys Ala Ile Lys370 375 380Glu Glu Phe Ile Asn Asn Gly Val Tyr Ile Asn Asn Ile Asp Asn Thr385 390 395 400Tyr Tyr Lys Lys Glu Asn Ile Leu Ile Met Lys Lys Ile Leu His Tyr405 410 415Phe Pro Leu Leu Lys Leu Ile Asn Asn Pro Ser Asp Leu Lys Lys Leu420 425 430Lys Lys Gln Tyr Leu Pro Leu Leu Ala His Glu Leu Lys Ile Phe Leu435 440 445Phe Phe Ile Val Asn Ile Thr Gly Gly His Phe Ser Ser Val Leu Ser450 455 460Ser Leu Glu Ile Gln Leu Leu Leu Leu Tyr Ile Phe Asn Gln Pro Tyr465 470 475 480Asp Asn Val Ile Tyr Asp Ile Gly His Gln Ala Tyr Val His Lys Ile485 490 495Leu Thr Gly Arg Lys Leu Leu Phe Leu Ser Leu Arg Asn Lys Lys Gly500 505 510Ile Ser Gly Phe Leu Asn Ile Phe Glu Ser Ile Tyr Asp Lys Phe Gly515 520 525Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ala Ile Gln Gly Tyr Tyr Glu530 535 540Ala Glu Trp Gln Val Lys Asn Lys Glu Lys Tyr Gly Asn Gly Asp Ile545 550 555 560Glu Ile Ser Asp Asn Ala Asn Val Thr Asn Asn Glu Arg Ile Phe Gln565 570 575Lys Gly Ile His Asn Asp Asn Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Asn Asn580 585 590Asn Tyr Ile Asn Pro Ser Asp Val Val Gly Arg Glu Asn Thr Asn Val595 600 605Pro Asn Val Arg Asn Asp Asn His Asn Val Asp Lys Val His Ile Ala610 615 620Ile Ile Gly Asp Gly Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Leu Glu Ala Leu625 630 635 640Asn Tyr Ile Ser Phe Leu Asn Ser Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Asn Asp645 650 655Asn Gly Gln Val Ser Leu Pro Thr Asn Ala Val Ser Ile Ser Gly Asn660 665 670Arg Pro Ile Gly Ser Ile Ser Asp His Leu His Tyr Phe Val Ser Asn675 680 685Ile Glu Ala Asn Ala Gly Asp Asn Lys Leu Ser Lys Asn Ala Lys Glu690 695 700Asn Asn Ile Phe Glu Asn Leu Asn Tyr Asp Tyr Ile Gly Val Val Asn705 710 715 720Gly Asn Asn Thr Glu Glu Leu Phe Lys Val Leu Asn Asn Ile Lys Glu725 730 735Asn Lys Leu Lys Arg Ala Thr Val Leu His Val Arg Thr Lys Lys Ser740 745 750Asn Asp Phe Ile Asn Ser Lys Ser Pro Ile Ser Ile Leu His Ser Ile755 760 765Lys Lys Asn Glu Ile Phe Pro Phe Asp Thr Thr Ile Leu Asn Gly Asn770 775 780Ile His Lys Glu Asn Lys Ile Glu Glu Glu Lys Asn Val Ser Ser Ser785 790 795 800Thr Lys Tyr Asp Val Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Asp Asn Ser805 810 815Glu Ile Ile Lys Tyr Glu Asp Met Phe Ser Lys Glu Thr Phe Thr Asp820 825 830Ile Tyr Thr Asn Glu Met Leu Lys Tyr Leu Lys Lys Asp Arg Asn Ile835 840 845Ile Phe Leu Ser Pro Ala Met Leu Gly Gly Ser Gly Leu Val Lys Ile850 855 860Ser Glu Arg Tyr Pro Asn Asn Val Tyr Asp Val Gly Ile Ala Glu Gln865 870 875 880His Ser Val Thr Phe Ala Ala Ala Met Ala Met Asn Lys Lys Leu Lys885 890 895Ile Gln Leu Cys Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp Gln900 905 910Ile Ile His Asp Leu Asn Leu Gln Asn Ile Pro Leu Lys Val Ile Ile915 920 925Gly Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asp Gly Ala Thr His Gln Gly Ile930 935 940Tyr Asp Leu Ser Tyr Leu Gly Thr Leu Asn Asn Ala Tyr Ile Ile Ser945 950 955 960Pro Ser Asn Gln Val Asp Leu Lys Arg Ala Leu Arg Phe Ala Tyr Leu965 970 975Asp Lys Asp His Ser Val Tyr Ile Arg Ile Pro Arg Met Asn Ile Leu980 985 990Ser Asp Lys Tyr Met Lys Gly Tyr Leu Asn Ile His Met Lys Asn Glu99510001005Ser Lys Asn Ile Asp Val Asn Val Asp Ile Asn Asp Asp Val Asp Lys101010151020Tyr Ser Glu Glu Tyr Met Asp Asp Asp Asn Phe Ile Lys Ser Phe Ile1025 103010351040Gly Lys Ser Arg Ile Ile Lys Met Asp Asn Glu Asn Asn Asn Thr Asn1045 1050 1055Glu His Tyr Ser Ser Arg Gly Asp Thr Gln Thr Lys Lys Lys Lys Val1060 10651070Cys Ile Phe Asn Met Gly Ser Met Leu Phe Asn Val Ile Asn Ala Ile10751080 1085Lys Glu Ile Glu Lys Glu Gln Tyr Ile Ser His Asn Tyr Ser Phe Ser1090 10951100Ile Val Asp Met Ile Phe Leu Asn Pro Leu Asp Lys Asn Met Ile Asp1105 111011151120His Val Ile Lys Gln Asn Lys His Gln Tyr Leu Ile Thr Tyr Glu Asp1125 11301135Asn Thr Ile Gly Gly Phe Ser Thr His Phe Asn Asn Tyr Leu Ile Glu114011451150Asn Asn Tyr Ile Thr Lys His Asn Leu Tyr Val His Asn Ile Tyr Leu1155 11601165Ser Asn Glu Pro Ile Glu His Ala Ser Phe Lys Asp Gln Gln Glu Val117011751180Val Lys Met Asp Lys Cys Ser Leu Val Asn Arg Ile Lys Asn Tyr Leu118511901195 1200Lys Asn Asn Pro Thr120权利要求
1.用于获得适于治疗由单细胞或多细胞寄生虫导致的感染性疾病的化学活性成分的方法，其特征在于将参与1-脱氧-D-木酮糖-5-膦酸代谢途径的蛋白质或其类似作用衍生物与待检测活性成分接触，以确定其对寄生虫的活性，并选择抑制所述蛋白质或其衍生物的活性成分。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述蛋白质参与下述步骤a)-i)中的至少一个步骤，a)转化甘油醛和丙酮酸成为1-脱氧-D-木酮糖，b)转化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成异戊烯二磷酸，c)形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，d)转化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，e)转化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，f)形成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，g)转化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸成为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，h)转化2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，i)转化2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸成为异戊烯二磷酸。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述活性成分抑制所涉及的酶或辅因子的产生、特别是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶或1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的转化，或者所述活性成分促进所涉及的酶或辅因子的降解。
4.参与1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸代谢途径的具有或不具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶活性的蛋白质，其a)由图1b和2b所示的DNA序列编码，或b)由与图1b或2b所示的DNA序列或这些DNA序列的片段在编码成熟蛋白的DNA区域杂交的DNA序列编码。
5.参与1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸代谢途径的具有或不具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶活性的蛋白质，其特征在于其a)由图1a和2a所示的DNA序列编码，或b)由与图1a或2a所示的DNA序列或这些DNA序列的片段在编码成熟蛋白的DNA区域杂交的DNA序列编码。
6.权利要求4或5的蛋白质以及参与1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸代谢途径的另外的蛋白质，其特征在于它们可用层析和电泳技术从寄生虫的培养物上清或消化的寄生虫中获得。
7.权利要求4-6任一项的蛋白质，其特征在于其a)是外源DNA的原核或真核表达产物，b)由序列1a,1b,2a或2b编码，或由与图1a,1b,2a或2b所示的DNA序列或这些DNA序列的片段在编码成熟蛋白的DNA区域杂交的DNA序列编码，或c)由与b)所定义的序列非经遗传密码的简并性而杂交并编码具有相应氨基酸序列的多肽的DNA序列所编码。
8.权利要求4-7任一项的蛋白质，其特征在于其由序列2a,2b,3a或3b的氨基酸组成。
9.权利要求4-8任一项的蛋白质，其特征在于所述蛋白质是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶或1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。
10.编码权利要求4-9任一项的蛋白质的核酸，其特征在于其选自a)图1a,1b,2a和2b所示的DNA序列或其互补序列，b)与a)中的序列杂交的核酸序列，c)与a)或b)所述的序列之一非经遗传密码简并性而杂交的核酸序列。
11.DNA，其特征在于其具有选自图1a所示序列、图1b所示序列、图2a所示序列和图2b所示序列的序列。
12.含有编码权利要求4-9任一项的蛋白质的DNA的重组表达载体，其在转化的微生物或转化真核细胞或在动物或植物中表达编码该蛋白质的DNA。
13.宿主细胞，特别是原核宿主细胞、真核宿主细胞、动物和植物，其被编码权利要求4-9任一项的蛋白质的DNA转染并能产生所述蛋白质。
14.权利要求13的宿主细胞，其是大肠杆菌或哺乳动物细胞系。
15.编码权利要求4-9任一项的蛋白质的DNA在转染原核或真核生物体中的应用。
16.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于经层析和电泳技术从寄生虫或寄生虫培养物的上清中获得所述蛋白质。
17.权利要求1-3和16任一项的方法，其特征在于所述蛋白质通过在合适的宿主细胞中表达编码权利要求4-9任一项的蛋白质的DNA并从宿主细胞或宿主细胞培养物上清中分离所述蛋白质而重组产生。
18.权利要求4-8任一项的来自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸代谢途径的蛋白质用作抗原或免疫原以产生结合此蛋白质的抗体。
19.抗权利要求4-9任一项的来自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸代谢途径的蛋白质的抗体，其可通过体外免疫技术获得，或通过用前述任一项权利要求的蛋白质免疫动物并从免疫动物的血清或脾细胞分离抗体而获得。
20.权利要求4-9任一项的蛋白质用于鉴别抗寄生虫活性物质。
21.权利要求19的抗体用于鉴别抗寄生虫活性物质。
22.鉴别编码权利要求4-9任一项的蛋白质的核酸的方法，其特征在于将待研究的样品与选自如下一组的核酸探针保温，所述的组为a)图1a或1b所示的DNA序列或其互补序列，b)与a)序列之一杂交的核酸，所述的核酸探针与样品的核酸保温并且杂交任选地经核酸探针的另外的结合配偶体而检测。
23.权利要求23的方法，其特征在于待检测的核酸在检测前扩增。
24.用于鉴别抗寄生虫活性物质的测试系统，其含有前述任一项权利要求的蛋白质。
25.用于生产治疗由单细胞或多细胞寄生虫导致的感染性疾病的药物组合物的活性成分，其特征在于其用权利要求24的测试系统鉴别。
26.用于生产杀虫剂或治疗由细菌导致的感染性疾病的药物组合物的活性成分，其特征在于其用权利要求24的测试系统鉴别。
27.用于生产治疗由单细胞或多细胞寄生虫导致的感染性疾病的药物组合物的活性成分，其特征在于其抑制1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸代谢途径的酶或辅因子。
28.权利要求25或27的活性成分，其特征在于其抑制下述步骤a)-i)中的至少一个步骤，a)转化甘油醛和丙酮酸成为1-脱氧-D-木酮糖，b)转化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成异戊烯二磷酸，c)形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，d)转化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，e)转化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸，f)形成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，g)转化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸成为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，h)转化2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸，i)转化2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸成为异戊烯二磷酸。
29.权利要求25、27或28的活性成分，其特征在于所述活性成分抑制所涉及的酶或辅因子的产生、特别是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶或1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的转化，或者所述活性成分促进所涉及的酶或辅因子的降解。
30.权利要求25-27任一项的活性成分，其特征在于所述活性成分是3-(N-乙酰基-N-羟基氨基)-丙基膦酸酯或3-(N-甲酰基-N-羟基氨基)-丙基膦酸酯。
31.权利要求25、27-30任一项的活性成分在生产治疗由单细胞或多细胞寄生虫导致的感染性疾病、特别是疟疾、昏睡病和利什曼病的药物组合物中的应用。
32.权利要求31的应用，其特征在于所述的药物组合物还包括选自脂肪代谢途径、胆固醇合成或胆固醇吸收的抑制剂的一或多个组分。
33.权利要求32的应用，其特征在于脂肪代谢的抑制剂是HMG-CoA还原酶抑制剂或HMG-CoA合酶抑制剂，特别是洛伐他汀、美伐他汀、Compactin、辛伐他汀、普伐他汀、Atorvastatin、Fluvastatin、Cerivastatin。
全文摘要
本发明涉及获得适于治疗由单细胞或多细胞寄生虫导致的感染性疾病的化学活性成分的方法。在此方法中,参与1－脱氧－D－木酮糖－5－膦酸代谢途径的蛋白质或其类似活性衍生物与待检测活性成分接触,以确定其对寄生虫的活性,并选择抑制所述蛋白质或其衍生物的活性成分。本发明还涉及所发现的用于产生抗寄生虫感染的药物组合物的活性成分。
文档编号A61P33/00GK1297532SQ99805023
公开日2001年5月30日 申请日期1999年4月13日 优先权日1998年4月14日
发明者朱马·哈桑 申请人:朱马·哈桑