专利名称：一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的rt-pcr法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一对能快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法。属兽用生物制品技术领域。
背景技术：
2010年4月以来，我国浙江、江苏、山东、福建、河北、北京等省份的蛋鸭发生
一种以产蛋率急速下降、甚至停产及不同程度死亡为特征的疫病，俗称蛋鸭产蛋骤降、卵巢出血症，亦称为“鸭黄病毒感染”，现命名为鸭出血性卵巢炎(Duckhemorrhagi covaritis, DH0) 0各品种蛋鸭、种鸭、鹅等家禽均有发生，但主要见于开产蛋鸭。产蛋鸭发病后出现长时间(40— 60d)的产蛋率低下，恢复后所产种蛋的受精率和孵化率出现下降。发病鸭群采食量显著下降，拉绿色稀便，精神沉郁，扎堆，羽毛逆立，眼球深陷，目光呆滞，体重 减轻。少量病鸭出现站立不稳、震颤，行走困难和姿势异常。主要病变为出血性卵巢炎、间质性肝炎和非化脓性脑炎。该病近期成为危害中国养鸭业的重要疫病之一。产蛋率高的鸭群患病后4 5(1从产蛋高峰或高产蛋率迅速下降至209Γ30%，严重的于发病后7d左右停产；刚开产蛋鸭产蛋率上升缓慢或减蛋，长时间低产蛋率或无产蛋高峰出现。不同地区、不同品种鸭群发病率高低不一，群发病率几乎100%，病死率0°/Γ 2%。由于是新发传染病，人们对DHOV及由其感染导致的发病认识很不充分。众所周知黄病毒有3种结构蛋白(C、prM和E蛋白)与7种非结构蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)，其中，E蛋白表面的抗原表位与病毒对宿主细胞的嗜性、受体结合和致病性有关。
发明内容
通常黄病毒RT-PCR的检测靶基因为NS5。而本发明的目的是本发明通过检测DHOV的E基因作为靶基因，对鸭出血性卵巢炎的病毒和有关样品进行快速检测，同时可基于检测开展对该病的流行病学调查和病原遗传演化研究。本发明采用的技术方案如下(I)用常规病毒核酸提取方法提取疑似鸭出血性卵巢炎病例的肝脏、卵巢组织样品中的可能含有的DHOV总RNA ；(2) RT反应20 μ L体系，各组分包括DHOV总RNA 3 μ L、AFVTR I μ L、5X反转录Buffer 4μ L、含Mg2+的dNTP 4 μ L、RNA酶抑制剂O. 5 μ L、反转录酶O. 5 μ L，最后用灭菌双蒸水或灭菌DEPC水补足反应体积至20 μ L，瞬时离心后室温平衡5 lOmin，在42°C保温
I.5h，即可获得用于PCR扩增的cDNA ；(3)PCR扩增反应 25 μ L体系，各组分包括 10XPCR Buffer2. 5 μ L、含Mg2+的 dNTP
2μ L、引物 AFVTF 和 AFVTR 各 O. 5 μ L、rTaq 酶 O. 5 μ L、cDNA 3 μ L、加灭菌双蒸水至 25 μ L。反应程序为95°C变性5min，32X (94°C 45s,55°C 45s, 72°C 50s)个循环反应，最后72°C延伸IOmin ;其中AFVTF和AFVTR是针对黄病毒基因组E基因设计的一对引物，这对引物的序列为AFVTF :5’-TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’AFVTR :5’-TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3’ ；(4)电泳检测PCR反应结束后，取5 10 μ L扩增产物用1%的琼脂糖凝胶，在100V、45飞Omin条件下进行电泳，进行观察、照相和记录结果。具体实施方法I. RT-PCR方法的建立(I)引物设计登录GenBank，分别下载了 51个具有代表性的黄病毒全基因组序列及5个禽源黄病毒株的全部或部分E基因序列，经DNAstar7. O软件分析后，利用Primer5. O软件自主设计了 I对检测引物(扩增片段约549bp,见序列3)AFVTF : 5’-TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’，AFVTR : 5’-TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3’， 以上引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。(2)对照用毒株DHOV-JN株(本发明人分离和鉴定)作为阳性对照；禽流感病毒(Avianinfluenzavirus, AIV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、减蛋综合症病毒(Chickenegg down syndrome virus, EDSV)、鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus, DHV)、传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)、传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus, IBV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duckreovirusis, MDRV)以及禽网状内皮增生症病毒(Avian reticuloendotheliosis virus, REV),作为参考病毒毒株,为本发明人所在单位保存并提供。(3)样本的处理共16份样品，采集自山东省某发病鸭场，每份样品主要包括鸭的肝脏、卵巢组织等。将每份样品剪取5. Og组织，加入少量的MEM (含青霉素、链霉素1000U/mL)，研磨至糊状，再加入4倍体积的MEM稀释成悬浊液，样品在-80°C和室温反复冻融3次，再经4°C、12000rpm/min离心lOmin，收集上清液分装后_80°C冻存备用。(4)病毒核酸的提取用常规的酚氯仿法/或用TRIzol/或市售RNA提取试剂盒提取样品中的病毒核。酸如按照Invitrogen公司生产的Trizol LS Reagent说明书分别提取上述16份样品中可能含有的DHOV总RNA，_80°C保存备用。(5 ) RT-PCR反应体系及程序RT反应用20 μ L体系，取鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritisvirus，DH0V) DHOV-JN株(本发明人分离和鉴定，该株病毒已于2012年3月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏号为CGMCC No. 5907)总RNA3 μ L，加入下游引物AFVTR I μ L、dNTP4y L、Rnase-InhibitorO. 5μ L、AMV0. 5μ L、5XAMV Buffer4 μ L，加 DEPC H2O 至 20 μ L，42°C Ih 即得 cDNA 模板。PCR 反应用 25 μ L 体系10 X PCR Buffer 2. 5 μ L, dNTPs 2yL、上下游引物各0.5 μ L、rTaq 0· 5 μ L、cDNA 3 μ L、加灭菌水至25 μ L。通过梯度PCR，筛选出最佳的PCR退火温度为55°C 45s，具体反应条件是RT反应用20 yL体系，取DHOV-JN株RNA作模板3 μ L，加入下游引物I μ L、dNTP4 μ L、Rnase-Inhibitor O. 5 μ L、AMV0. 5 μ L、5 X AMV Buffer 4 μ L，加 DEPC H2O 至 20 μ L，42°C Ih即得cDNA模板。PCR反应用25μ L体系10XPCR Buffer2. 5 μ L、dNTPs 2yL、上下游引物各 0· 5 μ L、rTaq 0· 5 μ L、cDNA 3 μ L、加灭菌水至 25 μ L。反应程序95°C变性 5min ;94°C 45s，55°C 45s，72°C 50s，共 32 个循环；最后72°C延伸IOmin,是否结束应看所加DNA分子量标记物是否已分开(便于确认分子量大小)。反应完成，取5μ L PCR产物用1%琼脂糖凝胶、100V、45min电泳，电泳结束后对用非致癌性的核酸染料(如GoodView 、Gelred、Goldenview等,可在配制凝胶时加入)对凝胶染色，然后用紫外透射仪(最好用凝胶成像分析仪)进行观察、以鉴定有无目的549bp片段出现，并照相(见附图I)。根据DNA分子量标记物的各条带大小判断PCR扩增结果，如果待检样品经RT-PCR 检测出现约549bp大小的片断，在阳性对照、阴性对照扩增结果均成立的情况下，可以判定该样品DHOV核酸阳性。2.特异性试验用上节确定的最佳条件分别对阳性对照(即DH0V)及其他相关的8种病毒进行RT-PCR检测，对其特异性进行评价。即用确定的DH0VRT-PCR条件对阳性对照JN分离株、其他8个参考毒株进行了 RT-PCR扩增，取PCR产物5 μ L，在1%琼脂糖凝胶上电泳。回收549bp的目的条带，用上海生工生物工程技术服务有限公司生产的DNA胶回收试剂盒回收目的片段进行测序，并与黄病毒代表成员的E基因相应核酸片断进行多序列比较，以进一步验证本方法的特异性。结果仅有阳性对照有预期的549bp目的条带出现(附图2第10道)，其他8个参考毒株没有目的条带出现，说明本方法的特异性极佳，见附图2。3.敏感性试验将所提取的DHOV-JN总RNA进行定量，10倍梯度连续稀释(10-1 10-8)，按上述PCR反应进行扩增，测定模板最低检出量，判定该RT-PCR方法的敏感度。用设计的特异性引物对不同浓度的鸭出血性卵巢炎病毒RNA反转录的cDNA进行扩增，结果可见本法能检测出20pg病毒核酸(见附图3第4-7道)。4.临床样品的检测对16份疑似鸭出血性卵巢炎病毒感染的样品按照建立并优化的RT-PCR方法进行检测，有6份阳性，经克隆测序表明均是阳性目的判断扩增，发病的阳性率为37. 5%。(见附图4中第6、7、12、14、16和17道)注本发明所用试剂为Trizol LS Reagent购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、Rnase_Inhibitor、rTaq等PCR反应试剂、DL 2 000 DNA Marker均购自宝生物(大连)工程有限公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
图I DHOV-JN株RT-PCR检测的各个退火温度的电泳结果M道DL2000Marker; I道530C ;2 道 53.5°C ;3 道 54°C ;4 道 54.5°C ;5 道 55°C ;6 道 55.5°C ;7 道，阴性对照。图2特异性实验电泳结果1道阳性对照；M道DL 2000Marker; 2道AIV; 3道NDV; 4 道 EDSV; 5 道 DHV; 6 道 IBDV; 7 道 IBV; 8 道 MDRV; 9 道 REV; IO 道 DHOV-JN。图3各稀释梯度敏感性试验电泳结果1道阳性对照；M道DL 2000Marker;2道1(Γ8;3 道 1(Γ7;4 道 10'5 道 1(Γ5;6 道 1(Γ4;7 道 1(Γ3;8 道 1(Γ2;9 道 10'图4应用性检测结果1道阳性对照^道01^ 2000Marker;2 17道为待检疑似DHO发病样品样品。其中6道，7道，12道，14道，16道，17道为DHO样品检测阳性。
本发明涉及的微生物鸭出血性卵巢炎病毒(Duckhemorrhagic ovaritis virus, DHOV) DH0V-JN 株(本发明人分离和鉴定，该株病毒已于2012年3月22日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏号为 CGMCC No. 5907);禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)、新城疫病毒(Newcastledisease virus, NDV)、减蛋综合症病毒(Chicken egg downsyndrome virus, EDSV)、鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)、传染性法氏囊病毒(Infectious BursalDisease Virus, IBDV)> 传染性支气管炎病毒 (InfectiousBronchitis Virus, IBV)> 番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirusis, MDRV)以及禽网状内皮增生症病毒(Avianreticuloendotheliosis virus, REV),作为参考病毒毒株，为本发明人所在单位保存。本发明的积极意义本发明涉及一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法。作为一种非常具有特异性、敏感性及重复性的畜禽疫病快速检测技术，RT-PCR方法已广泛应用于多种黄病毒属特异性诊断，但通常检测的靶基因主要是NS5。本研究在现已公开发表的代表性黄病毒株E基因序列比较基础上，设计了具有通用性的针对黄病毒E基因核酸序列的特异性引物对，建立RT-PCR方法。该方法具有较好的特异性，能最低检测到20pg黄病毒，具有极好的重复性。本发明建立的DHOV RT-PCR检测方法为该病的快速检测提供了一种可靠方法，这对于本病的实验室检测/诊断，流行病学调查及病原遗传演化研究提供了较好的方法基础，具有重要意义。
权利要求
1. 一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒的RT-PCR法，其特征在于该方法为 (1)用常规病毒核酸提取方法提取疑似鸭出血性卵巢炎病例的肝脏、卵巢组织样品中的可能含有的DHOV总RNA ； (2)RT (反转录)反应20 μ L体系，各组分包括DHOV总RNA 3 μ L、AFVTRl μ L、5X反转录Buffer 4μ L、含Mg2+的dNTP 4 μ L、RNA酶抑制剂0. 5 μ L、反转录酶0. 5 μ L，最后用灭菌双蒸水或灭菌DEPC水补足反应体积至20 μ L，瞬时离心后室温平衡5 lOmin，在42°C保温I.5h，即可获得用于PCR扩增的cDNA ； (3)PCR(聚合酶链式扩增)扩增反应25 μ L体系，各组分包括IOXPCR Buffer2. 5 μ L、含 Mg2+ 的 dNTP 2 μ L、弓丨物 AFVTF 和 AFVTR 各 O. 5 μ L、rTaq 酶 O. 5 μ L、cDNA 3 μ L、加灭菌双蒸水至25 μ L。反应程序为95°C变性5min，32X (94°C 45s、55°C 45s，72°C 50s)个循环反应，最后72°C延伸IOmin ;其中AFVTF和AFVTR是针对黄病毒基因组E基因设计的一对引物，这对引物的序列为AFVTF :5’-TTACCATGGACAGGGTCATCA-3’AFVTR 5’-TCCAATTGTGCTCCCACTTCT-3'； (4)电泳检测PCR反应结束后，取5 10 μ L扩增产物用1%的琼脂糖凝胶，在100V、45飞Omin条件下进行电泳，进行观察、照相和记录结果。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritis virus,DHOV)的RT-PCR法。作为一种非常具有特异性、敏感性及重复性的畜禽疫病快速检测技术，RT-PCR方法已广泛应用于多种黄病毒属特异性诊断，但通常检测的靶基因主要是NS5。本发明是在现已公开发表的51个具有代表性的黄病毒株的E基因序列比较基础上，设计了通用性的针对黄病毒E基因核酸序列的特异性引物对，建立了RT-PCR方法。该方法具有较好的特异性,能最低检测到20pg黄病毒,也具有极好的重复性。本发明建立的DHOV RT-PCR检测方法为该病的快速检测提供了一种可靠方法，这对于本病的实验室检测、诊断、流行病学调查及病原遗传演化研究提供了较好的方法基础，具有重要意义。
文档编号C12Q1/70GK102876815SQ20121042815
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者邹敏, 吴发兴, 刘新文, 胡潇, 范根成, 杜元钊 申请人:青岛易邦生物工程有限公司