过氧化氢抑制igf-1促存活功能的体外研究的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，本发明公开了过氧化氢对IGF-1促存活功能的抑制作用，以PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)为研究对象，以剥夺血清作为模型，IGF-1（胰岛素样生长因子-1）用于保护PC12免受剥夺血清造成的损伤，促进PC12细胞存活。而IGF-1处理前预先加入不同浓度的H2O2（过氧化氢），MTT（噻唑蓝法）检测细胞存活力，结果显示剥夺血清可以明显的降低细胞的存活能力，而IGF-1可以剂量依赖性的保护PC12细胞对抗剥夺血清带来的损伤，而H2O2可以剂量依赖性的抑制IGF-1的这种促存活功能。
【专利说明】过氧化氢抑制IGF-1促存活功能的体外研究
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，涉及一种过氧化氢抑制PC12细胞活力的可能机制，即抑制了 IGF-1的促存活功能。
【背景技术】
[0002]需氧细胞在代谢过程中会产生一系列活性氧簇(reactive oxygen species,R0S)，包括超氧阴离子[.02_]、过氧化氢[H2O2]以及羟自由基[.0Η]等，它们的性质极其活跃，会严重地损害生物膜、酶类、蛋白质和核酸等生物大分子，已有的研究表明肿瘤、衰老、心脑血管等许多疾病的发生与ROS的存在有着密切联系。随着自由基生物学研究的发展，人们逐渐认识到ROS可以双向调控某些肿瘤细胞的凋亡与增殖，并发现了活性氧自由基与细胞信号转导之间的内在关联。最新研究发现，低浓度的活性氧自由基能够影响一系列信号转导途径。机体内的活性氧自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡，除了引起细胞凋亡、坏死的功能外，低浓度的ROS更广泛的生理意义在于其对转录因子的激活以及对细胞增殖、分化的促进。
[0003]胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1)是一种在肝脏合成的营养因子，其生物学功能广泛，在中枢神经系统具有促进神经细胞增殖、分化，促进神经元存活的功能，而这些生物学功能都依赖其高亲和力受体IGF-1R来发挥。IGF-1R敲除的转基因小鼠较正常小鼠体重减少约45%，在出生后死于多器官的发育异常，其中神经系统发育缺陷是导致转基因小鼠死亡的重要原因，这显示出IGF-1在中枢神经系统中的重要作用。促神经元存活是IGF-1在中枢神经系统最重要的生物学功能之一，国外许多研究已表明IGF-1能够对抗多种原因导致的细胞损伤，如血清剥夺导致的神经元凋亡，6-羟基多巴胺引起的神经毒性，低钾诱导的凋亡，脑缺血以及谷氨酸的神经兴奋性毒性等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于探讨过氧化氢对IGF-1促存活功能的作用，提供一种过氧化氢降低PC12细胞存活、诱导细胞凋亡的可能机制。以PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)为研究对象，以剥夺血清作为模型，IGF-1 (胰岛素样生长因子-1)用于保护PC12免受剥夺血清造成的损伤，促进PC12细胞存活。而给予IGF-1处理前预先加入不同浓度的H2O2(过氧化氢)，MTT (噻唑蓝法)检测细胞存活力，结果显示剥夺血清可以明显的降低细胞的存活能力，而IGF-1可以剂量依赖性的保护PC12细胞对抗剥夺血清带来的损伤，而H2O2可以剂量依赖性的抑制IGF-1的这种促存活功能。
【具体实施方式】
[0005]本发明具体的操作步`骤如下:
1、细胞的培养 PC12细胞来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，广泛用于神经系统疾病的体外研究，培养于含有5%FBS、5%HS、1%PSA的DMEM培养基中，于37°C、5%C02条件下培养，待细胞长满后，用含1%FBS、1%PSA的DMEM培养基接种于96孔和24小时后对细胞进行处理。
[0006]2、细胞处理处理前先将细胞换液成纯DMEM lhour，然后正常组换成DMEM+1.5%FBS,剥夺血清模型组采用纯DMEM，IGF-1给药组给予(2.5ng/ml、25.0ng/ml,50.0ng/ml、100.0ng/ml)IGF-1，继续培养24小时后MTT法检测细胞活力 '考察H2O2对IGF-1促存活功能的作用是先用不同浓度(10 μ M，30 μ M，100 μ M，200 μ M，400 μ M)的H2O2预处理细胞I小时，再加入IGF-1处理。[0007]3、ΜΤΤ检测细胞活力将细胞以0.5 X105/ml接种于96孔培养板，100 μ I/孔，在37 V 5% CO2条件下培养过夜后，按分组要求给以不同处理因素，每组设8个平行复孔。培养24 h后，每孔加入终浓度为0.5 mg/ml的MTT 100 μ I，再培养5 h，倾去培养液，加DMSO 100 μ I/孔，待甲瓒结晶完全溶解后，用酶联免疫仪在波长570nm处读取每孔吸光度(A)。取8孔A值的均数按公式计算细胞存活率=(试验孔A均值/对照孔A均值)X100 %。重复3次。
【权利要求】
1.过氧化氢抑制IGF-I促存活功能的体外研究，其特征在于以PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）为研究对象，以剥夺血清作为模型，考察IGF-I (胰岛素样生长因子-I)对PC12细胞的促存活功能，不同浓度过氧化氢预处理研究其对IGF-I促存活功能的抑制作用。
2.根据权利要求1所述的体外研究，其特征在于研究对象为PC12细胞，MTT法检测细胞存活力的细胞密度为5000-8000/孔，正常组为DMEM(基础培养基）+1. 5% FBS (胎牛血清)，剥夺血清组为等量的DMEM, IGF-I给药组为12. 5ng/ml、25. 0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml的IGF-1+DMEM，给药后于温度为37°C、相对湿度为95%的CO2培养箱中继续培养24小时。
3.根据权利要求1所述的体外研究，其特征在于考察过氧化氢对IGF-I促存活功能的作用时不同浓度的H2O2 (ΙΟμΜ, 30μΜ，100 μ Μ，200 μ Μ，400 μ Μ)预处理细胞I小时，然后再加入IGF-I，继续培养24小时后MTT法检测细胞活力。
4.根据权利要求2、3所述的体外研究方法，其特征在于用于细胞培养的基础培养基配制方法为：将一袋高糖型DMEM粉末溶于500~800 mL的超纯水，另加入5. 95 g HEPES和 ，3.7 g NaHCO3,磁力搅拌使干粉完全溶解，定容至1000 mL,调节pH值至7. 2~7. 4，无菌条件下用孔径为O. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌后分装，于4 °C冰箱内放置储存。
5.根据权利要求2、3所述的体外研究方法，其特征在于用于检测细胞活力的MTT法配制方法如下：无菌条件下称取一定量的MTT粉末，PBS溶解至浓度为5 mg/mL，分装置-80 V存储备用，使用前用DMEM稀释到O. 5 mg/mL。
【文档编号】C12Q1/02GK103834714SQ201210474838
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2012年11月21日
【发明者】郝智慧, 王德军, 吕海鸾 申请人:青岛康地恩动物药业有限公司