专利名称：细胞培养微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及微流控芯片技术领域，特别是涉及一种细胞培养微流控芯片。
背景技术：
细胞微环境的动态平衡是保证细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件，微环境发生改变，细胞也会随之发生相应的变化。因此，胚胎发育、组织修复、肿瘤发生等生理病理过程与细胞所处的微环境息息相关。很多生理病理的研究都是基于细胞体外培养实现的，而传统的细胞体外培养只能提供一种静态的、宏观的、二维的细胞生长环境，细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状,往往和体内情况不相符。随着组织培养工程的新兴发展，三维细胞培养技术应运而生，其可以最大程度地模拟体内的微环境。传统的三维细胞研究方法有基质覆盖培养、旋转烧瓶培养、微载体培养、预置支架培养及旋转细胞培养系统等，这些三维细胞培养技术不仅操作繁琐，而且试剂耗量大，更为重要的是，相对于细胞的微小尺寸，这种培养环境与体内环境相差较远，客观上难以真实反映生理状态下细胞的生物学特征。20世纪90年代初基于微机电系统(MEMS)加工技术发展起来的微流控芯片，又称芯片实验室，具有多种单元技术、在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成的特征和优点。而且微流控芯片设计的微流道尺寸(通常1(Γ100 μ m)与典型的哺乳类细胞尺寸(1(Γ20 μ m)处于相同量级，并且微尺度下传热、传质较快，可以提供有利的细胞生长研究环境，同时微流控芯片可以满足高通量细胞分析的需要。正因为微流控芯片具有上述传统细胞生物学研究方法所不及的优点，使其成为细胞研究的重要平台，在生物医学领域显示了广阔的应用前景。用于细胞的三维培养和微环境的模拟的微流控芯片取得了一定的进展，但是也存在很多不足，普遍存在通量低下的问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种高通量的细胞培养微流控芯片。—种细胞培养微流控芯片,包括第一主流道、第一微阀、第二微阀、第三微阀、第二主流道及多个并列排布的细胞培养单元，多个并列排布的细胞培养单元位于第一主流道与第二主流道之间；每个所述细胞培养单元包括第一培养池、第二培养池及扩散流道，所述第二微阀用于控制所述细胞培养单元中的第一培养池和第二培养池的连通或关闭；第一培养池通过扩散流道与第一主流道连接，所述第一微阀用于控制所述细胞培养单元中的第一培养池通 过扩散流道与第一主流道的连通或关闭；第二培养池通过扩散流道与第二主流道连接，所述第三微阀用于控制所述细胞培养单元中的第二培养池通过扩散流道与第二主流道的连通或关闭。在其中一个实施例中，所述扩散流道的高度低于所述第一培养池、第二培养池、第一主流道及第二主流道的高度。
在其中一个实施例中，所述第一微阀的数量为多个，与多个细胞培养单元一一对应，每个所述第一微阀独立控制对应的所述细胞培养单元中的第一培养池与第一主流道的连通或关闭。在其中一个实施例中，所述第二微阀的数量为I个，所述第二微阀联动控制所述细胞培养单元中的第一培养池和第二培养池的连通或关闭。在其中一个实施例中，所述第三微阀的数量为I个，所述第三微阀联动控制所述细胞培养单元中的第二培养池通过扩散流道与第二主流道的连通或关闭。在其中一个实施例中，所述第三微阀的数量为多个，与多个细胞培养单元一一对应，每个所述第三微阀独立控制对应的所述细胞培养单元中的第二培养池与第二主流道的连通或关闭。在其中一个实施例中，所述第一主流道为迂回弯折结构，所述第二主流道为迂回弯折结构。在其中一个实施例中，所述第一培养池通过8根扩散流道与第一主流道连接；所述第二培养池通过8根扩散流道与第二主流道连接。在其中一个实施例中，所述第一主流道、第二主流道、第一培养池及第二培养池均为方体结构，高度为10(Γ200 μ m。 在其中一个实施例中，所述扩散流道为具有弧形底面的腔体结构，高度为45 55 μ m,宽度为 225 275 μ m。由于上述细胞培养微流控芯片中的第一微阀用于控制每个细胞培养单元中的第一培养池通过扩散流道与第一主流道的连通或关闭，可以为独立控制或联动控制。假设有N个细胞培养单元，那么就有N个第一培养池。当第一微阀用于独立控制每个细胞培养单元中的第一培养池通过扩散流道与第一主流道的连通或关闭时，通过调控微阀，N个第一培养池也可以实现N种不同细胞的定位；当第一微阀用于联动控制每个细胞培养单元中的第一培养池通过扩散流道与第一主流道的连通或关闭时，通过调控微阀，N个第一培养池可以实现I种细胞的定位。第二培养池对细胞的定位培养与第一培养池对细胞的定位培养的原理相同。因此，上述细胞培养微流控芯片可以实现对多种不同细胞(2 2N种)的空间定位和共培养，即实现细胞的高通量培养，提高分析效率；而且上述细胞培养微流控芯片既能用于细胞的二维培养又能用于细胞的三维培养，具有通用性和可比性。
图1为一实施方式的细胞培养微流控芯片的结构示意图；图2为其他实施方式中细胞培养微流控芯片的结构示意图；图3为实施例中的EpRS细胞于Matrigel三维培养基质中在微流控芯片中培养并生长的形态图。
具体实施例方式下面结合附图及具体实施例对细胞培养微流控芯片进行进一步的说明。如图1所不,一实施方式的细胞培养微流控芯片100包括第一主流道110、第一微阀120、细胞培养单元130、第二微阀140、第三微阀150及第二主流道160。
细胞培养单元130的数目为多个，多个细胞培养单元130并列排布，且位于第一主流道110与第二主流道160之间。第一微阀120的数目为多个，与多个并列排布的细胞培养单兀130 对应。每个细胞培养单元130包括第一培养池132、第二培养池134及扩散流道136。第二微阀140用于联动控制每个细胞培养单元130中的第一培养池132和第二培养池134的连通或关闭。可以理解，在其他实施方式中，也可以设置多个第二微阀140，多个第二微阀140与多个并列排布的细胞培养单元130——对应，每个第二微阀140独立控制对应的细胞培养单元130中的第一培养池132与第二培养池134的连通或关闭。第一培养池132通过扩散流道136与第一主流道110连接。每个第一微阀120用于独立控制对应的细胞培养单元130中的第一培养池132通过扩散流道136与第一主流道110的连通或关闭。可以理解，在其他实施方式中，也可以只设置I个第一微阀120，第一微阀120用于联动控制每个细胞培养单元130中的第一培养池132通过扩散流道136与第一主流道110的连通或关闭。第二培养池134通过扩散流道136与第二主流道160连接。第三微阀150用于联动控制每个细胞培养单元130中的第二培养池134通过扩散流道136与第二主流道160的连通或关闭。可以理解，在其他实施方式中，也可以设置多个第三微阀150，多个第三微阀150与多个并列排布的细胞培养单元130——对应，每个第三微阀150独立控制对应的每个细胞培养单元130的第二培养池134通过扩散流道136与第二主流道160的连通或关闭。在本实施方式中,扩散流道136的高度低于第一培养池132、第二培养池134、第一主流道110及第二主流道160的高度，从而可以使第一主流道110及第二主流道160中的液体快速扩散进入第一培养池132和第二培养池134中，实现快速传输，节约时间。在本实施方式中,第一主流道110、第二主流道160、第一培养池132和第二培养池134为方体结构，高度为10(Γ200 μ m，而其长度和宽度可以根据需要培养的细胞的大小和数量来设计。可以理解，第一主流道、第二主流道、第一培养池和第二培养池可以是其他形状的，如具有弧形底面的腔体结构等。每个细胞培养单元130中的第一培养池132通过8根扩散流道136与第一主流道110连接；第二培养池134通过8根扩散流道136与第二主流道160连接。第一主流道110和第二主流道160为迂回弯曲结构。第一主流道110与第一培养池132的两个侧壁分别通过4个扩散流道136连接；第二主流道160与和第二培养池134的两个侧壁分别通过4个扩散流道136连接，从而液体可以从两侧壁进入第一培养池132或第二培养池134，相较于单侧壁连接，接种细胞和灌流培养效果更好，液体流通量较大，有利于节省液体流通时间。可以理解，每个细胞培养单元130中扩散流道136的数量不限于上述的8个，如还可以为4个、6个等。扩散流道136为具有弧形底面的腔体结构，高度为45 55 μ m,宽度为225 275 μ m。具有弧形底面的腔体结构的扩散流道136与微阀(第一微阀120、第三微阀150)配合效果较好，液体在扩散流道136内流通更顺畅。
在本实施方式中，一个第三微阀150联动控制所有的第二培养池134通过扩散流道136与第二主流道160的连通或关闭。这样设计可以减少微阀的使用数目，在满足一般需求的同时能节约成本；另外，可以理解每个微阀都需要占据一定的空间，这样设计同时还可以节约空间。可以理解，在其他实施方式中，也可以是一个第三微阀150独立控制一个第二培养池134通过扩散流道136与第二主流道160的连通或关闭。如图2所示，其他实施方式中的细胞培养微流控芯片200，包括第一主流道210、第一微阀220、细胞培养单元230、第二微阀240、第三微阀250及第二主流道260。细胞培养单元230的数目为多个，多个细胞培养单元230并列排布，且位于第一主流道210与第二主流道260之间；第一微阀220的数目为多个，并与多个并列排布的细胞培养单元230 —一对应；第三微阀250的数目为多个，并与多个并列排布的细胞培养单元230--对应。每个细胞培养单元230包括第一培养池232、第二培养池234及扩散流道236 ;第二微阀240用于联动控制每个细胞培养单元230中的第一培养池232和第二培养池234的连通或关闭。第一培养池232通过扩散流道236与第一主流道210连接，第一微阀220用于独立控制每个细胞培养单元230中的第一培养池232通过扩散流道236与第一主流道210的连通或关闭。第二培养池234通过扩散流道236与第二主流道260连接，第三微阀250用于独立控制每个细胞培养单元230中的第二培养池234通过扩散流道236与第二主流道260的连通或关闭。扩散流道236的高度低于第一培养池232、第二培养池234、第一主流道210及第二主流道260的高度。通过调控微阀，如图2所示的细胞培养微流控芯片200相比于如图1所示的细胞培养微流控芯片100，在细胞培养单元的数目相同的情况下，能培养更多种不同的细胞。此外，在本实施方式中，第一主流道110与第二主流道150为都迂回弯曲结构，一方面能够在有限的空间内设置更多的扩散通道，更多的扩散通道有利于液体快速的传输。另外一方面迂回弯曲结构可以在接种细胞时减轻流道内液体剪切力对细胞的损伤，使细胞能均匀地分布在培养池中。图1所示的细胞培养微流控芯片100有多种用途。假设如图1所示的细胞培养微流控芯片100中共有N个细胞培养单元，给每个细胞培养单元按照从小到大的顺序编号，分
别为细胞培养单元1、细胞培养单元2......细胞培养单元N ;假设有多种不同的细胞，分别
为细胞1、细胞2、细胞3……细胞N。当需要用于实现多种不同细胞的空间定位、共培养或者一种药物对多种不同细胞的药物趋化作用的研究时，可以采用如下操作方式实现:关闭第二微阀140、以及N个第一微阀120，打开第三微阀150 ;通过第二主流道160向N个细胞培养单元130中的第二培养池134传输细胞1，待细胞I通过扩散流道136充满N个细胞培养单元130中的第二培养池134后，关闭第三微阀150，向第二主流道160通入清洗液，将残留于第二主流道160内的细胞I洗出，即实现了细胞I在N个第二培养池134中的空间定位。关闭第二微阀140、 第三微阀150、以及除控制细胞培养单元I中的第一培养池132以外的N-1个第一微阀120，打开控制细胞培养单元I中的第一培养池132的第一微阀120 ;通过第一主流道110向细胞培养单元I中的第一培养池132传输细胞2，待细胞2通过扩散流道136充满细胞培养单元I中的第一培养池132后，关闭控制细胞培养单元I中的第一培养池132的第一微阀120，向第一主流道110通入清洗液，将残留于第一主流道110内的细胞2洗出，即实现细胞2在细胞培养单元I中的第一培养池132中的空间定位。关闭第二微阀140、第三微阀150、以及除控制细胞培养单元2中的第一培养池132以外的N-1个第一微阀120，打开控制细胞培养单元2中的第一培养池132的第一微阀120 ；通过第一主流道110向细胞培养单元2中的第一培养池132传输细胞3，待细胞3通过扩散流道136充满细胞培养单元2中的第一培养池132后，关闭控制细胞培养单元2中的第一培养池132的第一微阀120，向第一主流道110通入清洗液，将残留于第一主流道110内的细胞3洗出，即实现细胞3在细胞培养单元2中的第一培养池132中的空间定位。其余的依次类推，上述细胞培养微流控芯片100能实现N+1种不同细胞的空间定位；通过第一主流道110和第二主流道160传输相同的培养基，即可实现N+1种不同细胞的共培养；通过第一主流道110和第二主流道160传输同一种药物，即可实现一种药物对N+1种不同细胞的药物趋化作用的研究。当需要实现高通量药物筛选时，可以采用如下操作方式实现:通过调控微阀，在N个细胞培养单元中的第一细胞培养池132和第二细胞培养池134中定位共培养同一种细胞。通过调控微阀，经第一主流道110可以向N个第一细胞培养池132中输入含不同浓度的同一药物的培养基，在第一细胞培养池132之间形成药物浓度梯度；通过第二主流道160向N个第二细胞培养池136中输入不含药物的培养基，作为对照实验组，即可研究同一药物的不同浓度对同一种细胞的侵袭和趋化作用，实现高通量药物筛选。还可以通过调控微阀，通过第一主流道110向N个第一细胞培养池132中输入含相同浓度的不同药物的培养基，通过第二主流道160向N个第二细胞培养池134中输入不含药物的培养基，作为对照实验组，即可实现不同药物对同一种细胞的影响的研究，实现高通量药物筛选。当需要实现细胞的二维或三维培养时，可以采用如下操作方式实现:将需要培养的细胞定位后，如果需要进行二维培养，直接让细胞在第一培养池和第二培养池中定位生长；如果需要进行三维培养，先将Matrigel等三维基质通入第一培养池和第二培养池中，有效模拟细胞微环境的化学构成，然后再引入细胞，使其在Matrigel等三维基质中附着并分化生长。培养的细胞可以用于各种生物学分析研究。三维培养比二维培养更接近体内环境，得到的细胞形态比二维培养的更加精确。图2所示的细胞培养微流控芯片200除了具有如图1所示的细胞培养微流控芯片100的用途以外，还具有一些其他的用途。由于细胞培养微流控芯片100中的所有的第二细胞培养池由一个第二微阀联动控制，因此，细胞培养微流控芯片100中的所有的第二细胞培养池只能实现一种细胞的定位培养，以及用于对照组实验。而细胞培养微流控芯片200给每个第二细胞培养池都设置独立的第二微阀，可以实现对多种细胞的定位培养。因此，在细胞培养单元数目不变的情况下，细胞培养微流控芯片200比细胞培养微流控芯片100能够定位培养更多种不同的细胞，可以实现2N中不同细胞的定位 培养，而且更适合对照组实验的进行。以下为具体实施例部分:
EpRs细胞在Matrigel三维基质中连续培养5天，实现EpRs细胞的三维培养。Matrigel富含多种细胞外基质成分，如:层黏连蛋白、胶原IV、TGF-β等，可以有效模拟细胞微环境的化学构成，诱导细胞在三维基质中的附着和分化，通过连续5天的培养，EpRs细胞在Matrigel中聚集形成由多个细胞组成的细胞球,如图3所示,其中，左上方第一幅图是EpRs细胞的原始状态图；右上方第二幅图是EpRs细胞在Matrigel三维基质中连续培养3天后的状态图；左下方第三幅图是EpRs细胞在Matrigel三维基质中连续培养4天后的状态图；右下方第四幅图是EpRs细胞在Matrigel三维基质中连续培养5天后的状态图。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种细胞培养微流控芯片，其特征在于，包括第一主流道、第一微阀、第二微阀、第三微阀、第二主流道及多个并列排布的细胞培养单元，多个并列排布的细胞培养单元位于第一主流道与第二主流道之间； 每个所述细胞培养单元包括第一培养池、第二培养池及扩散流道，所述第二微阀用于控制所述细胞培养单元中的第一培养池和第二培养池的连通或关闭； 第一培养池通过扩散流道与第一主流道连接，所述第一微阀用于控制所述细胞培养单元中的第一培养池通过扩散流道与第一主流道的连通或关闭； 第二培养池通过扩散流道与第二主流道连接，所述第三微阀用于控制所述细胞培养单元中的第二培养池通过扩散流道与第二主流道的连通或关闭。
2.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述扩散流道的高度低于所述第一培养池、第二培养池、第一主流道及第二主流道的高度。
3.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述第一微阀的数量为多个，与多个细胞培养单元一一对应，每个所述第一微阀独立控制对应的所述细胞培养单元中的第一培养池与第一主流道的连通或关闭。
4.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述第二微阀的数量为I个，所述第二微阀联动控制所述细胞培养单元中的第一培养池和第二培养池的连通或关闭。
5.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述第三微阀的数量为I个，所述第三微阀联动控制所述细胞培养单元中的第二培养池通过扩散流道与第二主流道的连通或关闭。
6.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述第三微阀的数量为多个，与多个细胞培养单元一一`对应，每个所述第三微阀独立控制对应的所述细胞培养单元中的第二培养池与第二主流道的连通或关闭。
7.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述第一主流道为迂回弯折结构，所述第二主流道为迂回弯折结构。
8.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述第一培养池通过8根扩散流道与第一主流道连接；所述第二培养池通过8根扩散流道与第二主流道连接。
9.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述第一主流道、第二主流道、第一培养池及第二培养池均为方体结构，高度为10(Γ200 μ m。
10.根据权利要求1所述的细胞培养微流控芯片，其特征在于，所述扩散流道为具有弧形底面的腔体结构，高度为45 55 μ m,宽度为225 275 μ m。
全文摘要
本发明涉及一种细胞培养微流控芯片，包括第一主流道、第一微阀、第二微阀、第三微阀、第二主流道及多个并列排布的细胞培养单元，多个并列排布的细胞培养单元位于第一主流道与第二主流道之间；每个细胞培养单元包括第一培养池、第二培养池及扩散流道，第二微阀用于控制细胞培养单元中的第一培养池和第二培养池的连通或关闭；第一微阀用于控制细胞培养单元中的第一培养池通过扩散流道与第一主流道的连通或关闭；第三微阀用于控制细胞培养单元中的第二培养池通过扩散流道与第二主流道的连通或关闭。上述细胞培养微流控芯片通过调控微阀，从而实现多种不同种类的细胞的空间定位和共培养，实现高通量的细胞培养。
文档编号C12M3/00GK103103121SQ20131001768
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者於林芬, 宋惠雪, 王战会 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院