一种细胞培养基材及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于组织工程的生物材料【技术领域】，公开一种细胞培养基材及其制备方法和应用。本发明利用脐带成纤维细胞自身分泌基质，经脱细胞处理、干燥灭菌后，获得的天然组织工程材料，含有I型胶原、III型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、核心蛋白聚糖等，可用于目标间充质干细胞的体外扩增。本发明制备的细胞培养基材可显著提高间充质干细胞在体外扩增的效率、保持干细胞特有的免疫表型、显著降低干细胞的活性氧含量，同时原料来源广泛，不会产生伦理道德问题。
【专利说明】一种细胞培养基材及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程的生物材料【技术领域】，具体涉及一种细胞培养基材及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞由于其具有高度自我更新能力和多向分化潜能的特性，已经广泛应用于再生医学、基因治疗、组织工程、细胞因子替代疗法等领域。
[0003]尽管间充质干细胞治疗正稳步迈向临床，但是将间充质干细胞移植技术广泛应用于治疗仍有面临不少的困难。第一，移植间充质干细胞的数量:临床有效的移植要求间充质干细胞达到一定的程度，但实践证明体外难以获得足够的组织特异性的间充质干细胞数量而又不丧失其干细胞潜能。第二，间充质干细胞技术在临床治疗中能否成功，与间充质干细胞的功能调控密切相关，尤其在病变状态下，间充质干细胞仍需保持其再生能力参与组织修复和疾病治疗。
[0004]间充质干细胞在体外扩增时多采用常规的塑料组织培养系统，间充质干细胞的体外扩增能力、多次传代后的分化潜力受到影响，不仅导致不能在短时间内快速有效的大规模扩增足够数量的优质间充质干细胞，而且使得间充质干细胞的关键功能调控受到影响，不能满足临床干细胞治疗的需求。
[0005]传统的体外传代培养方式扩增干细胞，面临着以下的困境和缺点:
I)、传统体外传代培养方式损害间充质干细胞自我更新能力，使得间充质干细胞扩增效率降低、花费增高。有研究表明，骨髓间充质干细胞经过多次传代之后，不但不能继续增殖，同时也失去其多向分化的能力，传代后期的干细胞一般只能向脂肪细胞方向分化。
`[0006]2)、传统体外传代培养方式不能满足不同年龄病人自体间充质干细胞临床需求。目前自体间充质干细胞已逐渐应用于临床治疗，但是不同年龄的干细胞体外增殖、定向分化能力有很大差异。有研究表明，体外培养的间充质干细胞的克隆数随年龄的增长而逐渐减少，按其与骨髓有核细胞的比率分别为:新生儿1:10000 ;青少年1:100000 ;50岁1:400000 ；80 岁 1:1~2000000。
[0007]如何能在体外大规模的扩增间充质干细胞，在提高其扩增效率的同时，并保持其间充质干细胞的特性，是目前间充质干细胞治疗面临的一个难题。
【发明内容】
[0008]本发明的发明目的在于针对上述现有扩增间充质干细胞技术的不足，提供一种细胞培养基材及其制备方法和应用。本发明通过脐带成纤维细胞分泌基质制备细胞培养基材，得到的细胞培养基材不仅具有多种蛋白质成分的特征，而且能用于间充质干细胞的体外扩增，具有生物相容性好、增殖效率高、干细胞表型一致、显著降低细胞内活性氧含量的优点。
[0009]本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现:一种细胞培养基材，所述细胞培养基材包括脐带成纤维细胞体外培养所分泌的基质。
[0010]所述脐带成纤维细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。
[0011]一种细胞培养基材的制备方法，具体步骤为:
51.从人源、猪源、鼠源或兔源组织获取脐带成纤维细胞；
52.配置诱导培养液；
53.在普通细胞培养基材上体外培养脐带成纤维细胞并诱导脐带成纤维细胞分泌基质；
54.脱细胞处理；
55.干燥、灭菌消毒，所述的灭菌消毒采用6tlCo或环氧乙烷灭菌。
[0012]步骤S3所述普通细胞培养基材为商用细胞培养皿、培养板或培养瓶。
[0013]步骤S3中所述诱导脐带成纤维细胞分泌基质具体步骤为将脐带成纤维细胞加入步骤S2配置的诱导培养液后培养7~20天，隔日换液。
[0014]步骤S2中所述诱导培养液的组成为:培养基a -MEM 80^90%体积比，胎牛血清10~20%体积比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25禮，刺激因子组分。
[0015]所述刺激因子组分由抗坏血酸10-?00 μ g/mL,脯氨酸20~60 μ g/mL,地塞米松IOOnM~I μ M中的一种或几种组成。
[0016]步骤S4中所述脱细胞处理为先加入含有NH4OH和Triton X-100的脱细胞处理液处理，再加入脱氧核糖核酸酶处理。
[0017]所述脱细胞处理液由PH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton Χ-100 δ%体积比和氨水0.8~5%体积比。
[0018]所述脱氧核糖核酸酶溶液由ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有50(T800 U/mL脱氧核糖核酸酶。
[0019]本发明所述细胞培养基材在间充质干细胞体外扩增中的应用。
[0020]所述细胞培养基材在间充质干细胞体外扩增中的应用，具体步骤为:
56.配制间充质干细胞培养液，所述培养液组成为培养基a-MEM90%体积比，胎牛血清10%体积比，抗生素10^200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25 mM ；
57.培养间充质干细胞，隔日换液；
58.胶原酶溶液酶解细胞、离心分离。
[0021]步骤S8中所述胶原酶溶液由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有重量比0.1%的胶原酶和重量比0.05%的胰酶。
[0022]本发明制备的细胞培养基材，是利用脐带成纤维细胞自身分泌基质，经脱细胞处理、干燥灭菌后，获得的天然组织工程材料，含有I型胶原、III型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、核心蛋白聚糖等，可用于目标间充质干细胞的体外扩增。
[0023]在体外重建干细胞生长的天然微环境(包括类似体内微环境的微观结构、基质蛋白和诱导因子等)是解决间充质干细胞体外大规模扩增问题的一条捷径。在细胞所处的微环境中，细胞外基质扮演着重要角色，在干细胞的贴附、存活、迁移、增殖、分化和基质重建等方面发挥着关键作用。MSCs通常处于特定的细胞外基质形成的微环境中，其中包括复杂的细胞外应力信号和化学信号，引导MSCs的迁移、自我更新和定向分化。
[0024]本发明细胞培养基材含有脐带成纤维细胞分泌的细胞外基质(ECM)，不仅含有多种基质成分，包括I型和III型胶原蛋白、纤维连接蛋白、粘连蛋白、弹性蛋白和大分子的蛋白聚糖等，而且具有与体内微环境相似的三维结构和柔韧性。同时，脱细胞处理后原有细胞留下的空间能为以后的MSCs培养(培养的MSCs)提供足够的生长空间。在三维的ECM微环境中，成纤维细胞能迅速的合成整合素Oj1和ανβ3与ECM接触，类似其在体内的反应；而在二维培养环境或人工基底膜中，细胞需要较长时间才能产生原始的贴壁行为。细胞分泌的ECM能在体外重建和模拟体内的微环境,调控MSCs行为，从而影响MSCs的自我更新能力和定向分化潜能。
[0025]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
(1)、本发明制备的细胞培养基材，可显著提高间充质干细胞在体外扩增的效率；
(2)、本发明制备的细胞培养基材，可保持间充质干细胞特有的免疫表型；
(3)、本发明制备的细胞培养基材，可显著降低间充质干细胞的活性氧含量；
(4)、本发明制备的细胞培养基材具有原料来源广泛的特点，不产生伦理道德问题；
(5)、本发明的制备方法具有成本低、方法简单、易于操作的特点量。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明所制备的细胞培养基材免疫荧光染色后的倒置荧光显微镜图；
图2为本发明制备的细胞培养基材扩增目标间充质干细胞的细胞形态图片；
图3为采用本发明制备的细胞培养基材与普通培养基材扩增目标间充质干细胞的活性氧分析图。`
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0028]实施例1
I利用脐带成纤维细胞分泌物制备细胞培养基材
(I)诱导培养液的配制，其组分包括有:商用最低必需培养基α-ΜΕΜ 80%体积比，胎牛血清20%体积比，抗生素10~200 U/mL,腺嘌呤0.25 mM,脯氨酸50 μ g/mL,地塞米松ΙΟΟηΜ。
[0029](2)诱导脐带成纤维细胞分泌基质:将脐带成纤维细胞按照20，000个细胞/cm2的密度接种于商用细胞培养板中，加入步骤(3)诱导培养液，于37°C的5%的CO2培养箱中培养疒20天，隔日换液。
[0030](3)脱细胞处理:先用ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，接着加入含有TritonX-100 5%体积比和氨水4%体积比的脱细胞处理液，于37° C的5%的CO2培养箱中静置5分钟，用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，再加入含有800U/mL脱氧核糖核酸酶溶液于37° C的5%的CO2培养箱中静置60分钟，用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次。
[0031](4)干燥:将经过脱细胞处理后的细胞培养基材进行冷冻干燥。
[0032](5)灭菌消毒:采用环氧乙烷灭菌。
[0033]2制备得到的细胞培养基材免疫荧光染色。
[0034]将实施例1制得的细胞培养基材进行I型胶原、III型胶原、纤连蛋白、核心蛋白聚糖免疫荧光染色。对于实施例1制得的细胞培养基材，首先冰甲醇固定15min，PBS洗3次，加5%BSA封闭30min，加入用1%BSA配制的一抗:1型胶原、III型胶原、纤连蛋白、核心蛋白聚糖，置于摇床上lh，PBS洗3次，加入偶联FITC 二抗，室温30min，PBS洗完后采用倒置荧光显微镜拍照。结果如图1所示，细胞培养基材中I型胶原、III型胶原、纤连蛋白丰富表达，含量较高。
[0035]实施例2
I细胞培养基材扩增目标间充质干细胞的细胞形态检测
将目标间充质干细胞接种于实施例1获得的细胞培养基材，采用Olympus 1X71显微镜荧光拍照，获得如图2目标间充质干细胞形态照片。细胞培养基材培养间充质干细胞保持良好的成纤维形态，细胞密度高，可为间充质干细胞体外扩增提供依据。
[0036]2本发明制备的细胞培养基材与普通培养基材扩增目标间充质干细胞的活性氧分析将目标间充质干细胞接种于实施例1所获得的细胞培养基材与普通培养板上，待细胞密度达90%左右收集细胞，采用2' ,7' - 二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧。细胞于10 μ M DCFH-DA中37°C孵育IOmin孵育后，采用BD双波长激光流式细胞仪进行检测细胞内的荧光强度，每个样品收集10000个细胞。如图3所示，与普通培养基材相比，实施例1所获得的细胞培养基材能明显降低目标间充质干细胞内活性氧，减少胞内活性氧自由基生成，有效保护细胞内`环境的稳定。
【权利要求】
1.一种细胞培养基材，其特征在于，所述细胞培养基材包括脐带成纤维细胞体外培养所分泌的基质。
2.根据权利要求1所述细胞培养基材，其特征在于，所述脐带成纤维细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。
3.—种权利要求1所述细胞培养基材的制备方法，其特征在于，具体步骤为: . 51.获取脐带成纤维细胞； . 52.配置诱导培养液； . 53.在普通细胞培养基材上体外培养脐带成纤维细胞并诱导脐带成纤维细胞分泌基质； .54.脱细胞处理； . 55.干燥、灭菌消毒。
4.根据权利要求3所述细胞培养基材的制备方法，其特征在于，步骤S3所述普通细胞培养基材为商用细胞培养皿、培养板或培养瓶。
5.根据权利要求3所述细胞培养基材的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述诱导脐带成纤维细胞分泌基质具体步骤为将脐带成纤维细胞加入步骤S2配置的诱导培养液后培养疒20天，隔日换液。
6.根据权利要求3所述细胞培养基材的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导培养液的组成为:培养基α-ΜΕΜ 80-90%体积比，胎牛血清10-20%体积比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2^0.25 mM，刺激因子组分。
7.根据权利要求6所述细胞培养基材的制备方法，其特征在于，所述刺激因子组分由抗坏血酸10~100 μ g/mL,脯氨酸20-60 μ g/mL,地塞米松ΙΟΟnΜ~1 μ M中的一种或几种组成。
8.根据权利要求3所述细胞培养基材的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述脱细胞处理为先加入含有NH4OH和Triton X-100的脱细胞处理液处理，再加入脱氧核糖核酸酶处理。
9.根据权利要求8所述细胞培养基材的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理液由PH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton Χ-100 1~δ%体积比和氨水0.8~5%体积比；所述脱氧核糖核酸酶溶液由ΡΗ7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有50(T800 U/mL脱氧核糖核酸酶。
10.根据权利要求1所述细胞培养基材在间充质干细胞体外扩增中的应用。
【文档编号】C12N5/0775GK103497892SQ201310394069
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月3日 优先权日:2013年9月3日
【发明者】何帆, 刘小珍, 谭子芳, 龚逸鸿 申请人:中山大学