用于细胞培养基工程化的功能环境学方法

用于细胞培养基工程化的功能环境学方法
【专利摘要】本发明涉及用于最优化细胞培养基的组成的新方法。该新方法包括两个主要阶段。在第一阶段中，通过执行特定细胞培养方案和外代谢物组测定方案，联合筛选细胞功能和介质因子（medium?factor）来建立功能环境学图谱。所述功能环境学图谱由基本细胞功能的强度值相对于介质因子的数据阵列组成。在第二阶段，由所述功能环境学图谱的列（columns）开发最优化的细胞培养基制剂，所述培养基制剂增强或抑制靶标基本细胞功能。该方法的主要优势在于使得能够通过培养基组成操纵进行代谢工程化，其中通过介质因子的操纵来最优化任意高数量的细胞功能，这与主要根据经验而非细胞功能导向的并且需要多得多的实验次数的先前的方法相反。此外，该新方法基于有成本效益的外代谢物组测定且不需要花费巨大的细胞内基因组或蛋白质组学测定。
【专利说明】用于细胞培养基工程化的功能环境学方法
发明领域
[0001]本发明涉及用于最优化细胞培养基的组成的方法。描述了用于测定介质因子的最佳值的方法，从而按照用户需要增强或抑制靶标基本细胞功能。所述方法包括通过执行细胞培养实验和优选外代谢物组(exometabolome)的高通量分析法构建功能环境学图谱,随后基于介质因子的所述功能进行介质因子值调整。
[0002]发明背景
[0003]细胞生长制剂在水溶液中包含数百种单独的成分。它们通常由下述组成:营养物例如蛋白胨、氨基酸、肉类提取物和酵母提取物；矿物质和维生素、抑制剂和固化剂。这些成分中的某些对于细胞生长或生产率可能是至关重要的，其它成分在某种水平上可能是有毒性的，并且许多成分可在细胞内的相同或竞争性途径中参与复杂的相互作用。包含哺乳动物细胞生长所必需的生长因子的血清(胎小牛血清FCS和胎牛血清FBS)已被广泛用作用于动物细胞培养的培养基补充物。然而血清的使用正被渐渐停止，因为监管机构对使用动物来源的材料生产活性药物成分(API)施以了非常严格的限制。若干文献(例如W02008009642、W02009149719、US2009061516)公开了能够支持动物细胞的体外培养的无血清细胞培养基制剂。[0004]通过统计学实验设计(design-of-experiments) (DoE)支持的密集实验(Intensive experimentation)是用于确定细胞培养基的最佳组成的现有标准方法。然而该方法耗时且昂贵。单个地或在平行实验中以小的组合的方式筛选培养基成分，这显著限制了发现许多培养基成分之间的复杂相互作用的能力。已报导了众多关于使用DoE对通过反应器或摇瓶实验支持的细菌、真菌、哺乳动物细胞和干细胞培养进行培养基最优化的研究([2]、[5]、[6]、[8])。最常见的DoE法是利用两个浓度水平的所谓的缩减因子设计(reduced factorial design),其允许在有限次数的实验中初步筛选5至10种介质因子([7]、[2])。例如，文献号US2008248515公开了使用2-水平因子设计和最速上升法(deepest ascent method)确定无血清真核细胞培养基补充物的最佳组成的方法。通过使用DoE，同时比较数种介质因子，测量它们的作用，并基于反应变量的测量对其进行排序。反应变量通常是代谢物的浓度、细胞和产物浓度。一旦确定了反应变量，就可使用统计性能参数例如方差分析(ANOVA)来评估所测量的作用的相关性。相关于它们的影响力对介质因子进行排序，随后选择最有效的因子，并在另外的实验中进一步进行测试[2]。最后，建立回归模型来确定介质因子的最佳水平[2]。
[0005]统计学DoE法的主要劣势是，由于其经验主义的性质，当用于许多具有潜在相互作用的介质因子时，其成本膨胀。为了加速对大量介质因子的筛选，最近基于微生物生物反应器技术开发了高成本的高通量培养基最优化设备，目标是使得能够并行筛选数千种营养物水平或其组合。减少工作量和加速培养基开发的另一个策略是将培养基成分分成浓缩的相容性制剂小组(如文献号NZ243160中公开的)。也提出了较少经验性因而更快速且更便宜的方法。文献号MX2009004974公开了用于细胞培养基设计的合理方法，其中基于培养的细胞的蛋白质含量、所表达的重组蛋白质的氨基酸组成和细胞维持需求来计算培养基中的氨基酸浓度。
[0006]如今存在可用于较少经验性和倾向(tendencially)机械性的培养基设计的更先进的系统生物学工具。Kell和同事显示出在外代谢物组(所有细胞外代谢物的浓度)与细胞内状态之间存在紧密联系[9]。他们显示出外代谢物组动力学提供了细胞代谢活性以及间接地基因组和蛋白组状态的信息性和准确的“足迹”。事实上，培养基不仅输送关键的营养物而且还输送参与基因表达调控的小分子和蛋白质(例如[3])。然而先前从未描述过使用外代谢物组来改善培养基的组成。
[0007]在文献号W02004101808中，描述了用于使用基因组学和/或蛋白质组学来开发细胞培养基制剂的方法。其描述了用于配制细胞培养基的方法，包括检测细胞中的序列，所述序列是核酸序列(例如关于基因组的信息)或所表达的氨基酸序列(例如关于蛋白质组的信息)，以及配制包含调节所检测的序列或其表达或调节受所检测的序列或其表达影响的细胞过程的分子的细胞培养基，其中不比较所述分子对不同细胞系或不同培养条件的影响。然而，这样的方法提出了 3个主要的问题:i)寻找单个分子相互作用已被证明昂贵且困难，ii)在基因表达、蛋白质组与细胞表型之间存在公知的空缺，iii)基因表达或蛋白质组数据的系统性收集是困难且昂贵的。因此使用基因组学和/或蛋白质组学来进行系统性培养基设计在许多情况下可能是不可行的。
[0008]调节特定生物化学转化的备选方案是功能导向的工程化，其是本文中所探索的方法。可使用基元通量模式分析(elementary flux modes analysis)或极端途径分析(extreme pathways analysis) [35]将细胞的代谢分解成基本细胞功能。基元通量模式代表代谢反应的独特且不可分解的亚网络，其以稳定的状态协调工作。基元模式的完整的组代表细胞实现其功能的所有可运行的模式。具体地，细胞的表型，如通过其通量组(fluxome) v定义的,可被表达为基元通量模式的贡献的权重和:
【权利要求】
1.用于确定最佳细胞培养基组成的方法，其特征在于下列步骤: a)选择祀生物学结构； b)建立K个基本细胞功能的组，其设置自主的和模块化的生物学功能，其将结果一起组合成为靶标生物学结构的功能； c)建立N种介质因子的组，其决定靶标生物学结构的环境； d)使用新鲜的和/或经消耗的培养基样品的上清液的外代谢物组的实验数据建立功能环境学图谱，其表示N种介质因子的每一个对K个基本细胞功能的每一个的活化或抑制的强度； e)使用功能环境学图谱最优化定向为活化或抑制一个或多个基本细胞功能的细胞培养基的组成。
2.权利要求1的方法，其中步骤d)中的功能环境学图谱的构建包括下列步骤: -进行第一轮培养实验，其包括数目等于或高于介质因子的数目+1(N+1)的培养，其中在不同的培养基组成中进行每一个培养，其中筛选了介质因子的低和高水平的组合； -对于每一个所进行的培养实验，获得初始和终点生物质、产物和外代谢物组数据或部分外代谢物组数据； -使用下列线性模型，通过外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据相对于培养基组成数据的回归分析确定其相对权重因子λ j大于零的活性基本细胞功能的亚组，
3.权利要求1的方法，其中步骤e)中的培养基组成的最优化包括下列步骤: -使用功能环境学数据矩阵配制基本细胞功能特异性培养基组成，其中根据下列公式，介质因子值的变化Λ (FACj)引起基本细胞功能的相对权重的变化Λ (Ai) Δ (Ai) =.1.,X Δ (FACj)(5) -使用应用于功能环境学数据阵列的第j列的公式(4)配制细胞培养基组成以增强或抑制单个基本细胞功能j ; -使用同时应用于功能环境学数据阵列的多列的公式(4)来配制细胞培养基组成，以通过增强或抑制关键的基本细胞功能组来工程化细胞代谢。
4.根据前述任一权利要求的方法，其中所述靶标生物学结构是细胞组织、全细胞、细胞器或表示给定的细胞功能的协同的生物化学转化组。
5.权利要求1-3中的任一项的方法，其中所述靶标生物学结构被遗传修饰，包括定向为活化或抑制基本细胞功能的遗传修饰。
6.权利要求1-3中任一项的方法,其中介质因子是必需营养物和/或微量营养物和/或生物功能性分子的固体和/或液体或/或气体混合物的物理化学性质，或所述化合物的释放速度或所述化合物的进料速度。
7.权利要求1-3和6中任一项的方法，其中所述物理化学性质包括温度和/或压力和/或pH和/或离子强度和/或浓度和/或活性和/或同渗重摩和/或摩尔渗透压浓度和/或相关性质。
8.权利要求1-3和6中任一项的方法,其中必需营养物和/或微量营养物和/或功能性分子包括无机和/或有机材料，包括盐和/或维生素和/或代谢辅因子和/或抗生素和/或碳水化合物材料和/或脂质材料和/或蛋白质性质材料和/或核苷酸材料和/或信号转导蛋白和/或酶活性的抑制 分子和/或蛋白质的激活分子和/或基因转录调节因子和/或干扰核糖核酸和/或具有已知或未知组成的所述材料的复杂混合物，包括血清或者纯的或复杂的有机材料的水解产物。
9.根据前述任一权利要求的方法，其中使用下列公式通过N种介质因子的值确定培养基制剂: 培养基制剂={FAC上j=l，…，N， FACj为介质因子j的值。
10.根据前述任一权利要求的方法，其中使用下列公式通过q个生物化学反应和K个基本细胞功能确定所述靶生物学结构: 革巴标生物学结构={ej，i=l,…，K, θ?为q个元素的向量,其值表示基本细胞功能i的每一个生物化学反应的权重因子。
11.根据前述任一权利要求的方法，其中所述基本细胞功能获自所述靶标生物学结构的生物化学网络，其中所述生物化学网络被细分为K个包含生物化学转化的亚组的功能性亚网络，其中手动地和/或自动地获得此类亚网络。
12.根据前述任一权利要求的方法，其中基本细胞功能获自所述靶标生物学结构的生物化学网络的基因组规模重构，其中可使用转录组数据和/或蛋白质组数据和/或内代谢物组数据和/或热动力学数据来预减小K个基本细胞功能的工作组，如果可获得这些数据的话。
13.根据前述任一权利要求的方法，其中通过在摇瓶、T形瓶、反应器、微量滴定板、微量生物反应器或表型微阵列中进行的系列和/或平行培养实验来确定所述功能环境学图-1'TfeP曰。
14.根据前述任一权利要求的方法，其中通过外代谢物组测定来确定所述功能环境学图谱，所述测定包括通过下述来分析新鲜的或经消耗的培养基样品的上清液:色谱技术例如液相色谱(LC)或气相色谱(GC)、NMR技术例如IH-NMR或13C-NMR、质谱技术(MS)或与质谱法联合的色谱法例如GC-MS或LC-MS或所述测量技术的组合。
15.根据前述任一权利要求的方法，其中通过线性或非线性回归分析来鉴定活性基本细胞功能的减小的组，其中使外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据的方差或协方差最大化，其中使外代谢物组数据或衍生的外代谢物组数据与介质因子的值之间的相关性最大化，其中根据它们与介质因子的值的相关性或对所述值的敏感性对基本细胞功能进行排序。
16.根据前述任一权利要求的方法，其中通过高通量自动化系统确定所述功能环境学图谱，其中将培养装置、分析外代谢物组装置和计算机算法连接在物理设备中以产生高通量功能环境学图谱。
17.根据前述任一权利要求的方法，其中与产物数量和/或产物质量相关的靶基本细胞功能i使其相对权重Λ (λ J增加60至100%。
18.一种用于培养酵母巴斯德毕赤酵母的化学上确定的培养基制剂，其特征在于使异源蛋白质表达功能增强60至100%，其是通过权利要求1-17中描述的方法获得的，其包含:
a)由CuSO4.5H20, 12.0g/L, NaI, 0.16g/L, MnSO4.H2O, 6.00g/L, Na2MoO4.2H20, 0.40g/L, H3BO3, 0.0Olg/L, CoCl2.6H20, 0.25g/L, ZnCl2, 40.0g/L, FeSO4.7H20, 3.25g/L,生物素，0.4g/L, H2SO4, 10.0mL/L构成的痕量元素的水性溶液；和 b)溶液a)与由 H3P0485%, 26.70ml/L, CaSO4.2Η200.93g/L, K2S0418.20g/L, MgSO4.7H2014.90g/L, K0H4.13g/L构成的补充性基础水性溶液或其它补充性基础水性溶液的混合物。
19.权利要求1-17中 描述的方法的用途，其用于在生物学生产过程中，例如在生物燃料生产中，或疫苗生产中，或药物生产中，或生物聚合物生产中或所述产物的前体的生产中增加下述的数量和/或质量:组织和/或细胞和/或病毒和/或细胞组分和/或蛋白质性质的材料和/或碳水化合物材料和/或核苷酸材料和/或脂质材料和/或初级代谢产物和/或次级代谢产物或所述产物的混合物。
20.权利要求1-17中描述的方法的用途，其用于最优化植物界或动物界细胞系或其它真核单细胞或多细胞生物体例如酵母和真菌的细胞培养基的组成。
21.权利要求1-17中描述的方法的用途，其用于最优化原核生物的细胞培养基的组成。
22.权利要求1-17中描述的方法用于最优化干细胞的细胞培养基的组成的用途。
23.权利要求1-17中描述的方法用于鉴定细胞功能的生物标志物的用途。
24.权利要求1-17中描述的方法的用途，其用于设计药物或用于最优化定向为修饰与疾病状况相关的细胞功能的药物混合物。
25.一种生物标志物标识，其包括权利要求1-17中描述的方法。
26.—种药物设计系统,其包括权利要求1-17中描述的方法。
【文档编号】C12N1/16GK103459584SQ201280011020
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年1月13日 优先权日:2011年1月14日
【发明者】R·M·弗雷塔斯奥里贝拉, J·M·洛佩兹蒂亚兹, A·R·桑托斯费雷拉 申请人:科学与技术学院里斯本新大学