专利名称：黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1a7的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1A7。
背景技术：
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素BI的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素BI被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即I类致癌物质。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，在各种食物及农产品，尤其是玉米、花生及其制品中都很有可能存在黄曲霉毒素的污染。因此加强黄曲霉毒素的检测、特别是速测，及时了解和掌握各种食物及农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。现有黄曲霉毒素的检测方法包括化学分析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中化学分析法是早期检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素的抗体。随着抗体技术的 发展，重组单链抗体在黄曲霉毒素的检测领域也逐渐被应用。与传统的多克隆抗体、单克隆抗体相比较而言，重组单链抗体具有其独特的优势，可以在原核表达体系里在很短的时间内大量生产并且生产费用低廉,对黄曲霉毒素的低成本、大规模检测有重要的应用价值，可以满足日益增长的黄曲霉毒素抗体的生产需要。而高质量的重组单链抗体通常需要从特定的噬菌体展示文库中筛选获得，通常文库库容越大，筛选到目的抗体的几率也就越高，但是文库构建的难度也相应增大。因此，在不增加文库构建难度的基础上通过阳性抗体库的构建将极大的提高特异性抗体的筛选概率。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1A7。黄曲霉毒素阳性抗体基因库，其特征在于:它是将黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的混合轻链可变区基因和混合重链可变区基因采用重叠延伸PCR方法随机拼接得到单链抗体ScFv基因，然后与pCANTAB 5E载体连接与转化得到的，所述的黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1分别由保藏编号为CCTCC NO: C201013,CCTCCNO: C201018,CCTCC NO: C201017,CCTCC NO: C201016,CCTCC NO: C201014 的杂交瘤细胞
株分泌产生。黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建方法具体如下:应用PCR方法分别扩增得到各黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的轻链可变区基因VH、重链可变区基因VL，将各抗体的轻、重链可变区基因等摩尔数混合作模板，然后利用重叠延伸PCR方法将两者与编码柔性短肽序列(Gly4Ser)3的Linker片段相连,拼接成单链抗体scFv基因，将构建的scFv基因与pCANTAB 5E载体连接与转化，构得黄曲霉毒素阳性抗体基因库。按上述方案，所述扩增得到其各黄曲霉毒素单克隆抗体的轻、重链可变区基因的引物为:
重链可变区(Back):5’ - AGG TGC AGC TGC AGC AGT CTG G-3’
重链可变区(For):5’ - TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3，
轻链可变区(Back):5，- GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’
轻链可变区(For):5，- CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3，。按上述方案，所述重叠延伸PCR方法中扩增编码柔性短肽序列(Gly4Ser)3的linker片段的引物为:
Linker正向:5，_TCC GGC GGT GGT GGC AGC GGT GGC GGC GGT TCT GAC ATT GAG CTCACC CAG TCT CCA -3，
Linker反向:5，_ACC GCT GCC ACC ACC GCC GGA GCC ACC GCC ACC TGA GGA TGA GGAGAC GGT GAC CGT GGT -3’。按上述方案，所述在将轻链可变区基因Vh和重链可变区基因\与编码柔性短肽序列(Gly4Ser) 3的Linker片段拼接完成后,根据pCANTAB 5E载体克隆位点附近序列设计在scFv基因两端分别引入载体pCANTAB 5E同源序列的引物，并使每条引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E同源位点，以在scFv基因两端各引入至少15bp的载体pCANTAB5E同源序列，所述引物如下:
RS (Back): 5’-TCC TTT CTA TGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA GGT GCA GCT GCAGC A GTC TGG-3’
RS (For): 5，-CGG CGC ACC TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E同源的位点。按上述方案，所述单链抗体SCFv基因的构建方法为:先在如下PCR扩增反应体系中:
权利要求
1.黄曲霉毒素阳性抗体基因库，其特征在于:它是将黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的混合轻链可变区基因和混合重链可变区基因采用重叠延伸PCR方法随机拼接得到单链抗体ScFv基因，然后与pCANTAB 5E载体连接与转化得到的，所述的黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1分别由保藏编号为CCTCC NO: C201013,CCTCCNO: C201018,CCTCC NO: C201017,CCTCC NO: C201016,CCTCC NO: C201014 的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建方法，其特征在于:它是应用PCR方法分别扩增得到各黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的轻链可变区基因VH、重链可变区基因VL，将各抗体的轻、重链可变区基因等摩尔数混合作模板，然后利用重叠延伸PCR方法将两者与编码柔性短肽序列(Gly4Ser) 3的Linker片段相连，拼接成单链抗体scFv基因，将构建的scFv基因与pCANTAB 5E载体连接与转化，构得黄曲霉毒素阳性抗体基因库。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建方法，其特征在于:所述扩增得到其各黄曲霉毒素单克隆抗体 的轻、重链可变区基因的引物为: 重链可变区(Back):5’ - AGG TGC AGC TGC AGC AGT CTG G-3’ 重链可变区(For):5’ - TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3， 轻链可变区(Back):5，- GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’ 轻链可变区(For):5’ - CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’ ； 所述重叠延伸PCR方法中扩增编码柔性短肽序列(Gly4Ser)J^ linker片段的引物为:Linker正向:5，_TCC GGC GGT GGT GGC AGC GGT GGC GGC GGT TCT GAC ATT GAG CTCACC CAG TCT CCA -3，Linker反向:5，_ACC GCT GCC ACC ACC GCC GGA GCC ACC GCC ACC TGA GGA TGA GGAGAC GGT GAC CGT GGT -3’。
4.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建方法，其特征在于:所述在将轻链可变区基因Vh和重链可变区基因\与编码柔性短肽序列(Gly4Ser) 3的Linker片段拼接完成后，根据pCANTAB 5E载体克隆位点附近序列设计在scFv基因两端分别引入载体pCANTAB 5E同源序列的引物，并使每条引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E同源位点，以在scFv基因两端各引入至少15bp的载体pCANTAB 5E同源序列,所述引物如下:RS (Back): 5’-TCC TTT CTA TGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA GGT GCA GCT GCAGC A GTC TGG-3’RS (For): 5，-CGG CGC ACC TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E同源的位点。
5.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建方法，其特征在于:所述单链抗体scFv基因的构建方法为:先在如下PCR扩增反应体系中:
6.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建方法，其特征在于:所述ScFv基因与pCANTAB 5 E载体的连接方法为^fpCANTAB 5 E载体经Sf i I /Not I双酶切处理，然后与ScFv基因进行In-fusion连接；所述的转化为:将前述连接产物加入到大肠杆菌TGl电转化感受态细胞中，混匀，电转化，电转化条件:0.1 cm电转化杯，1.8 kV, 200Ω，25 μ F，电转化后立即在电转化杯中加入2ΥΤ液体培养基吹打后转移，37°C缓慢振摇复苏I h。
7.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素阳性抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素单链抗体的应用。
8.根据权利要求7所述的黄曲霉毒素阳性抗体基因库在噬菌体展示方法筛选黄曲霉毒素单链抗体的应用，其特征在于:它是将构建成功的黄曲霉毒素阳性抗体基因库通过M13K07辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，通过两步法进行筛选:第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素BI作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，最终筛选获得黄曲霉毒素重组单链抗体。
9.黄曲霉毒素重组单链抗体1A7，其特征在于:它的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，其中重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
10.根据权利要求9所述的黄曲霉毒素重组单链抗体1A7，其特征在于:所述编码基因序列如SEQ ID NO: 4所示，其中重链可变区编码基因序列如SEQ ID NO: 5所示，轻链可变区编码基因序列如SEQ ID N0:6所不。
全文摘要
本发明涉及黄曲霉毒素阳性抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素重组单链抗体1A7。该黄曲霉毒素阳性抗体基因库是将黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的混合轻链可变区基因和混合重链可变区基因采用重叠延伸PCR方法随机拼接得到单链抗体ScFv基因，然后与pCANTAB5E载体连接与转化得到的。该阳性基因库完全由对黄曲霉毒素具有识别能力的抗体的基因片段(阳性片段)构建组成；在相对库容量不大的情况下，可实现黄曲霉素素单链抗体的快速筛选；黄曲霉毒素重组单链抗体1A7为通用单克隆抗体，对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC50为20pg/mL，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为100%、166%、100%、0.1%和11.1%。
文档编号C12N15/63GK103215652SQ20131005439
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月20日 优先权日2013年1月25日
发明者李培武, 李鑫, 张奇, 丁小霞, 张文, 李冉 申请人:中国农业科学院油料作物研究所