专利名称：水稻转录因子Os01g18440基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s01gl8440基因的应用。
背景技术：
水稻(Oryza sativa L.)是人类赖以生存的最重要的粮食作物之一，也是一个重要的功能基因研究的模式物种，与其相关的遗传学和分子生物学研究一直倍受关注，其中，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻转基因技术逐渐成为水稻增产的研究手段。在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖器官，种子同时也为 人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过程。而转录因子在其间基因的精确调控中起到了关键性的作用。MADS-box基因广泛存在于动物、植物和真菌中(Alvarez-Buylla等,2000 ；Beckerand Theissen, 2003 ;Kaufmann等,2005)。对MADS-box基因研究最早的是从金鱼草和拟南芥的花形态突变体开始的。MADS-box基因编码转录因子，在植物(特别是被子植物)进化过程中发生了大量的基因重复事件，从而形成了一个多基因家族(Becker and Theissen,2003 ;Irish，2003)。在拟南芥中大约有107个MADS-box基因，从目前的基因组数据显示，水稻中大约有 70 余个 MADS-box 基因(Litt and Irish, 2003 ；Martinez-Castilla andAlvarez-Buylla, 2003 ；Parenicova 等，2003;Nam 等，2004 ;Causier 等，2005 ;Irish andLitt,2005)。MADS-box基因是一个序列特异的调节基因家族，所编码的蛋白为转录因子，主要由MADS盒、K盒、I区、C末端、N末端等5个部分组成，其中MADS盒高度保守。MADS-box转录因子是通过二聚体化的形式以其保守结构域与特定的DNA序列相结合来调控基因表达的。大量研究表明，MADS-box基因在植物花的发育上具有重要的作用，已克隆出了许多与花器官发育相关的ABC类的MADS-box基因，而且也发现了许多可以调控花期的MADS-box基因。目前，越来越多的研究表明，MADS-box基因在果实的发育、成熟中也有着重要的作用。果实的成熟过程受到外界环境条件和基因的调控。2002年，Vrebalov等发现番爺中的一个MADS-box基因与果实的成熟密切相关。Vrebalov等发现如果番爺中Ripening-1nhibitor (RIN)位点发生突变，则西红柿果实不能成熟，而且会出现萼片变大的现象。通过定位克隆发现rin位点上存在2个串联的MADS-box基因，分别命名为LeMADS-RIN和LeMADS-MC，前者调控果实成熟过程，后者则影响萼片先育和花序决定性。果实的成熟过程与产量有着直接的关系，因此，对该转录因子的进一步研究理论上为理解开花、果实成熟与产量的调控提供了新线索，在实践上也将为作物高产育种提供理论基础。VP16最早在动物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。VP64是由4个VP16功能域基序融合在一起组成的一类增强子。转录因子在体内的作用大体上可以分成两种:一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。
发明内容
本发明的目的是提供水稻转录因子0s01gl8440基因的应用。为了实现本发明目的，本发明提供水稻转录因子0s01gl8440基因在提高水稻产量及调控水稻高杆性状中的应用，所述水稻转录因子0s01gl8440基因的序列为:i)Seq IDN0.1所示的核苷酸序列；ii)在严格条件下与Seq ID N0.1所示序列杂交的核苷酸序列。所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。水稻转录因子0s01gl8440基因所编码蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.2所示。根据前述的应用，其是将水稻转录因子0s01gl8440基因的⑶S序列构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，筛选并最终获得转基因水稻。所述VP16来自单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus), 4个转录因子激活基序VP16的核苷酸序列如Seq IDN0.3所示。根据前述的应用，其是将水稻转录因子0s01gl8440基因的Q)S序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，筛选并最终获得转基因水稻。具体地，前述的应用包括以下步骤:I)根据水稻转录因子0s01gl8440基因序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F:5/ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTCGCAAGAAGATCGT-3'和反向引物 R:5' -CAAGAAAGCTGGGTCTTACATGGGAGGGAAAGATGG-3'；2)以野生日本晴‘kitaake’水稻cDNA为模板，利用上述引物，通过PCR扩增获得0s01gl8440基因全序列；3)将PCR产 物克隆至pDONER克隆载体上，经测序正确；4)以双元表达载体PCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将 ubi promoter-VP64-Gateway 表达单兀、35S promoter-asRED 表达单兀和 35Spromoter-bar表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-bar_asRED的全序列如Seq IDN0.4所示；5)通过LR反应将目的基因0s01gl8440构建到载体nVP64-bar_asRED上，获得植物表达载体ub1:VP64-0s01gl8440，其序列如Seq ID N0.5所示；6)采用农杆菌介导法、直接DNA转化、微注射或电穿孔方法等常规生物技术方法，将载体ubi:VP64-0s01gl8440导入水稻中，筛选并最终获得转基因水稻。进一步地，步骤6)采用农杆菌介导的方法，利用PCAMBIA1301将载体ubi:VP64-0s01gl8440转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养、脱菌、筛选、分化、生根、炼苗和移栽，用Basta筛选转基因水稻植株。本发明还提供一种植物表达载体ub1:VP64-0s01gl8440，其核苷酸序列如Seq IDN0.5所示。
本发明还提供含有载体ubi:VP64-0s01gl8440的工程菌。本发明还提供载体ub1:VP64-0s01gl8440在提高水稻产量及调控水稻高杆性状中的应用。采用农杆菌介导法、直接DNA转化、微注射或电穿孔方法等常规生物技术方法，将载体ubi:VP64-0s01gl8440导入水稻中，筛选并最终获得转基因水稻。进一步地，采用农杆菌介导的方法，利用pCAMBIA1301将载体ubi:VP64-0s01gl8440转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养、脱菌、筛选、分化、生根、炼苗和移栽，用Basta筛选转基因水稻植株。本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻转录因子0s01gl8440基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，改变株高并调节水稻的开花期，从而提高水稻产量。对于详细阐明水稻开花、果实成熟及发育调控机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因技术，提高水稻的产量，在生产实践中也具有重要意义。
图1为本发明实施例1中nVP64-bar_asRED载体图谱。图2为本发明实施例1中ubi:VP64-0s01gl8440载体图谱。图3为本发明实施例3中VP64-0s01gl8440组成型转录因子过表达的转基因阳性株系的PCR鉴定结果；其中，WT为野生型水稻‘kitaake’，ubi:VP64-0s01gl8440转基因水稻株系。图4为本发明实施例3中Western blot检测转基因VP64_0s01gl8440阳性株系结果；其中，WT为野生型水稻‘kitaake’，MADS-43、MADS-09为VP64_0s01gl8440转基因水
稻株系。图5为本发明实施例4中VP64(4XVP16)激活0s01gl8440水稻高产的考种分析结果；其中，WT 为野生型水稻 ‘kitaake’，MADS-09、MADS-13、MADS-43 为 VP64_0s01gl8440转基因水稻株系。图6为本发明实施例4中VP64(4XVP16)激活0s01gl8440水稻表型分析结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1 0s01gl8440基因的分离和植物表达载体构建登录 http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml 网站，找到0s01gl8440基因，根据其序列设计PCR扩增引物，正向引物F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTCGCAAGAAGATCGT-3'和反向引物 R: 5' -CAAGAAAGCTGGGTCTTACATGGGAGGGAAAGATGG-3'；以野生日本晴‘kitaake’水稻总cDNA为模板，进行PCR扩增，获得0s01gl8440全序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，其所编码蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.2所示。按照PrimeSTA R聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR反应。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的弓I物采用添加了部分adaptor attB接头的基因引物，而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物。将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将0s01gl8440基因构建到其目的基因的N端融合了 VP64标签的植物表达载体nVP64-bar-asRED上(质粒图谱见图1)，获得载体ubi:VP64-0s01gl8440 (质粒图谱见图2，载体全序列如Seq ID N0.5所示)。其中，植物表达载体nVP64-bar_asRED的构建过程为:以双元表达载体pCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubipromoter-VP64_Gateway 表达单兀、35S promoter-asRED 表达单兀和 35S promoter-bar 表达单元与之融合构建得到，载体nVP64-bar_asRED的全序列如Seq ID N0.4所示。实施例2转基因水稻植株的获得取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上，选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导的方法利用pCambial301将载体ubi:VP64-0s01gl8440转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，用Basta筛选转基因水稻，长出4片幼叶后开始喷洒Basta (1:1000/V: V)，隔I天喷I次，共喷洒3次。实施例3转基因水稻的鉴定为了检测0s01gl8440基因是否整合至水稻基因组中，分别提取野生型和转基因水稻叶片DNA，在基因两端的植物表达载体上设计一段引物进行PCR反应，鉴定转基因植株，对PCR产物进行检测，结果发现，转基因水稻均扩增出目的条带(图3)，而野生型水稻中无此目的条带，初步确定0s01gl8440基因已通过农杆菌介导的方法插入到水稻基因组中，PCR产物经测序分析为正确的目的基因序列。利用VP64抗体可以鉴定目的基因是否在转基因水稻中表达,用Western blot技术在蛋白质水平上鉴定，经 过SDS-PAGE蛋白电泳-免疫印记之后-免疫荧光反应，Westernblot鉴定结果表明转基因植株杂交出目的蛋白，而野生型植株未杂交出目的蛋白(图4)。实施例4转基因水稻表型分析和考种分析将转基因和野生型水稻进行比较，从表型上可以明显的看出转基因植株比野生型高，并且在花周期上表现出适当晚花。通过考种的数据分析结果可以明显的看出转基因水稻的单株产量与野生型相比有明显的提高(图5)。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.水稻转录因子0s01gl8440基因在提高水稻产量及调控水稻高杆性状中的应用，所述水稻转录因子0s01gl8440基因的序列为 1)Seq ID No. I所示的核苷酸序列； ii)在严格条件下与Seq ID No. I所示序列杂交的核苷酸序列； 所述严格条件为在含O. 1%SDS的O. I X SSPE或含O. 1%SDS的O. I X SSC溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s01gl8440基因的CDS序列构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，筛选并最终获得转基因水稻; 所述VP16来自单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus), 4个转录因子激活基序VP16的核苷酸序列如Seq ID No. 3所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s01gl8440基因的⑶S序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，筛选并最终获得转基因水稻。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤 O根据水稻转录因子0s01gl8440基因序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTCGCAAGAAGATCGT-3'和反向引物 R : 5' -CAAGAAAGCTGGGTCTTACATGGGAGGGAAAGATGG-3'； 2)以野生日本晴水稻cDNA为模板，利用上述引物，通过PCR扩增获得0s01gl8440基因全序列； 3)将PCR产物克隆至pDONER克隆载体上，经测序正确； 4)以双元表达载体PCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将 ubi promoter-VP64-Gateway 表达单兀、35S promoter-asRED 表达单兀和 35Spromoter-bar表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-bar_asRED的全序列如Seq IDNo. 4所示； 5)通过LR反应将目的基因0s01gl8440构建到载体nVP64-bar_asRED上，获得植物表达载体 ubi :VP64-0s01gl8440，其序列如 Seq ID NO. 5 所示； 6)采用农杆菌介导法、直接DNA转化、微注射或电穿孔方法将载体ubiVP64-0s01gl8440导入水稻中，筛选并最终获得转基因水稻。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤6)采用农杆菌介导的方法，利用PCAMBIA1301将载体ubi VP64-0s01gl8440转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养、脱菌、筛选、分化、生根、炼苗和移栽，用Basta筛选转基因水稻植株。
6.植物表达载体ubi:VP64-0s01gl8440，其核苷酸序列如Seq ID NO. 5所示。
7.含有权利要求6所述载体的工程菌。
8.权利要求6所述载体在提高水稻产量及调控水稻高杆性状中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，采用农杆菌介导法、直接DNA转化、微注射或电穿孔方法将载体ubi VP64-0s01gl8440导入水稻中，筛选并最终获得转基因水稻。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，利用PCAMBIA1301将载体ubi VP64-0s01gl8440转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的材料经过共培养、脱菌、筛选、分化、生根、炼苗和移栽，用Basta筛 选转基因水稻植株。
全文摘要
本发明涉及水稻转录因子Os01g18440基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os01g18440基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，改变株高和调节水稻的开花期，从而提高水稻产量。对于详细阐明水稻开花、果实成熟及发育调控机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因技术，提高水稻的产量，在生产实践中也具有重要意义。
文档编号C12N1/21GK103255148SQ20131015613
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者赵涛, 姜文洙, 周婷婷, 刘斌, 刘军, 李宏宇, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所