同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体(独立融合表达型)的制作方法
【专利摘要】本发明涉及同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-IRES-EGFP?substantive?fusion(独立融合表达型)。它是在pIRES2-EGFP的基础上，将DsRed2、IRES经重叠延伸PCR和基因亚克隆操作而得。将目的基因克隆入本载体的DsRed2?3`端MCS1区或EGFP5`端MCS2区并转染细胞，pCMV启动转录包含DsRed2或DsRed2及其3`端融合目的基因、IRES和EGFP或EGFP及其5`端目的基因的全长mRNA，含DsRed2部分由5`帽子结构起始翻译，EGFP部分由IRES介导独立翻译。成熟蛋白中的融合DsRed2或EGFP能被目的基因产物携带在细胞内进行转运、分布，并对该过程进行示踪。优化的两MCS序列适合更广泛外源基因片段的克隆操作；DsRed2和EGFP的检测时效范围宽，且相互独立、互为表征，成像效果清晰、鲜明，使实验操作更简便、高效。
【专利说明】同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体(独立融合表达型)
【技术领域】
[0001]本发明涉及同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体(独立融合表达型)，是用于目的基因片段的表达并对其在细胞中的分布进行定位的载体质粒。
【背景技术】
[0002]鉴于荧光蛋白基因在活细胞中的表达产物具有生物活性稳定、信号特异性强、有效活性维持时间长、方便检测和与融合共性外源基因相互影响小等特点，基因工程中常用作生物筛选标记，来研究外源目的基因的表达及其蛋白产物的胞内分布和定位。通常情况下，同一报告基因载体中仅含有一个荧光蛋白基因，将目的DNA片段克隆到荧光蛋白基因的N端或C端,构建的重组质粒转染相应宿主细胞，通过检测突光蛋白的表达即可判定目的核酸片段是否具有相应功能，但难以同时进行在荧光蛋白基因的N端或C端进行表达，也难以同步反映重组报告基因质粒的转染效率和判定目的基因的生物活性。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-1RES_EGFP substantive fusion(独立融合表达型)，已于 2013 年 05 月 17 日送藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏号CGMCC7627。
[0004]本发明构建同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体(独立融合表达型)所采用的技术方案是:利用基因克隆技术，在亲本载体PIRES2-EGFP启动子pCMV与SV40polyA序列之间置换入如下DNA序列:自5'至3'方向依次插入红色突光蛋白基因DsRed2、多克隆酶切位点序列 MCSl (包括 Mlu 1、Sal 1、Spe 1、Sca 1、Bgl 11,Xho 1、Sac I, Xba I)、IRES、绿色荧光蛋白基因 EGFP 和 MCS2(包括 EcoR 1、Pvu I, EcoRV, Sac I1、BamH 1、Sma 1、NheI)(如SEQ N0.1中的第591-2642nt)，获得如SEQ N0.1 (第l_5980nt)所示核苷酸序列的同向串联共表达双色荧光蛋白的新型报告基因载体质粒pDsRed2-1RES-EGFP substantivefusion (独立融合表达型)。
[0005]所述同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体(独立融合表达型)的DNA分子也属于本发明的保护范围。
[0006]含有所述载体分子、所述重组报告基因载体的转基因重组菌或细胞也属于本发明的保护范围。
[0007]本发明的同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体(独立融合表达型)具备经直接酶切、连接构建插入目的基因的重组报告基因质粒及转染细胞等简单操作，就可以用于分析和鉴定目的基因生物活性的功用:由PCMV启动转录的多顺反子mRNA中，在上游红色荧光蛋白基因DsRed2的3'端MCSl和下游绿色荧光蛋白基因EGFP的5'端MCS2中，皆可插入外源目的基因序列进行融合式共表达，DsRed2或EGFP对目的基因的表达及其蛋白产物的生物活性没有明显影响，方便对多基因共表达及其蛋白活性分析和多基因产物相互关系的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-1RES_EGFPsubstantive fusion(独立融合表达型)的构建图谱。
[0009]图2各载体质粒转染CHO细胞的荧光检测结果。
【具体实施方式】
[0010]下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规基因克隆方法，所用试剂均可经商业途径购得。
[0011]实施例
[0012]1.载体骨架的PCR扩增与克隆
[0013]在载体plRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)和 pDsRed2_Cl (PT3603-5, Clontech)的基础上，设计在pCMV末端重叠部分DsRed25'序列的引物VRf-R、rGF F-EvSBaSN,经PCR反应扩增缺失MCS、IRES片段的载体骨架(包括pCMV、PUC or1、Kan/Neo、SV40polyA功能或基因序列):
[0014]VRf-R : 5'-GTGATGACGTTCTCGGAGGAGGCCATGGTGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCTG-3'。
[0015]rGF F-EvSBaSN:5' -TTATAATTATGATATCCGCGGATCCCGGGAGCTAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'，(含有 EcoRV、Sac I1、BamH 1、SmaI 和 Nhe I 的识别位点);
[0016]25μ I 反应体系的组成是:双蒸水 15.Ομ 1，Ex TaqlO X Buff er2.5 μ I,dNTPs2.0 μ 1，MgCl2L 5 μ 1，rGFF-EvSBaSNl.0 μ 1，VRf-Rl.0 μ 1，pIRES2_EGFPTE 溶液
1.Ομ I, ExTaql.0y I。PCR 反应条件是 95°C 5min ；95°C 50sec,55°C 50sec,72°C 5min，共32个循环；最后经72°C 15min充分延伸后冷却至4°C保存。
[0017]PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离大小为4709bp的PCR产物，切胶回收后与PMD18-T Simple Vector连接构建重组克隆。经常规转化经CaCl2制备的DH5 α感受态细胞，涂布含Ampicillin (100 μ g/ml)的LB固体平板，37°C过夜培养。选取平板上优势抗性生长的单菌落，用引物rGF F-EvSBaSN、VRf-R做菌落PCR检测。挑取阳性克隆菌落，在含Ampicillin (100 μ g/ml)的LB液体培养基中过夜扩增，提取质粒分别进行EcoR 1、BamH I单酶切反应，鉴定载体质粒psT-V。
[0018]2.DsRed2的PCR扩增与克隆
[0019]以载体pDsRed2_Cl (PT3603-5, Clontech)为模板，设计5'端重叠部分PIRES2-EGFP pCMV 末端的引物 rDsR F、rDR R-MSSSBg 扩增 DsRed2 基因(723nt):
[0020]rDsR F:5'-GTTTAGTGAACCGTCAGATCACCATGGCCTCCTCCGAGAAC-3' ；
[0021]rDR R-MSSSBg:5'-TAAGATCTAGTACTAGTCGACGCGTCAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3'，(含有 Mlu 1、Sal 1、Spe 1、Sca 1、Bgl II 识别位点)。
[0022]PCR 反应体系是:双蒸水 15.0 μ 1，Ex TaqlOxBuff er2.5 μ 1，dNTPs2.0μ I,MgCl2L 5 μ 1，DsRed2Fl.0μ 1，DsRed2Rl.0μ 1，pDsRed2_ClTE 溶液 1.0 μ 1，Ex Taql.0 μ I。PCR 扩增条件是 95 °C 5min ；95 °C 50sec,55°C 50sec,72°C 50sec,共 32 个循环；最后经72°C IOmin充分延伸后冷却至4°C保存。
[0023]PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收后与pMD18-T Simple Vector连接。连接产物经常规转化经CaCl2制备的DH5a感受态细胞，涂布含Ampicillin的LB固体平板，37°C过夜培养。用引物rDsR F、rDR R-MSSSBg做菌落PCR检测，阳性克隆菌落经含Ampicillin LB液体培养基扩增，提取质粒分别进行Mlu 1、Bgl II单酶切，鉴定重组质粒psT_DsRed2m。
[0024]3.重叠延伸PCR扩增载体骨架与DsRed2的串联片段及其克隆
[0025]以psT-V 和 psT-DsRed2m 为模板，用引物 rGF F-EvSBaSN,rDR R-MSSSBg 进行重叠延伸PCR扩增载体骨架与DsRed2的串联片段(5382nt)。
[0026]PCR 反应体系是:双蒸水 15.0μ 1，Ex Taq 10 X Buf f er2.5 μ I, dNTPs2.0 μ I,MgCl2L 5 μ 1，rGF F-EvSBaSNl.0 μ I, rDR R-MSSSBgl.Ομ I, psT-V TE 溶液 0.5 μ 1，psT-DsRed2m TE 溶液 0.5 μ 1，Ex Taql.0 μ L.PCR 扩增条件是 95 °C 5mira95 °C 50sec，55°C50sec，72°C5min50sec，共32个循环；最后经72°C 15min充分延伸后冷却至4°C保存。
[0027]PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收后与pMD18_T Simple Vector连接。连接产物经常规转化经CaCl2制备的DH5 α感受态细胞，涂布含Ampicillin的LB固体平板，37°C过夜培养。用引物rGF F-EvSBaSN, rDR R-MSSSBg做菌落PCR检测，阳性克隆菌落经在含Ampicillin LB液体培养基扩增，提取质粒进行EcoR V、Mlu I双酶切反应，鉴定重组质粒psT-V_DsRed2。
[0028]4.1RES的PCR扩增与克隆
[0029]以载体plRES2- EGFP(PT3267-5，Clontech)为模板，用引物 rlRES F-BgXhSXb,rlRES R-EiPvEv 进行 PCR 扩增 IRES 片段(637bp):
[0030]rRES F-BgXhSXb:5'-TATATTAAGATCTCGAGCTCTAGAGCCCCTCTCCCTCCCCCCC-3' ；
[0031]rRES R-EiPvEv:5'-GGCGCCGCGGATATCGATCGAATTCCATTGTGGCCATATTATCATCG-3'。
[0032]PCR 反应体系是:双蒸水 15.0 μ I，Ex TaqlO X Buffer2.5 μ I，dNTPs2.Ομ I,MgCl2L 5 μ 1，rlRES F-BgXhSXb1.0 μ 1，rlRES R-EiPvEvl.0 μ 1，plRES2_EGFP TE 溶液 1.0μ 1，Ex Taql.0 μ I。PCR 扩增条件是 95 °C 5min ；95 °C 50sec，55 °C 50sec,72°C 5min50sec，共32个循环；最后经72°C IOmin充分延伸后冷却至4°C保存。
[0033]PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收后与pMD18-T Simple Vector连接。连接产物经常规转化经CaCl2制备的DH5a感受态细胞，涂布含Ampicillin的LB固体平板，37°C过夜培养。用引物rIRESF-BgXhSXb、rIRES R-EiPvEv做菌落PCR检测，阳性克隆菌落经在含AmpiciHin LB液体培养基扩增，提取质粒进行Xho 1.EcoR I双酶切反应，鉴定重组质粒psT-1RESm。
[0034]5.构建同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体pDsRed2-1RES_EGFPsubstantive fusion (独立融合表达型)
[0035]取psT-V_DsRed2、psT-1RESm同样经Bgl I1、EcoR V双酶切后的目的片段V-DsRed2Bg_v (5359bp)、IRESBg_v (621bp)，用 T4 连接酶进行连接。10 μ I 的反应体系是:IOXT4Bufferl.0 μ 1，V_DsRed2Bg_vl.0 μ 1，IRESBg_v7.0 μ 1，T4Iigasel.0 μ I。连接反应条件是16°C 4h，到时转至4°C保存。[0036]连接产物常规转化经CaCl2制备的DH5 α感受态细胞，涂布含Kanamycin (50 μ g/ml)的LB固体平板培养基，37°C过夜培养。到时挑取优势抗性单克隆菌落经在含Kanamycin (50 μ g/ml)的LB液体培养基过夜培养，提取质粒分别进行Mlu I和EcoR 1、BglII和EcoR V组合的双酶切反应，鉴定重组质粒pDsRed2-1RES_EGFP substantive fusion。
[0037]6.细胞转染
[0038]取亲本载体质粒pIRES2-EGFP、pDsRed2_Cl 和重组载体质粒 pDsRed2-1RES_EGFPsubstantive fusion、各约0.8 μ g,参照《分子克隆(第三版)》P1276-1281,用Lipofectamine转染已长成单层的CHO细胞。24h后将转染细胞置于突光显微镜下检测绿色和红色荧光蛋白的表达。
[0039]荧光检测结果如图2所示，亲本载体质粒pDsRed2-Cl转染的细胞中只有红色荧光蛋白表达(图2，B)，pIRES2-EGFP转染的细胞中只有绿色荧光蛋白表达(图2，C)，同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体质粒pDsRed2-1RES-EGFP substantive fusion转染的细胞中红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白都有表达(图2，D、E、F);同时以未转染的空白CHO细胞作对照(图2，A)。
[0040]图2中，A:未转染的空白CHO细胞，B:PDsRed2-Cl转染的CHO细胞，C:PIRES2-EGFP 转染的 CHO 细胞，D:pDsRed2-1RES-EGFP substantive fusion 转染的 CHO 细胞中红色突光蛋白表达效果，E:pDsRed2-1RES_EGFP substantive fusion转染的CHO细胞中绿色突光蛋白表达效果，F:pDsRed2-1RES-EGFPsubstantive fusion转染的CHO细胞中红绿荧光蛋白表达后的叠加效果 。
【权利要求】
1.一种DNA分子，其特征是:经IRES序列串联的可同向串联共表达双色荧光蛋白报告基因载体 pDsRed2-1RES-EGFP substantive fusion (独立融合表达型)，具有 SEQ N0.1 中第 591-2642nt 的 DNA 序列。
2.含有权利要求1所述报告基因载体质粒的构建方法。
3.根据权利要求2所述的报告基因载体质粒，其特征在于:pCMV下游连接有由IRES串联独立共表达的双色荧光蛋白报告基因序列DsRed2-1RES-EGFP，其中在DsRed2基因3'末端、终止密码子前含有优化的MCSl序列，在EGFP基因5'端、起始密码子之后含有优化的MCS2序列，所述报告基因载体的核苷酸序列为SEQ N0.1中的第l_5980nt的DNA序列。
4.含有权利要求1所述报告基因载体质粒的转基因细胞。
5.含有权利要求2或3所述报告基因载体质粒的转基因细胞。
6.含有权利要求1所述报告基因载体质粒的重组菌。
7.含有权利要求2或3所述报告基因载体质粒的重组菌。
8.权利要求2或3 所述报告基因载体质粒在检测目的基因功能中的应用。
【文档编号】C12N1/15GK103468728SQ201310295917
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2013年7月12日
【发明者】王玉, 姜世金, 于爱莲, 于广福, 施鲁笛 申请人:泰山医学院