顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用，所述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列，由该基因编码的顺式环氧琥珀酸水解酶具有如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列。用所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因构建的原核表达载体转化大肠杆菌构建基因工程菌，该基因工程菌经过诱导后能将顺式环氧琥珀酸或其盐高效率地转化为L(+)-酒石酸或其盐，从该大肠杆菌中获得的顺式环氧琥珀酸水解酶具有将顺式环氧琥珀酸或其盐高效率地转化为L(+)-酒石酸或其盐的能力。
【专利说明】顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物基因工程领域，提供了一种新的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因及其编码的多肽，进一步提供了用于编码这种多肽的多核苷酸，用于表达该种多肽的重组表达载体和重组微生物菌株及制备L (+)-酒石酸或其盐的方法。
【背景技术】
[0002]L(+)_酒石酸[(2R，3R)-2，3-二羟丁烷_1，4 二羟酸]是一种天然结构的有机酸，在某些植物果实如葡萄、罗望子果实中有较高的含量，广泛应用于食品、医药、建筑、化工、纺织、电镀等行 业，其需求量正在逐年递增。过去，生产L(+)_酒石酸的主要方法是从葡萄酒的副产物酒石中提取得到。目前主要利用微生物所分泌表达的顺式环氧琥珀酸水解酶来生产L (+)-酒石酸或其盐:先以顺丁烯二酸酐为原料加水得到顺丁烯二酸，再以钨酸或钨酸盐为催化剂使顺丁烯二酸与过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，最后利用顺式环氧琥珀酸水解酶或具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)_酒石酸或其盐。
[0003]1974年，佐藤英次等采用酶法合成L(+)_酒石酸，即用化学合成的顺式环氧琥珀酸作为底物，在含有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物作用下，使底物水解为L(+)_酒石酸，而且几乎不产生副产物。
[0004]1976 年，Kamatani 等在 M.S.M.S.Pat.N0.4028185A、M.S.Pat.N0.4013509A 和M.S.Pat.N0.4011135A中阐述了利用微生物转化顺式环氧琥珀酸生产L(+)-酒石酸的方法，使L (+)-酒石酸的大量生产真正成为可能。
[0005]目前报道的可以用于生产L(+)_酒石酸或其盐的微生物主要有:无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和棒状杆菌属(Coryncbacterium)。
[0006]一般认为，微生物转化法生产L(+)_酒石酸具有酶立体专一性好、酶促反应快、产品光学纯度和产品得率高、产品分离纯化简单易行等特点。但是由于微生物体内固有的酶系统非常复杂，顺式环氧琥珀酸水解酶的表达量不高，其活性也受到胞内胞外多种因素的制约，导致L(+)_酒石酸生产效率低下。利用基因工程技术构建具有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的基因工程菌，可以实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，这也成为工业生产L(+)_酒石酸的关键。
【发明内容】
[0007]本发明的主要目的在于，克服现有的顺式环氧琥珀酸水解酶表达量不高，导致L (+)_酒石酸生产效率低下的缺陷，而提供一种新的顺式环氧琥珀酸水解酶编码基因，所要解决的技术问题是实现由其编码的顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，进而提高L(+)_酒石酸的生产效率。
[0008]本发明提供了一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其核苷酸序列来源于分离纯化的克雷伯氏菌BK-58菌株(Klebsiella sp.BK-58),优选为具有中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号CGMCC N0.4949的克雷伯氏菌BK-58菌株，其拉丁文学名为Klebsiella sp.BK-58，于2011年6月12日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院
3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
[0009]上述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列(基因组DNA、cDNA或RNA)，与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有70%以上，优选为80%以上，更优选为90%以上的同源性。具体来说，本发明提供的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列可以是SEQID NO:1所示核苷酸序列的等位基因变异体，或者是从其他物种分离得到的核苷酸序列，也可以是SEQ ID NO:1所示核苷酸序列截短、删除、替代或增加一个或整个核苷酸的结果。序列之间的同源性可以用标准的比对方法确定，比如ClustalX。
[0010]本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列是含有全部SEQ IDNO:1所示序列的核苷酸序列或含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列。
[0011]前述的“含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列”是指该序列含有超过100个与SEQ ID NO:1所示序列中的核苷酸相同的核苷酸，亦指其编码的氨基酸多肽具有与由全部SEQ ID NO:1所示序列编码的氨基酸多肽(即SEQ ID NO: 2的完整氨基酸序列)相似的顺式环氧琥珀酸水解酶活力。
[0012]上述“含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列”编码的氨基酸多肽具有与由全部SEQ ID NO:1所示序列编码的氨基酸多肽(即SEQ ID NO: 2)相似的顺式环氧琥珀酸水解酶活力，优选具有SEQ ID NO:280%以上的顺式环氧琥珀酸水解酶活力，更优选具有SEQ ID NO:2100%的顺式环氧琥珀酸水解酶活力。
[0013]本发明还提供了一种重组核苷酸序列，其含有前述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列，且邻接有一个或多个、来源于同源或异源微生物的调控序列。
[0014]所述的调控序列，其包括选自启动子序列、分泌信号序列、终止信号序列等调控序列中的一种或多种。
[0015]本发明另外提供了一种含有前述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列的载体，其任选地还包含一个或多个来源于同源或异源微生物的调控序列。
[0016]所述“载体”系指所有可用于将核苷酸序列转导或转染进入宿主细胞的生物化学构架。本发明涉及的载体可为质粒、病毒、噬菌粒、脂质体、阳离子囊泡中的一种或几种。上述载体中可以包含一个或多个前述的调控序列。本发明的载体优选为质粒。
[0017]本发明涉及的宿主细胞，优选为一种重组宿主细胞，其由本发明所述核苷酸序列或载体经转化而来。
[0018]前述的“本发明所述核苷酸序列或载体经转化而来的宿主细胞”，系指该宿主本身没有前述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列或载体，而是经过转化后，使得宿主带有该核苷酸序列或载体。
[0019]上述宿主细胞 能表达前述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列或载体，并且产生前述核苷酸序列或载体编码的氨基酸序列。本发明涉及的前述核苷酸序列能整合到所选宿主的基因组中，或以游离型载体的形式存在于前述宿主细胞中。
[0020]为了便利起见，本发明涉及的重组宿主细胞包括微生物，优选为细菌和真菌，包括酵母。上述重组宿主细胞经改造优选后，能高水平地表达顺式环氧琥珀酸水解酶。
[0021 ] 上述“高水平地表达”是在前述重组宿主细胞中，通过相邻调控序列控制前述核苷酸序列来实现过量表达。
[0022]本发明另外又提供了一种分离纯化后得到的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列，其由前述分离纯化后的核苷酸编码，并(或)由前述重组宿主细胞表达。
[0023]本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶，其分子量在25_35kDa，优选为约30kDa(理论值为 30.124kDa)。
[0024]本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列或其多肽由前述重组宿主细胞胞外或胞内表达和(或)分泌表达。
[0025]本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有50%以上，优选为70%以上，更优选为90%以上的同源性。
[0026]本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的全部或部分(50个以上，优选100个以上的氨基酸)，其顺式环氧琥珀酸水解酶活力至少为完整氨基酸序列SEQ ID NO:2的80%以上，优选为95%以上。即，可将本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个，几个，例如2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个氨基酸，或多个，例如10个或10个以上氨基酸，但仍可维持其活力。本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶或其部分序列的分子量约30kDa或更低或更高。
[0027]本发明涉及的顺式环氧琥珀酸水解酶可通过无争议的酶实验鉴定，比如将顺式环氧琥珀酸或其盐水解成L (+)_酒石酸或其盐。在合适的培养基中培养微生物并产酶。用该培养物或分离该培养物中的微生物细`胞，并检测其酶活力。
[0028]在合适的培养中诱导野生型微生物或本发明所述的重组细胞产顺式环氧琥珀酸水解酶，通过熟知的方法如柱层析，分离出目的顺式环氧琥珀酸水解酶，检测酶氨基酸序列的“活性部位”，并从上述野生型微生物或重组细胞中获得顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的DNA序列。
[0029]顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的DNA序列，通过从微生物中纯化出的顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和C-末端序列获得。
[0030]本发明中，通过纯化出的顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和C-末端序列设计兼并引物，经过PCR技术，将约0.Skb含顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的PCR产物插入PUCm-T载体。整个插入片段的DNA序列通过所属领域的技术人员熟知的测序技术检测。
[0031]设计含Nde I和BamH I限制性内切酶位点的引物，通过PCR技术，得到含顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的PCR产物，将此PCR产物插入pUCm-T载体，并用Nde I和BamHI限制性内切酶消化该含有顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的PUCm-T载体，并将该酶切后的片段插入pET22b(+)载体相应的限制性酶切位点处。整个插入片段的DNA序列通过所属领域技术人员熟知的测序技术检测。
[0032]上述构建好的插入了顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的pET22b(+)表达载体在大肠杆菌宿主中表达。含插入了顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的pET22b(+)质粒的上述大肠杆菌宿主，培养在含相应抗生素的合适培养基(比如LB培养基)中，使插入了顺式环氧琥珀酸水解酶编码序列的pET22b(+)质粒能持续的存在于宿主细胞中，然后收集上述细胞并测定顺式环氧琥珀酸水解酶活力。
[0033]本发明中顺式环氧琥珀酸水解酶基因并不仅限于在大肠杆菌中表达。本发明中顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的DNA片段能很便利地在细菌或真菌，包括酵母中表达。为了使上述基因能在细菌、真菌以及酵母中表达，顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的DNA序列可以通过控制与其相邻的DNA序列(如启动子、终止子、上游激活序列等)使得该基因在所选宿主中最终得以(过量)表达。
[0034]顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的DNA序列通过恰当的修饰，可以使顺式环氧琥珀酸水解酶分泌(胞外表达)在宿主细胞培养基中。这种修饰通常可通过插入编码引导序列的DNA序列来实现。该引导序列在所选宿主中通过分泌机制使得顺式环氧琥珀酸水解酶得以分泌表达并在宿主培养基中得以复性。
[0035]本发明提供了表达顺式环氧琥珀酸水解酶的宿主的培养条件(比如培养基、温度
坐')
寸/ o
[0036]本发明提供一种利用本发明涉及的重组宿主细胞或本发明涉及的顺式环氧琥珀酸水解酶氨基酸序列来水解一种顺式环氧琥珀酸或其盐。本发明所涉及的顺式环氧琥珀酸盐为顺式环氧琥珀酸与各种阳离子形成的盐，阳离子包括且不仅限于铵离子、钾离子、钠离子、镁离子和钙离子等。
[0037]本发明涉及的酶可以以下列形式应用:可直接利用培养后经过透析处理或未经透析处理的细胞；该酶可作为纯化的蛋白或细胞抽提`物(即经过一次或多次离心提取步骤后得到的宿主细胞的部分物质)。本发明涉及的酶能以上述任何形式与其它酶以上述任何形式联合应用。除此之外，顺式环氧琥珀酸水解酶在宿主细胞表达后分泌到其胞外的培养基中，并在培养基中复性。亦即，该酶制剂可与(或不与)一种或多种其它酶联合并以粗酶制剂或部分(或完全)纯酶制剂的形式应用。
[0038]本发明提供了一种利用本发明所述的基因工程菌生产L(+)_酒石酸或其盐的方法。在顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中加入本发明所述的基因工程菌细胞，在适当的温度下进行酶促反应，获得L(+)_酒石酸或其盐。其中，顺式环氧琥珀酸或其盐的摩尔浓度为0.1~2mol/L，优选为0.5~1.5mol/L,更优选为0.8~1.2mol/L ;反应温度为10~55°C，优选为20~45°C，更优选为32~40°C ;顺式环氧琥珀酸或其盐溶液的pH值为4.5~11.0，优选为6.0~9.5，更优选为8.0~9.0。
[0039]本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。借由上述技术方案，本发明可达到相当的技术进步性及实用性，并具有产业上的广泛利用价值，其至少具有下列优点:本发明从克雷伯氏菌BK-58菌株中克隆了顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其核苷酸序列和目前文献报道的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列均不相同，是一种新的顺式环氧琥珀酸水解酶基因；由本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因编码的顺式环氧琥珀酸水解酶，其氨基酸序列和目前文献报道的顺式环氧琥珀酸水解酶氨基酸序列均不相同，是一种新颖的顺式环氧琥珀酸水解酶；含有本发明所述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的基因工程菌酶活力是目前文献报道的最高的。
[0040]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为本发明实施例3中的PCR产物进行琼脂糖凝胶(1%)电泳的结果。
[0042]图2为本发明实施例4中的基因工程菌经过0.lmmol/L IPTG诱导、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
【具体实施方式】[0043]为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用其【具体实施方式】、结构、特征及其功效，详细说明如后。
[0044]本发明的整体思路包括以下几点:从克雷伯氏菌中分离纯化顺式环氧琥珀酸水解酶，对顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端和C-末端进行测序，根据此N-末端和C-末端的氨基酸序列设计兼并引物，从克雷伯氏菌中克隆顺式环氧琥珀酸水解酶基因，构建原核表达载体，转化大肠杆菌，对转顺式环氧琥珀酸水解酶基因的大肠杆菌进行培养，验证顺式环氧琥珀酸水解酶基因的功能。以上各点皆为单独实施例，以下将结合具体实施例作进一步详细说明。
[0045]实施例1:顺式环氧琥珀酸水解酶的分离纯化
[0046]克雷伯氏菌BK-58 (Klebsiella sp.BK-58)保存于LB斜面培养基，该斜面培养基的组成为:1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物，1.5%琼脂，pH7.0。
[0047]1:顺式环氧琥珀酸水解酶活力的测定
[0048]取1.0g湿细胞，生理盐水洗两次，用IOmL lmol/L的顺式环氧琥珀酸钠(pH8.0)悬浮湿细胞,37 °C反应Ih,测定反应液中酒石酸的含量。
[0049]反应液中酒石酸含量的检测方法如下:取2.5mLl%的偏钒酸铵溶液，置于一个25mL的容量瓶中，加适量的上述反应液后，再加ImL lmol/L的硫酸，用蒸馏水定容至25ml，混匀后取一部分用分光光度计测定480nm处的吸光值，并根据制定的L(+)_酒石酸标准曲线计算反应液中酒石酸的含量。
[0050]酶活单位定义为:在上述反应条件下，1.0g湿细胞Ih产生I mo I酒石酸所需的酶量。
[0051]为了快速定量检测在可溶性酶液中顺式环氧琥珀酸水解酶的活力，其检测方法如下:在3.9mL0.lmol/L的磷酸钾缓冲液(pH8.0)中加入1.0mL lmol/L的顺式环氧琥珀酸钠底物，37°C保温5min后，加入0.1mL酶液，并在37°C反应20min，取适量上述反应液，用上述方法测定其中酒石酸的含量。
[0052]2:顺式环氧琥珀酸水解酶的分离纯化
[0053](I)从斜面培养基上接种克雷伯氏菌BK-58至LB培养基中，30°C振荡培养24h，形成种子液。LB培养基的组成为:1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物，pH7.0。
[0054](2)将种子液转接于发酵培养基中，30°C振荡24h，使其产顺式环氧琥珀酸水解酶，发酵培养基的组成为:1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物，1%顺式环氧琥珀酸钠，pH7.0。[0055](3)离心收集细胞，用0.lmol/L磷酸钾缓冲液悬浮。
[0056](4)悬浮液用超声破碎仪超声20min,8000rpm离心30min,收集上清液I。
[0057](5)上清液I中加硫酸铵至40%饱和度，1000Orpm离心20min，收集上清液2。
[0058](6)上清液2中加硫酸铵至75%饱和度，1000Orpm离心20nin，收集沉淀并用预冷的0.lmol/L磷酸钾缓冲液溶解。
[0059](7) 4°C于0.lmol/L磷酸钾缓冲液中透析48h，期间更换3_4次透析液。
[0060](8)透析后的酶液过 DEAE-Sepharose 柱(4.0cm 1.d.X 50cm),流速为 lmL/min,过柱流出液具有酶活。
[0061](9)过柱流出液用PEG20000浓缩，将浓缩液过Pheny-Sepharose柱(2.6cm
1.d.X 50cm)，用0.lmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗脱，流速为lmL/min，收集具有酶活性的流出液，并用PEG20000浓缩。
[0062](10)浓缩液过MonoQ HR5/5柱，并用0.lmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗脱，流速为0.2mL/min,收集具有酶活性的流出液，并用PEG20000浓缩。
[0063](11)步骤(8)到步骤(11)重复3次，取部分重复3次后的收集液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝R250染色，结果显示，纯化后的顺式环氧琥珀酸水解酶在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中条带单一，并且分子量约为30kDa。
[0064]实施例2:对顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端和C-末端进行测序
[0065]顺式环氧琥珀酸水解酶N-末端氨基酸序列和C-末端氨基酸序列通过常用的方法检测，其方法如下:将上述分离纯化后`得到的顺式环氧琥珀酸水解酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过Western杂交转移到PVDF膜上。该膜用考马斯亮蓝染色液染色，切割顺式环氧琥珀酸水解酶对应的条带并回收，然后用蛋白测序仪ABI PR0CISETM494cLC测其N-末端的10个氨基酸序列，用蛋白测序仪ABI PR0CISETM491cLC测其C-末端的10个氨基酸序列。测序结果显示，该顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端10个氨基酸序列为MKFSGASLFA (SEQID勵:3)，0末端10个氨基酸序列为”￡1^^^11^(5￡0 ID NO:4) ?
[0066]实施例3:设计兼并引物，克隆顺式环氧琥珀酸水解酶基因
[0067]根据上述顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端序列(SEQ ID N0:3)、C_末端序列(SEQID NO:4)和不编码氨基酸的终止密码子序列(TAA/TGA/TAG)设计两条兼并引物如下:
[0068]引物1:5，-ATGAARTTYWSNGGNGCNWSNYTNTTYGCN-3，(SEQ ID NO:5)；
[0069]引物2:5，-YYANGCNCCNARCATNCCNGCNARYTCNACNAC-3，(SEQ ID NO:6)；
[0070]其中，R:A/G,Y:C/T, ff:A/T, S:G/C, V:A/G/C, N:A/G/C/T。
[0071]用兼并引物克隆顺式环氧琥珀酸水解酶基因的步骤如下:
[0072](I)采用液体LB培养基，在30°C摇床以200rpm的转速培养克雷伯氏菌BK-58，12h后收集细胞，按照 AxyPrep Bacterial Genomic DNA MiniPrep Kit (AXYGEN)中所述的方法抽提克雷伯氏菌BK-58的基因组。
[0073](2)以上述基因组为模板，以引物I和引物2为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:步骤I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCRbuffer5 u LjMgCl2 (25mmol/L) 3 y L，弓 I物 I (10 y mol/ii L) I y L，弓 I物 2 (10 y mol/u L) I u L,dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,总体积 50 u L。
[0074](3)上述50 ii L PCR反应体系进行如下PCR反应程序:[0075]94°C 预热 5min ;然后 94°C 50s, 50°C 30s,72°C lmin,30 个循环；最后 72°C 延伸IOmin0
[0076](4)取上述PCR产物进行琼脂糖凝胶(1%)电泳。电泳结果如图1所示，其中，泳道I在750bp到1000bp之间有一条清晰的条带，而作为对照的泳道2无对应条带。回收泳道I的750bp到1000bp之间清晰条带的PCR产物并与pUCm-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5 a，挑取菌落进行测序验证。测序结果如SEQ ID NO:1所示，其长度为825个核苷酸，其中ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。利用BioXM软件将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列翻译成氨基酸序列得到如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列(即本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列)。将本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因和氨基酸序列分别与在线数据库中已报道的序列进行比对，发现在线数据库中已报道的序列与本发明的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因和氨基酸序列相似性都不超过50%，由此说明，本发明所获得的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因是一个新的基因。
[0077]实施例4:克雷伯氏菌顺式环氧琥珀酸水解酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
[0078]根据SEQ ID NO:1所示的序列设计含有限制性内切酶Nde I识别位点的正向引物3和含有限制性内切酶BamH I识别位点的反向引物4，引物3和引物4的序列分别为:
[0079]引物3:5，-CATATGAAATTTTCTGGCGCCTCT(SEQ ID NO:7)；
[0080]引物4:5，-GGATCCTTAGGCGCCCAGCAT(SEQ ID NO:8) ?
[0081] 以克雷伯氏菌BK-58的基因组为模板，引物3和引物4为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:实施例3步骤I所得的模板3 u L，Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCRbuffer5 u LjMgCl2 (25mmol/L) 3 y L，弓 I物 3 (10 y mol/ii L) I y L，弓 I物 4 (10 y mol/u L) I u L,dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,总体积 50 u L。
[0082]上述50 ii L PCR反应体系进行如下PCR反应程序:
[0083]94°C 预热 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s,72°C lmin,30 个循环；最后 72°C 延伸IOmin0
[0084]回收PCR产物并与pUCm-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5 a，挑取菌落进行测序验证。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因(如SEQ ID NO:1所示)进行比对，结果显示:含有限制性内切酶Nde I和BamH I识别位点的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因成功插入PUCm-T载体。然后用限制性内切酶Nde I和BamH I分别对含有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的PUCm-T载体和pET-22b (+)表达载体进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切下来的顺式环氧琥珀酸水解酶基因与酶切后的pET-22b(+)载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取菌落进行测序。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶基因进行比对，序列完全匹配，说明成功构建了含有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的pET-22b(+)重组载体和含有pET-22b(+)重组载体的基因工程菌。
[0085]此基因工程菌经过0.lmmol/L IPTG诱导、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果如图2所示。在图2的第3泳道(基因工程菌经IPTG诱导后的细胞裂解液样品)的25-35kDa之间有一条很浓的条带，该条带显示的蛋白大小与根据该顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列计算所得的蛋白大小相符；以只含pET22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段的大肠杆菌BL21为对照的第2泳道无对应蛋白条带，说明经IPTG诱导后，顺式环氧琥珀酸水解酶基因所编码的重组蛋白能高效表达。按照实施例1中顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定方法，对照菌没有顺式环氧琥珀酸水解酶活力，而含有本发明所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因的工程菌酶活力为35600U/g。
[0086]实施例5:利用本发明所述的基因工程菌制备L(+)酒石酸
[0087]本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet_Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用Bruker Avance DMX500核磁共振仪检测；样品的质谱用Bruker Esquire3000pl U s质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。
[0088]实施例4中所述的基因工程菌在IOOmL LB培养基中37°C振荡培养12h后，接A IL LB培养基中，37°C、200rpm振荡培养10h，然后向培养液中加入IOg顺式环氧琥珀酸二钠，继续37°C、200rpm振荡培养12h后，加入过量的CaCl2水溶液，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到14g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到6.7g固体产物。经红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为
[a] 1=+12.1。，证明该固体产物为右旋型酒石酸，即L (+)-酒石酸，且纯度为99.9%。
[0089]本实施例中的顺式环氧琥珀酸二钠可以替换为顺式环氧琥珀酸或其与各种阳离子形成的盐，阳离子包括且不仅限于铵离子、钾离子、镁离子和钙离子等。
[0090]实施例6:编码由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性的多肽基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
[0091]1.在本发明所述的顺式环氧琥珀酸水解酶基因的5’端随意添加一段核苷酸序列
[0092]根据SEQ ID NO:1所示的序列设`计含有限制性内切酶Nde I识别位点和一段随意添加的核苷酸序列的正向引物5，引物5的序列为:
[0093]引物5:5，-CATATGGACCGTCGTCAGTTCATGAAATTTTCTGGCGCCTCT(SEQ ID NO:9)；
[0094]以克雷伯氏菌BK-58的基因组为模板，引物5和实施例4中的引物4为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:实施例3步骤I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/U L) I U L, 10XPCR buffer5 u L, MgCl2 (25mmol/L) 3 u L,引物 5 (10 u mol/u L) I u L,引物
4(10 u mol/u L) I u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,总体积 50 u L。
[0095]上述50 ii L PCR反应体系进行如下PCR反应程序:
[0096]94°C 预热 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s,72°C lmin,30 个循环；最后 72°C 延伸IOmin0
[0097]回收PCR产物并与pUCm-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5 a，挑取菌落进行测序验证。其测序结果如SEQ ID NO: 10所示。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因(如SEQ ID NO:1所示)进行比对,结果显示:如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列相当于在如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’端添加了 ATGGACCGTCGTCAGTTC(SEQ ID NO: 11)这一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列相当于在SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的N-端添加了 6个氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。用限制性内切酶Nde I和BamH I分别对含有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列的pUCm-T载体和pET-22b(+)表达载体进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切下来的如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列与酶切后的pET_22b (+)载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建含有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列的pET-22b(+)重组载体和含有此pET-22b (+)重组载体的基因工程菌。
[0098]此基因工程菌在含100 U g/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C振荡培养过夜。以只含pET-22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段的大肠杆菌BL21为对照。按照实施例1中顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定方法，对照菌没有顺式环氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力为38800U/g。
[0099]利用本实施例所述的基因工程菌，用实施例5的方法制备L(+)酒石酸，同样得到纯度为99.9%的L(+)酒石酸。
[0100]2.在本发明所述的顺式环氧琥珀酸水解酶基因的3’端随意添加一段核苷酸序列
[0101]根据SEQ ID NO:1所示的序列设计含有限制性内切酶BamH I识别位点和一段随意添加的核苷酸序列的反向引物6，引物6的序列为:
[0102]引物 6:5，-GGATCCTTACTTGTTCGGCGTCTGTTTGGCGCCCAGCAT(SEQ ID NO: 14)；
[0103]以克雷伯氏菌BK-58的基因组为模板，引物6和实施例4中的引物3为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:实施例3步骤I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/U L) I U L, 10XPCR buffer5 u L, MgCl2 (25mmol/L) 3 y L，引物 6 (10 y mol/y L) I y L，引物
3(10 u mol/u L) I u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,总体积 50 u L。
[0104]上述50 ii L PCR反应体系进行如下PCR反应程序:
[0105]94°C 预热 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s, 72 °C lmin,30 个循环；最后 72°C 延伸IOmin0
[0106]回收PCR产物并与pUCm-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5 a，挑取菌落进行测序验证。其测序结果如SEQ ID NO: 15所示。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因(如SEQ ID NO:1所示)进行比对,结果显示:如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列相当于把顺式环氧琥珀酸水解酶基因的终止密码子TAA突变为AAA并在其3’端添加了含有终止密码子 TAA 的 CAGACGCCGAACAAGTAA(SEQ ID NO: 16)这一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:17所示，SEQ ID N0:17所示的氨基酸序列相当于在SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的C-端添加了 6个氨基酸序列(SEQ IDNO: 18)。用限制性内切酶Nde I和BamH I分别对含有如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的pUCm-T载体和pET-22b(+)表达载体进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切下来的如SEQID NO: 15所示的核苷酸序列与酶切后的pET-22b (+)载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)，构建含有如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的pET_22b (+)重组载体和含有此pET-22b (+)重组载体的基因工程菌。
[0107]此基因工程菌在含100 U g/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C振荡培养过夜。以只含pET-22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段的大肠杆菌BL21为对照。按照实施例1中顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定方法，对照菌没有顺式环氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力为35800U/g。
[0108]利用本实施例所述的基因工程菌，用实施例5的方法制备L(+)酒石酸，同样得到纯度为99.9%的L(+)酒石酸。
[0109]3.在本发明所述的顺式环氧琥珀酸水解酶基因的5’端和3’端同时随意添加一段核苷酸序列
[0110]以克雷伯氏菌BK-58的基因组为模板，引物5和引物6为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:实施例3步骤I所得的模板3 u L，Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCRbuffer5 u LjMgCl2 (25mmol/L) 3 u L，弓 I物 5 (10 u mol/ U L) I u L，弓 I物 6 (10 u mol/ u L) I u L,dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,总体积 50 u L。
[0111]上述50 ii L PCR反应体系进行如下PCR反应程序:
[0112]94°C 预热 5min ;然后 94°C 50s, 54°C 30s, 72 °C lmin,30 个循环；最后 72°C 延伸IOmin0
[0113]回收PCR产物并与pUCm-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5 a，挑取菌落进行测序验证。其测序结果如SEQ ID NO: 19所示。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因(如SEQ ID NO:1所示)进行比对,结果显示:如SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列相当于在如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’端添加了 ATGGACCGTCGTCAGTTC(SEQ ID NO: 11)这一段核苷酸序列，同时将顺式环氧琥珀酸水解酶基因的终止密码子TAA突变为AAA并在其3’端添加了含有终止密码子TAA的CAGACGCCGAACAAGTAA (SEQ ID NO: 16)这一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:20所示，SEQ IDNO: 19所示的氨基酸序列相当于在SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的N-端添加了 6个氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)同时在其C-端添加了 6个氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。用限制性内切酶Nde I和BamH I分别对含有如SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列的pUCm_T载体和pET-22b(+)表达载体进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切下来的如SEQ ID N0:19所示的核苷酸序列与酶切后的pET-22b (+)载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)，构建含有如SEQ ID勵:19所示的核苷酸序列的？￡1'-2213(+)重组载体和含有此pET_22b (+)重组载体的基因工程菌。
[0114]此基因工程菌在含100 u g/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C振荡培养过夜。以只含pET-22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段的大肠杆菌BL21为对照。按照实施例1中顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定方法，对照菌没有顺式环氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力为36200U/g。
[0115]利用本实施例所述的基因工程菌，用实施例5的方法制备L(+)酒石酸，同样得到纯度为99.9%的L(+)酒石酸。
[0116]4.在本发明所述的顺式环氧琥珀酸水解酶基因的内部取代一段核苷酸序列
[0117]根据SEQ ID NO:1所示的序列设计突变引物:引物7和引物8，引物7和引物8的序列分别为:
[0118]引物7: 5，-AGTGATCAAGGGGGAAAAACCGTGGACCACGACAG (SEQ ID NO: 21)；
[0119]引物8:5’ -CTGTCGTGGTCCACGGTTTTTCCCCCTTGATCACT (SEQ ID NO: 22)。
[0120]以实施例4中含有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的pET_22b(+)重组载体为模板，引物7和引物8为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:模板3iiL，SuperLA Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCR buffer5 y L,引物 7 (10 y mol/y L) 2 y L，引物 8(10 y mol/U L)2u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2036 u L,总体积 50 u L。
[0121 ] 上述50 ii L PCR反应体系进行如下PCR反应程序:
[0122]94°C 预热 5min ;然后 94°C 50s, 56°C 30s, 72°C 7min，25 个循环；最后 72°C 延伸IOmin0
[0123]PCR产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)构建基因工程菌，挑取菌落进行测序。将测序结果(SEQ ID NO:23)与顺式环氧琥珀酸水解酶基因(SEQ ID NO:1)进行比对，比对结果显示，SEQ ID NO: 23所示的序列是SEQ ID NO:1所示的序列第299、300位的核苷酸GG被核苷酸AA取代的结果。SEQ ID NO: 23所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示，SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列相当于SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第100位氨基酸精氨酸被赖氨酸取代的结果。
[0124]此基因工程菌在含100 U g/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C振荡培养过夜。以只含pET-22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段的大肠杆菌BL21为对照。按照实施例1中顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定方法，对照菌没有顺式环氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力为32400U/g。
[0125]利用本实施例所述的基因工程菌，用实施例5的方法制备L(+)酒石酸，同样得到纯度为99.9%的L(+)酒石酸。
[0126]5.在本发明所述的顺式环氧琥珀酸水解酶基因的5’端缺失一段核苷酸序列
[0127]根据SEQ ID NO:1所示的序列设计含有限制性内切酶Nde I识别位点的正向引物9，引物9的序列为:
[0128]引物9:5’-CATATG AACCAGATGGCCTTA(SEQ ID NO:25)；
[0129]以克雷伯氏菌BK-58的基因组为模板，引物9和实施例4中的引物4为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:实施例3步骤I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/U L) I U L, 10XPCR buffer5 u L, MgCl2 (25mmol/L) 3 u L,引物 5 (10 u mol/u L) I u L,引物
4(10 u mol/u L) I u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,总体积 50 u L。
[0130]上述50 ii L PCR反应`体系进行如下PCR反应程序:
[0131]94°C 预热 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s, 72 °C lmin,30 个循环；最后 72°C 延伸IOmin0
[0132]回收PCR产物并与pUCm-T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5 a，挑取菌落进行测序验证。其测序结果如SEQ ID N0:26所示。将测序结果与顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因(如SEQ ID NO:1所示)进行比对,结果显示:如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列相当于在如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’端缺失了
[0133]AACCAGATGGCCTTAAAGCCCTGTTCTTTGACGTCCAGGGAACACTTGTCGATTTTTATTCGACAATCACCCGAG AGGGCGAAGCCTTCTCAGCTGTTC这一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:27所示，SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列相当于在SEQID N0:2所示的氨基酸序列的N-端缺失了 33个氨基酸序列。用限制性内切酶Nde I和BamH I分别对含有如SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列的pUCm_T载体和pET_22b (+)表达载体进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切下来的如SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列与酶切后的pET-22b(+)载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建含有如SEQ IDNO: 26所示的核苷酸序列的pET-22b (+)重组载体和含有此pET_22b (+)重组载体的基因工程菌。
[0134]此基因工程菌在含100 U g/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C振荡培养过夜。以只含pET-22b(+)载体而无任何外源核苷酸插入片段的大肠杆菌BL21为对照。按照实施例I中顺式环氧琥珀酸水解酶活性的测定方法，对照菌没有顺式环氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力为33600U/g。
[0135]利用本实施例所述的基因工程菌，用实施例5的方法制备L(+)酒石酸，同样得到纯度为99.9%的L(+)酒石酸。
[0136]以上各实施例中，某些步骤并非必须，本领域技术人员可根据本发明的内容进行顺序更替、具体操作参数的改变或类似步骤的替换等。
[0137]尽管已参照本发明的确定优选实例表示和描述了本发明，但本领域内的普通技术人员将理解的是，可在不背离由 所附权利要求书限定的本发明宗旨和范围的前提下对本发明进行各种形式和细节上的修改。
[0138]
【权利要求】
1.一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于:所述编码基因具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于其与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有70%以上的同源性。
4.根据权利要求3所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于其与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有80%以上的同源性。
5.根据权利要求4所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于其与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性。
6.根据权利要求3所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:15 或 SEQID NO:19 所示。
7.一种多肽，其特征在于其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
8.一种由权利要求2所述的编码基因编码的多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
9.一种多肽，其特征在于其氨基酸序列是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过氨基酸的取代、缺失或添加而得，并且具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性。
10.根据权利要求9所述的多肽，其特征在于其具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的50个以上的氨基酸，其顺式环氧琥珀酸水解酶活力至少为完整氨基酸序列SEQ ID NO:2的80%以上。
11.根据权利要求10所述的多肽，其特征在于其具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的100个以上的氨基酸。
12.根据权利要求10所述的多肽，其特征在于其顺式环氧琥珀酸水解酶活力至少为完整氨基酸序列SEQ ID NO:2的95%以上。
13.根据权利要求9所述的多肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO:24, SEQ IDNO:27, SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO:20 所示。
14.一种多核苷酸，其特征在于其具有用于编码权利要求9所述多肽的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其特征在于其与SEQID NO:1所示的核苷酸序列具有70%以上的同源性。
16.—种重组表达载体或重组微生物菌株,其特征在于:用于表达权利要求7-13任一权利要求所述的多肽。
17.一种使用权利要求7-13任一权利要求所述的多肽制备L ( + )_酒石酸或其盐的方法，其特征在于:将该多肽与顺式环氧琥珀酸或其盐反应。
18.根据权利要求17所述的制备L( + )-酒石酸或其盐的方法，其特征在于:顺式环氧琥珀酸或其盐的摩尔浓度为0.1~2mol/L，pH值为4.5~11.0，反应温度为10~55°C。
19.根据权利要求18所述的制备L( + )-酒石酸或其盐的方法，其特征在于:顺式环氧琥珀酸或其盐的摩尔浓度为0.5~1.5mol/L, pH值为6.0~9.5，反应温度为20~45°C。
20.根据权利要求19所述的制备L( + )-酒石酸或其盐的方法，其特征在于:顺式环氧琥 珀酸或其盐的摩尔浓度为0.8~1.2mol/L, pH值为8.0~9.0，反应温度为32~40°C。
【文档编号】C12N1/15GK103614398SQ201310369774
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】张建国, 谢志鹏, 程永青, 潘海峰, 鲍文娜 申请人:杭州宝晶生物化工有限公司