一种复合微生态饲料添加剂的制备及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生态饲料添加剂领域，具体涉及一种复合微生态饲料添加剂的制备及应用。本发明的微生态饲料添加剂由筛选到的活性复合益生菌组成，能够预防和治疗家畜细菌性感染引起的腹泻。本发明所用的两株益生菌具有抑制动物常见胃肠道致病菌包括痢疾杆菌、致病性大肠埃希菌、肠炎沙门菌感染的能力，而且还能够降低痢疾杆菌感染Caco-2细胞引起的毒性、抑制痢疾杆菌对Caco-2细胞的粘附，最后达到刺激动物机体免疫力、提高动物胃肠道消化能力，促进动物生长的明显效果。菌种的生产工艺采用液体发酵培养技术和低温冷冻干燥技术，使所获得菌剂存活率和纯度都很高，是一种绿色环保型的饲料添加剂。
【专利说明】—种复合微生态饲料添加剂的制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生态饲料添加剂领域，该添加剂主要由筛选到的活性复合益生菌组成，能够预防和治疗家畜细菌性感染引起的腹泻。
【背景技术】
[0002]数十年以来，国际上以抗生素、防腐剂为主的饲料药物添加剂为畜牧、家禽、水产等养殖业生产带来了很大的效益。然而，随着这些化学药品的广泛应用，耐药菌株的产生、抗生素在畜禽鱼产品中的残留及二重感染等问题受到国际社会的普遍关注与担忧。许多国家已禁止或限制抗生素、防腐剂作为饲料添加剂的使用。因此，开发和推广ー些既能有效替代抗生素和防腐剤，又能有效防病、保健、促生长的新型安全饲料添加剂已成为当务之急。
[0003]微生态制剂又称微生态调节剂，是根据微生态学原理，利用对宿主有益的正常微生物或其促进物质制备成的制剂，具有維持或调整微生态平衡，防治疾病和增进宿主健康的作用。它能有效地克服抗生素和防腐剂所产生的各种副作用，且具有防病、增强动物机体免疫力和促生长的效果。许多中草药及其成分具有提高免疫力的作用，与微生态制剂结合的生物制剂，又叫合生元(snbyioties),由Gibosnll首先提出，是微生态制剂的一个发展方向，也是现今研究的热点。
【发明内容】
[0004]本发明从猪的健康粪便中筛选到了一株具有适应动物胃肠道微环境的丁酸梭菌，拉丁名:Clostridium butyricum.代号CPU-1 (简称CB),其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.7281。保藏日:2013年3月6日。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0005]本发明从猪的健康粪便中筛选到了一株具有适应动物胃肠道微环境的嗜酸乳杆菌，拉丁名:Lactobacillus acidophilus,代号CPU-2 (简称LA),其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.7282。保藏日:2013年3月6日。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0006]试验证明，本发明的CPU-1和CPU-2具有抑制细菌性感染引起的腹泻的功效，特别是痢疾杆菌(Shigella flexneri,简称 SF)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,简称SE)、致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic Escherichia coli,简称EPEC)等细菌性感染引起的腹泻。并且将CPU-1和CPU-2联合使用具有协同功效。将两者组成复合益生菌，具有降低由痢疾杆菌引起的Caco-2细胞的细胞毒性并抑制其粘附细胞的能力。CPU-1和CPU-2优选的重量比例:1:10~10:1，更优选1:1。
[0007]将两个菌株制备冻干菌粉有利于生产和制备。
[0008]丁酸梭菌CPU-1菌粉的制备:将丁酸梭菌CPU-1从甘油管接种到乳酸菌液体培养基(MRS)中，37°C恒温静置培养12h，得到活化的菌种。将种子液按5%的接种量接种到MRS培养基中37°C厌氧发酵即深层静置培养24h，最后将获得的发酵液于4°C 1000Orpm离心IOmin,收集菌体加入脱脂奶粉进行低温冷冻干燥。所述乳酸菌液体培养基优选含如下成分:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，MgS040.58g/L，MnS040.25g/L，半胱氨酸盐酸盐 0.5g/L 和吐温 801ml ；pH6.2-6.4，115。。灭菌30min。
[0009]嗜酸乳杆菌CPU-2菌粉的制备:将嗜酸乳杆菌CPU-2从甘油管接种到乳酸菌液体培养基(MRS)中，37°C恒温静置培养12h，得到活化的菌种。将种子液按5%的接种量接种到MRS发酵培养基中37°C厌氧发酵24h，将获得的发酵液于4°C 1000Orpm离心lOmin，收集菌体加入脱脂奶粉进行低温冷冻干燥。[0010]试验发现，上述复合益生菌与野生植物牛至草粉联合使用效果更佳，比较优选的配比是:复合益生菌:野生植物牛至草粉重量配比为1:10~~10:1，更优选7:3。
[0011]牛至草粉可用下列方法制备:将新鲜的牛至草叶置烘箱中，于60°C烘干48h，然后用小型中药粉碎机粉碎后过40目筛，得到牛至草粉。
[0012]在使用中还可以添加淀粉、果聚糖等辅料混合均匀后制成复合微生态饲料添加剂。
[0013]CPU-1和CPU-2的两个菌株的分离纯化方法详细描述于实施例中。
[0014]本发明提供了该微生态添加剂在断奶仔猪细菌性腹泻的应用试验，相对于传统的抗生素治疗方式具有以下优势:该添加剂为绿色生态饲料添加剂对家畜无任何毒副作用，无抗生素残留。对于常见的胃肠道致病菌具有与抗生素不相上下的抗菌活性，同时有利于其他胃肠道共生菌群的生长；该添加剂所用菌株能够在胃肠道内高效粘附，适应动物胃肠道微环境，所分泌产生的乳酸及酪酸等能够提高胃肠道内蛋白酶、淀粉酶的活性，提高饲料转化率，降低胃肠道内毒性物质的产生。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是丁酸梭菌CPU-1形态图:A平皿菌落图；B菌体显微照片(400 X )
[0016]图2是嗜酸乳杆菌CPU-2形态图:A平皿菌落图；B菌体显微照片(400 X )
[0017]图3是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2的不同配比对痢疾杆菌的抑制作用
[0018]图4是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对痢疾杆菌体外协同抑制作用
[0019]图5是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对致病性大肠埃希菌体外协同抑制作用
[0020]图6是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对肠炎沙门菌体外协同抑制作用
[0021]图7是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对由痢疾杆菌引起的Caco-2细胞毒性的影响
[0022]图8是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对痢疾杆菌的Caco-2细胞粘附性的影响
[0023]图9是断奶仔猪腹泻率测定
【具体实施方式】
[0024]实施例1
[0025]丁酸梭菌CPU-1的分离纯化及生理生化鉴定[0026]1、丁酸梭菌CPU-1分离纯化
[0027](I)取新鲜的猪的粪便Ig溶于9ml生理盐水中，放入80°C水浴lOmin，杀死非芽孢菌，然后放入增殖培养基，于37°C培养36h。
[0028](2)将上述培养液置80°C水浴lOmin，转入菌种梭菌选择性培养基，其成分为:胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉10g/L，亚硫酸钠lg/L，枸櫞酸铁0.5g/L，新生霉素0.02g/L，多粘菌素0.05g/L, pH7.2，121°C灭菌20min，37°C厌氧选择性富集培养48h。
[0029](3)将样品分别从KT1到10_7倍比稀释，涂布于GAM培养基平板上，其培养基组成成分为:月示胨15g/L，胰酪蛋白胨10g/L，大豆胨3g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉粉2g/L，消化血清粉13.5g/L，牛肝浸粉1.2g/L，葡萄糖3g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，氯化钠3g/L，可溶性淀粉0.3g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，硫こ醇酸钠0.15g/L，琼脂粉20g/L，pH7.2，115°C灭菌30min。放入7.5L装有厌氧产气袋厌氧盒中，37°C厌氧培养36~48h。
[0030](4)采用影印平板法分离菌种，分别进行好氧和厌氧培养，选取厌氧生长良好的菌株，镜检。
[0031]2、丁酸梭菌CPU-1的生理生化鉴定
[0032]菌体形态特征见图1:丁酸梭菌菌株是典型的厌氧菌，直或微弯的杆菌，产芽孢，孢子卵圆，偏心到次端生，无孢子外壁和附属丝，端圆，单个或成对，短链，偶见长丝状菌体，以周生鞭毛运动，革兰氏阳性菌。
[0033]以模式菌株枯草 芽孢杆菌为对照，考察丁酸梭菌CPU-1的生理生化特征，为其菌种鉴定提供依据。按《伯杰氏细菌鉴定手册》和《细菌属的鉴定指导》对分离到的纯菌株进行属的相关试验，以及群、种的相关生理生化实验，分别包括:明胶液化试验、蜜二糖、松三糖、淀粉水解试验。
[0034]表1 丁酸梭菌菌株CPU-1的生理生化特征
[0035]
测试项目il
淀粉水解+
明胶液化一
葡萄糖利用+
阿拉伯糖利用+
甘露醇利用+
蜜二糖+
松二糖+
果糖+
石蕊牛奶+
[0036]注:“ + ”表示阳性反应或能利用；“一”表示阴性反应或不能利用。
[0037]參照伯杰氏细菌鉴定手册第九版的分类鉴定，该菌株是丁酸梭菌，其培养特征和个体形态特征见图1。
[0038]实施例2
[0039]嗜酸乳杆菌CPU-2的分离纯化及生理生化鉴定
[0040]嗜酸乳杆菌CPU-2的分离纯化方法参见丁酸梭菌的分离纯化，选择培养基为加有3%CaC03的MRS培养基；嗜酸乳杆菌菌体形态特征见图2，嗜酸乳杆菌为兼性厌氧菌，革兰氏染色为阳性、两端钝圆、中等大小、无芽孢、不运动的杆菌，以单个、成双或短链状出现。
[0041]表2嗜酸乳杆菌的生理生化特征
[0042]
【权利要求】
1.ー种丁酸梭菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心的保藏号为:CGMCC N0.7281。
2.一种嗜酸乳杆菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心的保藏号为:CGMCC N0.7282。
3.一种复合微生态制剂饲料添加剂，其活性成分由权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌组成。
4.权利要求3的复合微生态制剂饲料添加剂，其中权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌的重量比为1:10~~10:1。
5.权利要求4的复合微生态制剂饲料添加剂，其中权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌的重量比为1:4~~4:1。
6.权利要求5的复合微生态制剂饲料添加剂，其中权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌的重量比为1:1。
7.权利要求3的复合微生态饲料添加剤，还含有牛至草粉。
8.权利要求3或7的复合微生态饲料添加剂用于制备治疗家畜细菌性感染引起的腹泻的药物的用途。
9.权利要求8的 用途，其中细菌性感染是痢疾杆菌、致病性大肠埃希菌或肠炎沙门菌引起的感染。
【文档编号】C12R1/23GK103602614SQ201310557533
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】周长林, 贾源宾, 方凯, 葛洪, 王艺宙 申请人:南京曜动节能环保科技有限公司