基于高通量基因测序无创检测线粒体dna的方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下：（1）提取口腔细胞总基因组DNA；（2）设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA：（3）高通量测序检测。本发明的方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，可以不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测。
【专利说明】基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种无创检测线粒体DNA序列的方法。
【背景技术】
[0002]人类的线粒体DNA全基因组(mitochondrial DNA, mtDNA)为全长16569bp的闭合双链环状分子，线粒体DNA基因组的NCBI登陆号为NC_012920，全基因组编码区共37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16SrRNA)，13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密，序列间没有发现内含子。mtDNA有独特的母系遗传特性，一般认为mtDNA随母本的卵细胞传递给后代；mtDNA在细胞中的拷贝数很高，一个细胞中往往含有高达数千个mtDNA拷贝，mtDNA具有较高的突变率，大量研究显示mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上，突变的mtDNA与野生型的mtDNA可以同时存在一个细胞内发挥不同的生物学功能能，多数mtDNA突变都为有害突变，mtDNA突变导致的临床表型极为广泛，几乎涉及到所有的组织和器官，mtDNA突变带来的危害存在剂量效应，轻微的突变并不出现典型的临床症状，给临床诊断带来了极大的困难，很多线粒体疾病无法得到确诊，故线粒体基因组的准确检测具有重要的临床指导意义。
[0003]传统的线粒体基因检测方法主要包括:PCR-RFLP、AS_PCR和DNA —代测序、芯片方法等，这些方法在基因突变检测中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，临床上常针对mtDNA的检测，还仅集中在对少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体相关性糖尿病常见突变A3243 G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断；另外线粒体病具有量效现象，即小量的线粒体DNA突变可能不出现临床症状，随着突变线粒体比例增高，出现临床表现，且临床严重程度可能和突变比例成正相关，目前常用的检测方法对于低剂量的线粒体突变都不能很好的检测，如果用传统的方法检测会出现很多漏检的现象；另外传统的检测方法检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等，不适用于大批量、系统检测，结果假阳性高，结果不能自动化分析，给线粒体疾病的临床诊断带来困难。
【发明内容】
[0004]本发明目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种准确、快速、检测流程简单的检测线粒体DNA序列的方法。
[0005]为此，本发明公开了一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下:
[0006](I)提取口腔细胞总基因组DNA ;
[0007](2)设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA:设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增；扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列；第一对PCR引物序列为:
[0008]F70655’-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3’ ，
[0009]R164555’-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3’ ，[0010]扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps ；
[0011]第二对PCR引物序列为:
[0012]F163945’-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3’ ，
[0013]R71I15，-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3，
[0014]扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps。
[0015](3)使用1n Torrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。
[0016]根据本发明的方法，所述步骤(2)中，用上述引物配合如下反应体系:PCR为50iU总体系，具体是 5XPhusion HF BufferlOu 1,2.5mM dNTPmix5 y 1，IOmM 的上下游引物各2u l,2U/u I的Phusion DNA聚合酶0.8 iil，1-1Ong的总基因组DNA模板I iil，用灭菌水补足50iU体系，反应条件为“降落PCR”:95°C 5min预变性，循环内98°C IOs变性，从68°C每个循环降1°C退火，72°C延伸5min，10个循环；在62°C退火，进行25个循环；PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。
[0017]根据本发明的方法，所述步骤(3)的具体操作步骤如下:
[0018]3.1割胶回 收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测:纯化产物，回收片段，分别取出Iul线粒体扩增片段PCR后产物，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测；根据样品检测出的浓度，决定用于下步实验的DNA起始总量；根据PCRl和PCR2的长度，确定取PCRl的量，保证PCR产物的分子个数接近同比例，然后混匀，补水，建库；
[0019]3.2DNA超声波打断:将线粒体基因组打断15个cycles，打断结果为150_400bp范围内；
[0020]3.3末端修复和纯化DNA:按起始量加入无核酸酶水到打断后DNA中，在1.5mlLoBindTube中混匀，室温下孵育20min ；
[0021]3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA:用the Agencourt? AMPure? XP Kit纯化末端修复产物；
[0022]3.5片段选择:取IOul连接纯化后的线粒体DNA样品，进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，120v，90min ;电泳结果:线粒体连接后非扩增文库大小在200_600bp范围内有连续条带，根据接头、barcode和目的片段文库大小，进行切胶300_350bp处条带利用ThermoScientific GeneJET Gel Extraction Kit 进行回收；
[0023]3.6扩增及纯化DNA ；
[0024]3.7文库质控:检测文库片段大小、文库浓度，并确定文库稀释因子；
[0025]3.8上机测序及测序结果分析:将制备好的文库在Life technologies公司的1nPGM sequencer高通量测序仪上进行测序,读长250BP，要求测序深度达到3000 X，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对，即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。。
[0026]本发明提供的基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，涉及分子生物学和生物信息学，本方法只设计两对灵敏的引物，配合优化的PCR反应条件无需单独分离细胞线粒体DNA，只需要细胞总DNA为模板就可以实现体外线粒体DNA的富积扩增，可以做到无创标本(口腔黏膜细胞样品)的检测。技术中的扩增引物配合优化的PCR反应体系和条件，完全可以应用于线粒体DNA全基因组的检测。该方法实验设计严谨、实验流程简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，可以不同程度满足科研及临床检测的需求，适用于科研和临床针对线粒体相关的突变快速检测，有助于临床疾病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。
[0027]此外，本方法配合使用Life technologies公司的1n Torrent个人化操作基因组测序仪(PGM?)，它是市场上相较其他测序技术，更简单，经济和具有强大的可扩展性的测序平台。PGM?台式系统的设计配合革新性的半导体芯片技术，使整个平台具有极高的扩展性和快速完成测序的性能。1n Torrent技术通过专有的大规模并行半导体感应器，对于DNA复制时产生的离子流,实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入1nTorrent半导体芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系，微体系机械设计和半导体的技术组合，使我们得以快速直接的将遗传信息翻译成数码的DNA测序结果，得到大量高质量的测序数据，测序的深度保证结果的准确性，可以测出比例非常低的突变位点，为筛查线粒体DNA突变相关性疾病提供一种非常先进的方法，可以很好地解决传统基因检测中出现的假阳性高、漏检、规模化、自动化问题。
【专利附图】
【附图说明】 [0028]图1是线粒体DNA扩增模式图。
[0029]图2是线粒体体外富积扩增琼脂糖电泳图。
[0030]图3是线粒体DNA文库制备检测琼脂糖电泳图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述。但本发明并不限于以下实施例。
[0032]本发明的实验流程具体步骤如下。
[0033]1.提取口腔细胞总基因组DNA
[0034]严格按照Genomic DNA Purification Kit (Fermentas 公司 K0512)试剂盒操作说明书提取口腔细胞总基因组DNA。
[0035]2.设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA
[0036]设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增。扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列。
[0037]第一对PCR引物序列为:
[0038]F70655’-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3’ ，
[0039]R164555’-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3’ ，
[0040]扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps ；
[0041]第二对PCR引物序列为:
[0042]F163945’-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3’ ，
[0043]R7III5，-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3，
[0044]扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps。
[0045]弓丨物扩增线粒体DNA扩增模式图参考图1。
[0046]用上述引物配合如下反应体系:PCR为50 ill总体系，具体是5XPhusion HFBufferlOu 1,2.5mM dNTPmix5 u 1，上下游引物(IOmM)各 1，Phusion DNA 聚合酶(2U/yl) 0.8 iil，总基因组DNA模板Iiil (1-10叩)，用灭菌水补足50111体系。反应条件为(降落PCR):95°C 5min预变性，循环内98°C IOs变性，从68°C每个循环降1°C退火，72°C延伸5min，10个循环；在621:退火，进行25个循环；PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。
[0047]PCR反应完取3iU PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析，线粒体体外富积扩增琼脂糖电泳图如图2所示，图中，1:第一段扩增大小9391bps;2:第一段扩增大小7287bps;M;Marker
[0048]3高通量测序检测
[0049]3.1割胶回收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测
[0050]3.1.1 按照 GeneJET? Gel Extraction Kit 凝胶纯化试剂盒说明书(Fermentas 公司K0691)进行纯化产物，回收片段。
[0051]3.1.2回收效果检测
[0052]方法:分别取出Iul线粒体扩增片段PCR后产物，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测。检测结果=PCR-1为630ng/ul，PCR-2为570ng/ul ;根据样品检测出的浓度，决定用于下步实验的DNA起始总量为:lug ;根据PCRl和PCR2的长度，确定取PCRl的量为530ng, PCR2的量为470ng，保证PCR产物的分子个数接近同比例，然后混匀，补水至80ul为打断体系，按Iug总起始量进行建库。
[0053]3.2DNA轺声波打断
[0054]I)水浴槽需预先降温30min。加入一定量的冰水混合物到水浴槽中。
[0055]2)准备样品，选用0.5ml的打断管，取出约Iug的线粒体DNA，用NF水稀释到80ul体系。
[0056]3)打断之前检查各设备之间的线路是否已正确连接，确保正确连接后，插上电源插头。
[0057]4)将功率调到最大“H”。
[0058]5)时间间隔控制旋钮上绿色为“0FF”，即停顿时间，调至0.5min,红色为“0N”，即超声波时间，调至0.5min。
[0059]6)加冰水混合物到最高水位线处。
[0060]7)将准备好的样品装到转头上。
[0061]8)盖上仪器外部的隔音罩。
[0062]9)开始打断,每打断3-4个cycles,需吸走一部分的水,然后用碎冰补齐到最高水位线处。
[0063]10)将线粒体基因组打断15个cycles，打断结果为150_400bp范围内。
[0064]3.3末端修复和钝化DNA
[0065]3.3.1按起始量加入以下体积的Nuclease-free Water到打断后DNA中。
[0066]3.3.2 在 1.5ml LoBind Tube 中混匀。
【权利要求】
1.一种基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，该方法步骤如下: (1)提取口腔细胞总基因组DNA； (2)设计PCR引物及体外富积扩增线粒体DNA:设计两对PCR扩增引物，对抽提出来的总基因组DNA进行完整的线粒体DNA体外富积扩增；扩增产物的长度分别为9391bps和7287bps，此时扩增产物能够覆盖整条完整的mtDNA序列； 第一对PCR引物序列为:
F70655’-GCCATCATAGGAGGCTTCATTCAC-3’ ，
R164555’-CGGAGCGAGGAGAGTAGCACTCTT-3’ ， 扩增线粒体DNA的位点7065/16455区域，扩增产物长度为9391bps ； 第二对PCR引物序列为:
F163945’-CCTTGACCACCATCCTCCGTGAA-3’ ，
R7III5，-TAGCCTGAGAATAGGGGAAATCAGT-3， 扩增线粒体DNA的位点16394/7111，扩增产物长度为7287bps ； (3)使用1nTorrent个人化操作基因组测序仪进行高通量测序检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，用上述引物配合如下反应体系:PCR 为 50ii I 总体系，具体是 5XPhusion HF BufferlOu 1,2.5mM dNTPmix5 u I,IOmM的上下游引物各2iil，2U/iil的Phusion DNA聚合酶0.8 yl，1-1Ong的总基因组DNA模板Iu 1，用灭菌水补足50 ill体系，反应条件为“降落PCR”:95°C 5min预变性，循环内980C IOs变性，从68°C每个循环降1°C退火，72°C延伸5min，10个循环；在621:退火，进行25个循环；PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)的具体操作步骤如下: 3.1割胶回收纯化线粒体DNA片段及回收效果检测:纯化产物，回收片段，分别取出Iul线粒体扩增片段PCR后产物，利用QB2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检测；根据样品检测出的浓度，决定用于下步实验的DNA起始总量；根据PCRl和PCR2的长度，确定取PCRl的量，保证PCR产物的分子个数接近同比例，然后混匀，补水，建库； 3.2DNA超声波打断:将线粒体基因组打断15个cycles，打断结果为150_400bp范围内； 3.3末端修复和纯化DNA:按起始量加入无核酸酶水到打断后DNA中，在1.5ml LoBindTube中混匀，室温下孵育20min ； 3.4连接接头、缺口补平和纯化连接的DNA:用the Agencourt? AMPure? XP Kit纯化末端修复产物； 3.5片段选择:取IOul连接纯化后的线粒体DNA样品，进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，120v, 90min ;电泳结果:线粒体连接后非扩增文库大小在200_600bp范围内有连续条带，根据接头、barcode和目的片段文库大小，进行切胶300_350bp处条带利用ThermoScientific GeneJET Gel Extraction Kit 进行回收； 3.6扩增及纯化DNA ； 3.7文库质控:检测文库片段大小、文库浓度，并确定文库稀释因子； 3.8上机测序及测序结果分析:将制备好的文库在Life technologies公司的1n PGMsequencer高通量测序仪上进行测序,读长250BP，要求测序深度达到3000 X，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到线粒体全基因组序列资料，与线粒体参考序列比对， 即可获得样本线粒体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。
【文档编号】C12Q1/68GK103614482SQ201310662758
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】张茂雷, 陈杰, 郭玲玲, 何东海 申请人:广州赛哲生物科技有限公司