一种尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法
【专利摘要】一种尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法，包括菌株个体大小、菌盖形态及颜色、菌柄形态及颜色、孢子颜色及数量四级逐级淘汰筛选和菌核生成能力筛选。未淘汰的菌株接入PDA培养基中，进行菌丝生长速度、菌核生成时间及菌核生成数量筛选即可得到尖顶羊肚菌优质菌株。用本发明方法得到的优质菌株种植后生长速度快，出菇后7～10天即可收获，产生的尖顶羊肚菌菌株个体大，外观完美，鲜品产量可达到80kg以上/亩，且产量稳定，本发明筛选的优质菌种连续三年产量相差最大不到5%，解决了目前羊肚菌产业化发展中产量不稳定的技术问题。
【专利说明】一种尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法。
【背景技术】
[0002]尖顶羊肚菌CK conica)为羊肚菌属spp.)的一种，子囊果中等，头部圆锥形，顶端尖而得名。尖顶羊肚菌在我国分布广泛，主要分布于云南、甘肃、四川等地。由于尖顶羊肚菌体态完美、个儿大，因此，作为羊肚菌商品出口的主要品种之一。目前，对尖顶羊肚菌方面的研究很多，主要集中在栽培【技术领域】和生物学特性方面，本 申请人:为尖顶羊肚菌研究较早的部门之一，根据研究我们发现，尖顶羊肚菌栽培过程中存在产量不稳定的问题，我们对2006-2008年种植的MOOl羊肚菌进行了产量评估，2006年羊肚菌亩产量为62.57kg, 2007年羊肚菌亩产 量为54.32kg, 2008年羊肚菌亩产量为49.51kg, 2007年和2008年亩产量分别比2006年亩产量下降了 13.19%和20.87%，我们做了相关实验研究，发现菌种的优劣与后续羊肚菌的稳产有着至关重要的关系，因此，本发明人根据多年的研究经验，总结出一种尖顶 羊肚菌优质菌株的筛选方法，为后续尖顶羊肚菌稳定高产提供了重要技术支撑。
【发明内容】
[0003]本发明目的是提供一种尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法。该方法采用逐级淘汰方法，先通过第一步对菌株的个体大小、外部形态及颜色、产孢能力的初步筛选，第二步，对初步筛选得到的菌株进行菌核生成能力测试，即能得到尖顶羊肚菌优质菌株。所述的第一步对菌株的个体大小、外部形态及颜色、产孢能力的初步筛选是经过四级逐级淘汰的方法进行筛选。该四级逐级淘汰方法是:菌株个体大小筛选、菌盖形态及颜色筛选、菌柄形态及颜色筛选、孢子颜色及数量筛选。
[0004]本发明所提供的一种尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法，其步骤如下:
(I)菌株的个体大小、外部形态及颜色、产孢能力的逐级淘汰筛选
①菌株个体大小筛选
将采集到的无病虫害的尖顶羊肚菌菌株按个体大小分为三级:10 Cm <菌株个体长度(15cm的为一级，5 cm≤菌株个体长度< IOcm的为二级，菌株个体长度< 5cm的为三级，淘汰第三级；
②菌盖形态及颜色筛选
将步骤(1)①未淘汰的菌株进行菌盖形态及颜色的比较，菌盖上的棱和凹坑完全展开、菌盖长度>4 cm,2 cm <菌盖最宽处的宽度< 5cm、菌盖颜色为黑色或黄褐色的为一级，其余为二级，淘汰第二级；
③菌柄颜色及形态筛选
将步骤(1)②未淘汰的菌株先进行菌柄颜色的比较，菌柄颜色为乳白色的为初选一级；菌柄颜色为白色或黄褐色的为初选二级，淘汰初选二级；再将菌柄颜色为乳白色的初选一级菌株进行菌柄形态的比较，其中无病害、菌柄最窄处的宽度> 1.5cm的为一级，其余为二级，淘汰第二级；
④孢子颜色及数量筛选
A.孢子的收集，将洁净的A4纸折成信封状，取下步骤(1)③未淘汰的尖顶羊肚菌的菌盖并去掉菌盖上的泥土，然后将菌盖的尖顶朝下放入信封中，封好，放在阳光下晒2~3天，得到尖顶羊肚菌孢子印，刮取孢子印得到孢子，孢子颜色为黄色的为一级孢子，孢子颜色为白色的为二级，淘汰第二级；
B.将一级孢子放入IOml无菌水的试管中，摇匀，配成孢子母悬液，取Iml孢子母悬液加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第一次稀释孢子悬液，取第一次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第二次稀释孢子悬液，取第二次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第三次稀释孢子悬液，取第三次稀释孢子悬液Iml放在载玻片上，在显微镜下进行孢子计数，孢子个数> IO2个的为一级，孢子个数< IO2个的为二级，淘汰第二级；
(2)菌核生成能力筛选 无菌条件下，挑取步骤(1)④B未淘汰的尖顶羊肚菌的菌株孢子放入IOml无菌水中，摇匀得到孢子母悬液，取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入PDA培养基中，250C暗培养，此时得到单孢子菌丝，长满平皿后，取1.0cmX 1.0cm菌块接入PDA培养基中，25°C条件下培养，观察记录菌丝生长速度，菌核生成时间及菌核生成数量，菌丝生长速度> 6.4mm/d、菌核数量> 40个、菌核生成时间≤7d且菌丝长满半径r=45mm的平皿的菌株为一级，其余为二级，淘汰第二级，得到的一级菌株即为尖顶羊肚圃优质圃株。
[0005]本发明的有益效果:
本发明以尖顶羊肚菌亲本的个体大小、外部形态及颜色、产孢能力为优质菌株筛选的首要条件，为第一步筛选。亲本的外部形态和产孢能力直接影响子代的外部形态和产孢能力，子代的个体大则产量高，子代的外部形态和颜色好则售卖价高，产孢能力是影响产量的重要因素，生产中尖顶羊肚菌是分批产生的，第一批尖顶羊肚菌主要是靠菌丝产生的菌核萌发而成，若第一批尖顶羊肚菌产孢能力强，弹射大量孢子进入泥土里，孢子再次萌发，长出第二批尖顶羊肚菌，周而复始，最终尖顶羊肚菌的产量会很高。本发明以菌核生成能力筛选为第二步筛选，亲本菌核生成能力的大小决定了子代尖顶羊肚菌的产量，亲本菌核生成能力越强，产生的子代尖顶羊肚菌的数量越多，产量越高；反之则数量少，产量越低。
[0006]本发明通过第(I)步的四级逐级淘汰筛选及第(2)步的菌核生成能力筛选，即能获得尖顶羊肚菌优质菌株，该尖顶羊肚菌优质菌株的菌丝生长速度快，菌核生成时间短，菌核生成数量很大。其菌株菌丝生长速度> 6.4mm/d，菌核生成在短短的5天~7天，即可长出菌核数量> 40个的菌核，该尖顶羊肚菌优质菌株种植后，生长速度快，出菇后7~10天即可收获，其尖顶羊肚菌菌株产量可达到80kg以上/亩，比未通过本发明优质菌种筛选的羊肚菌菌株产量高，且产量稳定，本发明筛选的优质菌种连续三年产量相差最大不到5%、出菇时间稳定、个体生长速度相接近，解决了目前羊肚菌产业化发展中产量不稳定的技术问题。【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1是尖顶羊肚菌菌株个体各部位尺寸测量示意图。图中各标记依次表示:1 一尖顶羊肚菌菌盖，2—尖顶羊肚菌菌柄，L表示菌株个体长度，LC表示菌盖长度，WC表示菌盖最宽处的宽度，WS表示菌柄最窄处的宽度。
【具体实施方式】
[0008]随机采集尖顶羊肚菌菌株20株，对其进行编号为M001、M002、M003…M020。
[0009]参见图1，菌株个体长度:从菌株菌盖的顶端外缘至菌株菌柄的底端外缘的长度L为菌株个体长度。
[0010]菌盖长度:从菌株菌盖的顶端外缘至菌株菌盖的底端外缘的长度LC为菌盖长度。
[0011]第(1)步，亲本的个体大小、外部形态及颜色、产孢能力的四级逐级淘汰筛选 ①菌株个体大小筛选
将采集到的无病虫害的尖顶羊肚菌菌株按个体大小分为三级:10 Cm ≤菌株个体长度L ≤ 15cm的为一级,5 cm ≤菌株个体长度L < IOcm的为二级,菌株个体长度L < 5cm的为三级，淘汰第三级；
结果:
一级尖顶羊肚菌菌株共有8株，分别是:
MOO1、M002、M005、M007、M008、M009、MO 10、MO 12。
[0012]二级尖顶羊肚菌菌株有8株，分别是:
M004、M006、M013、M015、M016、M017、M018、M020。
[0013]三级尖顶羊肚菌菌株有4株，分别是:
M003、M011、M014、M019，淘汰第三级。
[0014]②菌盖形态及颜色筛选
将步骤(1)未淘汰的菌株进行菌盖形态及颜色的比较，菌盖上的棱和凹坑完全展开、菌盖长度LC ≥4 cm,2 Cm≤菌盖最宽处的宽度WC≤5cm、菌盖颜色为黑色或黄褐色的为一级，其余为二级，淘汰第二级；
结果:
一级尖顶羊肚菌菌株有10株，分别是:
M001、M002、M004、M006、M008、M010、M012、M013、MO 16, M020。二级尖顶羊肚菌菌株有6株，分别是:
M005、M007、M009、M015、M017、M018。 [0015]③菌柄颜色及形态筛选
亲本菌柄颜色及外部形态是子实体成熟的重要指标，菌柄由白色变成乳白色说明子实体已成熟并将进入孢子弹射期。
[0016]将步骤(1)②未淘汰的菌株先进行菌柄颜色的比较，菌柄颜色为乳白色的为初选一级；菌柄颜色为白色或黄褐色的为初选二级，淘汰初选二级；再将菌柄颜色为乳白色的初选一级菌株进行菌柄形态的比较，其中无病害、菌柄最窄处的宽度> 1.5cm的为一级，其余为二级，淘汰第二级；结果:
初选一级尖顶羊肚菌菌株8株，分别是:
M001、M004、M006、M008、M010、M012、M013、M020。
[0017]初选二级尖顶羊肚菌菌株2株，分别是:
M002和M016。淘汰第初选二级。
[0018]一级尖顶羊肚菌菌株5株，分别是:M001、M004、M006、M012、M020。
[0019]二级尖顶羊肚菌菌株3株，分别是:M008、M010、M013。
[0020]④孢子颜色及数量筛选
亲本产孢能力的大小决定其子代的数量和产孢能力。
[0021]A.孢子的收集，将洁净的A4纸折成信封状，取下步骤(1)③未淘汰的尖顶羊肚菌的菌盖并去掉菌盖上的泥土，然后将菌盖的尖顶朝下放入信封中，封好，放在阳光下晒2~3天，得到尖顶羊肚菌 孢子印，刮取孢子印得到孢子，孢子颜色为黄色的为一级孢子，孢子颜色为白色的为二级，淘汰第二级；(孢子为粉状)
B.将一级孢子放入IOml无菌水的试管中，摇匀，配成孢子母悬液，取Iml孢子母悬液加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第一次稀释孢子悬液，取第一次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第二次稀释孢子悬液，取第二次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第三次稀释孢子悬液，取第三次稀释孢子悬液Iml放在载玻片上，在显微镜下进行孢子计数，孢子浓度≥102个/ml的为一级，孢子浓度< IO2个/ml的为二级，淘汰第二级；
将MOO1、M004、M006、MO 12、M020产生的孢子按步骤(1)④B方法进行稀释，稀释后孢子个数> IO2个的为一级，孢子个数〈102个的为二级，淘汰第二级；
结果:
一级菌株有 3 株:M001、M004、M012。
[0022]二级菌株有2株:M006和M020，淘汰第二级。
[0023]第(2)步，菌核生成能力筛选
亲本的菌核生成能力决定子代尖顶羊肚菌的产量。
[0024]无菌条件下，分别挑取少量经步骤(1)④B未淘汰的尖顶羊肚菌的M001、M004、M012菌株孢子分别放入IOml无菌水中，摇匀，分别得到三种孢子母悬液，每种孢子母悬液按如下操作:取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀，得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入新配的PDA培养基中，25°C暗培养，此时得到单孢子菌丝，长满平皿后，取
1.0cmX 1.0cm菌块接入新配的PDA培养基中，25°C条件下培养，观察记录三种MOO1、M004、M012菌株的菌丝生长速度，菌核生成时间及菌核生成数量，菌丝生长速度≥ 6.4mm/d、菌核数量≥40个、菌核生成时间≤7d且菌丝长满半径r=45mm的平皿的菌株为一级，其余为二级，淘汰第二级，得到的一级菌株即为尖顶羊肚菌优质菌株。
[0025]结果:
一级菌株有I株:MO 12。
[0026]二级菌株有2株:M001、M004 (淘汰第二级)。
[0027]得到的一级菌株M012即为尖顶羊肚菌优质菌株。优质菌株M012无病虫害、其体貌特征为个体长度L为14.3cm,菌盖长度LC为6.1cm,菌盖最宽处的宽度WC为4.0cm,菌盖饱满、菌盖为黑色，菌柄乳白色、菌柄最窄处的宽度WS为2.8 Cm，经过上述方法稀释后孢子浓度为1.4X IO2个/ml，即收集得到的孢子个数为1.4X IO9个。
[0028]种植应用试验:
(1)2010年4月，将采用本发明方法得到尖顶羊肚菌优质菌株M012与MOOl和M004同时保藏于云南省农业科学学院高山经济植物研究所，同年8月在丽江市玉龙县石头乡永红村委会，采用传统农田栽培模式种植M012、M001、M004进行对比，2011年2月26日尖顶羊肚菌M012开始出菇，7天时个体大小达到8~12cm，此时可采收第一茬菇，但为确保后续几茬菇的产量，因此推辞5天采收第一茬菇，待第一茬菇孢子弹射后进行采收，M012鲜品亩产可达到83.52kg ;而MOOl和M004是在2011年3月2日和3月5日开始出菇，比M012的出燕时间分别延迟了 5天和7天,7天时个体大小分别为5~IOcm和4~8cm,个体生长速度比M012慢，MOOl和M004的鲜品亩产分别为55.65kg和61.33kg，分别比优质菌株M012减产 33.37%、26.57% ；
(2)2010年、2011年和2012年8月采用传统农田栽培模式对M012进行种植，应用结果:
2011年2月26日尖顶羊肚菌M012开始出菇，7天时第一茬菇个体大小达到8~12cm，M012鲜品亩产可达到83.52kg。
[0029]2012年2月29日尖顶羊肚菌M012开始出菇，7天时第一茬菇个体大小达到6~13cm, M012鲜品亩产可达到79.95kg。
[0030]2013年2月28日尖顶羊肚菌M012开始出菇，7天时第一茬菇个体大小达到5~10cm, M012鲜品亩产可达到81.74kg。
[0031]以上试验结果表明:用本发明提供的尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法得到的尖顶羊肚菌菌株M012相对未通过本发明优质菌种筛选的MOOl和M004产量高、生长(出菇)快，且连续三年的鲜菇产量稳定，连续三年鲜菇产量相差最大不到5%，出菇时间稳定，个体生长速度相接近，解决了目前羊肚菌产业化发展中产量不稳定的技术问题。
[0032]本发明方法为尖顶羊肚菌实际生产提供了有力的技术支撑，是值得应用推广的一种技术。
[0033]所述的传统农田栽培模式是指在农田中，利用圆叶杨为菌材种植羊肚菌的方法。主要栽培措施如下:(I)农田犁耕及圆叶杨菌材准备；栽培前7~10 d，选取直径15~20cm新鲜圆叶杨去枝叶，锯成Im长树段及1.5 m长树段若干，阴凉处放置，种植前I~2 d将每段菌材纵劈4-6份备用。(2)利用石灰、麦麸、木屑、白糖为原材料对栽培种进行发菌；(3)挖沟-放入菌材-撒上菌种及少量石灰和木屑-盖土,根据不同的菌材累加方法栽培堆呈现不同的形状，如第一层3根菌材，第二层2根菌材，第三层I根菌材，堆成一个锥状，这样可以提高土地利用率。(4)人工管理，覆盖透光率为25%的遮阳网，安装喷灌设施，控制土壤含水量为55-65%。
[0034]所述的PDA培养基(即马铃薯培养基)配方是:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、1000ml 水。
【权利要求】
1.一种尖顶羊肚菌优质菌株的筛选方法，其步骤如下: (1)菌株的个体大小、外部形态及颜色、产孢能力的逐级淘汰筛选 ①菌株个体大小筛选 将采集到的无病虫害的尖顶羊肚菌菌株按个体大小分为三级:10 Cm <菌株个体长度(15cm的为一级，5 cm≥菌株个体长度< IOcm的为二级，菌株个体长度< 5cm的为三级，淘汰第三级； ②菌盖形态及颜色筛选 将步骤(1)①未淘汰的菌株进行菌盖形态及颜色的比较，菌盖上的棱和凹坑完全展开、菌盖长度>4 cm,2 cm <菌盖最宽处的宽度< 5cm、菌盖颜色为黑色或黄褐色的为一级，其余为二级，淘汰第二级； ③菌柄颜色及形态筛选 将步骤(1)②未淘汰的菌株先进行菌柄颜色的比较，菌柄颜色为乳白色的为初选一级；菌柄颜色为白色或黄褐色的为初选二级，淘汰初选二级；再将菌柄颜色为乳白色的初选一级菌株进行菌柄形态的比较，其中无病害、菌柄最窄处的宽度> 1.5cm的为一级，其余为二级，淘汰第二级； ④孢子颜色及数量筛选 A.孢子的收集，将洁净的A4纸折成信封状，取下步骤(1)③未淘汰的尖顶羊肚菌的菌盖并去掉菌盖上的泥土，然后将菌盖的尖顶朝下放入信封中，封好，放在阳光下晒2~3天，得到尖顶羊肚菌孢子印，刮取孢子印得到孢子，孢子颜色为黄色的为一级孢子，孢子颜色为白色的为二级，淘汰第二级； B.将一级孢子放入IOml无菌水的试管中，摇匀，配成孢子母悬液，取Iml孢子母悬液加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第一次稀释孢子悬液，取第一次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第二次稀释孢子悬液，取第二次稀释孢子悬液Iml加入100mL的无菌水试管中，摇匀得第三次稀释孢子悬液，取第三次稀释孢子悬液Iml放在载玻片上，在显微镜下进行孢子计数，孢子个数> IO2个的为一级，孢子个数< IO2个的为二级，淘汰第二级； (2)菌核生成能力筛选 无菌条件下，挑取步骤(1)④B未淘汰的尖顶羊肚菌的菌株孢子放入IOml无菌水中，摇匀得到孢子母悬液，取孢子母悬液Iml放入100mL无菌水中，摇匀得到孢子悬液，此时取Iml的孢子悬液放入PDA培养基中，用灭菌的涂布棒进行涂布，25°C暗培养，待长出菌落时，挑取一个单菌落再接入PDA培养基中，25°C暗培养，此时得到单孢子菌丝，长满平皿后，取1.0cmX 1.0cm菌块接入PDA培养基中，25°C条件下培养，观察记录菌丝生长速度，菌核生成时间及菌核生成数量，菌丝生长速度>6.4mm/d、菌核数量>40个、菌核生成时间<7d且菌丝长满半径r=45mm的平皿的菌株为一级，其余为二级，淘汰第二级，得到的一级菌株即为尖顶羊肚圃优质圃株。
【文档编号】C12R1/645GK103923842SQ201410157376
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月20日 优先权日:2014年4月20日
【发明者】戚淑威, 徐中志, 赵琪, 陈翠, 侯志江, 程远辉, 和琼姬, 杨少华 申请人:云南省农业科学院高山经济植物研究所