一种具有产mk-7能力的纳豆芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌及其应用，该具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌：该纳豆芽孢杆菌种命名为纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053，已于2014年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2014028。本发明的纳豆芽孢杆菌BLCC10053具有产MK-7的能力，MK-7是常用的维生素K2的活性成分之一，易于人体吸收，可以增强骨骼健康，预防骨质疏松，抑制血管钙化，维持动脉弹性，预防动脉硬化，保护心血管健康。本发明的纳豆芽孢杆菌能够生产MK-7，产量高达3.68733mg/g，补充人体代谢所需要的VK2，从而达到预防与治疗多种疾病的效果。
【专利说明】-种具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及一种具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌 及其应用。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松（osteoporosis,OP)是W骨量减少和骨组织微结构退化（松质骨骨小梁 变细、断裂数量减少，皮质骨多孔、变薄）为特征的，W致骨的脆性增高W及骨折危险增加 的一种全身骨骼疾病。发病原因一般认为与巧及维生素缺乏、内分泌失调、营养失调W及运 动和光照不足有关。可发生于任何人群和任何年龄，多见于中老年人，尤其是绝经期妇女。 骨质疏松的严重后果是骨折，骨质疏松性骨折可阻碍患者的康复进程，增加医疗费用，甚至 加大死亡率。随着人类寿命的延长，骨质疏松及其并发的骨质疏松性骨折已成为严重的全 球性公共健康问题，大约有30%?50%的女性和15%?30%的男性在生命的某些阶段会 遇到骨质疏松引发的骨折。
[0003] 研究发现，骨质疏松病人血液中的维生素K2的浓度明显偏低，维生素K2的不足是 诱发骨质疏松症的一个原因，日本已将维生素K2作为骨质疏松病的治疗药物。常用的维生 素K2活性体有MK-7, MK-4, MK-9,其生物活性均大幅高于维生素Kl。在人体正常代谢中，在 肠胃功能正常状态时，肠道正常菌群参与下将维生素Kl和或维生素K3、维生素K4转化为维 生素K2活性体后才被吸收利用。
[0004] 目前，国内大部分是单纯通过补充巧、增加巧从肠道到血液的摄入来预防骨质疏 松症，但长期大量摄入巧剂会导致巧在血液及软骨等中大量沉积而增加动脉粥样硬化、血 压升高、中风、关节炎、肾结石等疾病的发生。维生素K特别是维生素K2的补充可W规避W 上风险，促进巧在血液中的进一步转化和有效利用。本发明的目的在于提供能够高产维生 素K2的活性成分MK7的菌株，提供该菌株的发酵培养方法W及在预防骨质疏松方面的应 用。
【发明内容】
[0005] 本发明实施例的目的在于提供一种具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌及其应用， 旨在解决目前，国内大部分是单纯通过补充巧、增加巧从肠道到血液的摄入来预防骨质疏 松症，长期大量摄入巧剂会导致巧在血液及软骨等中大量沉积而增加动脉粥样硬化、血压 升高、中风、关节炎、肾结石等疾病发生的问题。
[0006] 本发明实施例是该样实现的，一种具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌，该具有产 MK-7能力的纳豆芽抱杆菌命名为纳豆芽抱杆菌化CC1-0053,已于2014年1月16日保藏于 中国典型培养物保藏中也，其保藏编号为CCTCC M2014028。
[0007] 进一步，该具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌生物学特性如下；菌体呈杆状，很少 成链，染色均匀；芽抱呈楠圆形，培养基上成圆形或不规则形；表面色暗，可起皱，成淡黄色 或淡踪色；革兰氏阳性；通常在35?5(TC能生长，种子液最适温度42C，上罐发酵最适温 度 45°C。
[0008] 本发明实施例的另一目的在于提供一种具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌的应 用，该具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌的应用包括W下步骤：
[0009] 步骤一，斜面培养；将冻干菌粉接种于固体斜面培养基上，在35?45 C培养20? 2她；
[0010] 步骤二，一级种子培养；取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL?IOOmL种子 液体培养基中，在35?45C条件下，静置培养12?2化，制得一级种子液；
[0011] 步骤H，扩大培养；W 1?5%的接种量，将一级种子液接于500血?1000血种子 液体培养基中，在35?45C条件下，静置培养12?2化，制得二级种子液；
[0012] 步骤四，发酵罐培养；W 1?5%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中， 37 C，120巧m培养12?2化，转至40?5(TC条件下，静置培养5?7d ;
[0013] 步骤五，发酵结束后，立即将发酵液离也并用清水清洗，如此反复2?3遍后冷冻 干燥，粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；
[0014] 步骤六，发酵液与冻干菌粉前处理后，上样，高效液相色谱法测定MK-7的含量。
[0015] 进一步，在步骤二和步骤H中，种子液体培养基成分为；葡萄糖0.2%，蛋白腺 1.0%，氯化轴0.5%，酵母膏0.5%，抑值7.0 ;发酵培养基成分为；蛋白腺10%，丙H醇 3%、化Cl 0.5%, K2HPO4 0.02%，pH 7. 0-7. 2。
[0016] 进一步，在步骤四中，种子液培养条件为35?45C条件下，静置培养12?2化；发 酵培养条件为；37C，120巧m摇床培养12?2化，转至40?5(TC条件下，静置培养5?7d。
[0017] 进一步，在步骤四中，发酵液前处理方法为；发酵液上清浓缩比例10-100 : 1，经 浓缩液同体积氯仿-正己焼混合溶液，体积比氯仿：正己焼=4 : 1?1 : 1，浸提，冰水中 超声20?40min后磁力揽拌30min?化，分液漏斗液-液分离，收集有机溶剂氮吹，正己焼 复溶，0. 22um滤膜过滤两次后上样进行HPLC检测分析。
[0018] 进一步，在步骤五中，冻干菌体前处理方法为；冻干菌体称重，经氯仿-正己焼混 合溶液，体积比氯仿：正己焼比例为4 : 1?1 : 1，超声溶解20?40min后静置30min? 2h，25°C，5000?1000化pm离也5?15min，氮气吹干，氯仿-正己焼混合溶液复溶，0. 22um 滤膜过滤两次后上样进行HPLC检测分析。
[0019] 进一步，在步骤六中，HPLC检测MK-7含量，检测器为紫外检测器；流动相为甲醇： 己膳=60% -80% : 40% -20% ;柱温为20-4(TC ;检测波长为248nm ;流速为1. 0血/min ; 标品溶剂为正己焼；标品浓度为0. 00176-0. 088mg/ml。
[0020] 本发明实现的技术效果；成功筛选到具有产MK7能力的纳豆芽抱杆菌菌株，并且 确定了实用有效的发酵培养方法，实验结果显示服用该菌粉能有效改善骨质疏松状况，有 望开发为安全、无毒的预防骨质疏松的新型保健产品。本发明的纳豆芽抱杆菌能够生产 MK-7,产量高达3. 68733mg/g，补充人体代谢所需要的VK2,从而达到预防与治疗多种疾病 的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是本发明实施例提供的具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌的应用流程图；
[0022] 图2是本发明实施例提供的纳豆芽抱杆菌化CC1-0053发酵6d后，菌体MK-7 HPLC 分析示意图；
[0023] 图3是本发明提供的纳豆芽抱杆菌化CC1-0053的显微形态图。
【具体实施方式】
[0024] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0025] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0026] 本发明实施例的具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌；该菌种命名为纳豆芽抱杆菌 MXC1-0053炬acillus natto MXC1-0053)，已于2014年1月16日保藏于中国典型培养物 保藏中也，武汉大学；其保藏编号为CCTCC M 2014028;请求保藏的培养物名称及注明的鉴 别特征；纳豆芽抱杆菌WXC1-0053炬acillus natto BLCC1-0053);该培养物已于2014年 1月16日保藏于中国典型培养物保藏中也收到，并登记入册，根据要求，由2014年1月16 日起保存H十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年，该培养物的存 活性本保藏中也于2014年1月22日检测完毕，结果为存活。
[0027] 其生物学特性如下；菌体呈杆状，很少成链，染色均匀；芽抱呈楠圆形，培养基上 成圆形或不规则形；表面色暗，可起皱，成淡黄色或淡踪色；革兰氏阳性；通常在35?5(TC 能生长，种子液最适温度42C，上罐发酵最适温度45C。
[0028] 具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌，W冻干粉的形式应用于防治骨质疏松症等疾 病。
[0029] 如图1所示，本发明实施例的具有产MK-7能力的纳豆芽抱杆菌的应用包括W下步 骤：
[0030] SlOl ;斜面培养：将冻干菌粉接种于固体斜面培养基上，在35?45°C培养20? 2她；
[0031] S102 ;-级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL?100血种子 液体培养基中，在35?45C条件下，静置培养12?2化，制得一级种子液；
[0032] S103 ;扩大培养；W 1?5%的接种量，将一级种子液接于500血?1000血种子液 体培养基中，在35?45C条件下，静置培养12?2化，制得二级种子液；
[0033] S104 ;发酵罐培养；W 1?5%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中， 37 C，120巧m培养12?2化，转至40?5(TC条件下，静置培养5?7d ;
[0034] S105 ;发酵结束后，立即将发酵液离也并用清水清洗，如此反复2?3遍后冷冻干 燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；
[00巧]S106 ;发酵液与冻干菌粉前处理后，上样，高效液相色谱法OPLC)测定MK-7的含 量。
[0036] 在步骤S102和S103中，种子液体培养基成分为；葡萄糖0. 2%，蛋白腺1. 0%，氯 化轴0. 5 %，酵母膏0. 5 %，抑值7. 0 ;发酵培养基成分为；蛋白腺10 %，丙H醇3 %、化Cl 0. 5%，K2HP04 0. 02%，pH 7. 0-7. 2。
[0037] 在步骤S104中，种子液培养条件为35?45C条件下，静置培养12?2化；发酵培 养条件为；37 C，120巧m摇床培养12?2化，转至40?5(TC条件下，静置培养5?7d ;
[0038] 在步骤S104中，发酵液前处理方法为：发酵液上清浓缩（比例10-100 : I)，经浓 缩液同体积氯仿-正己焼混合溶液（体积比氯仿：正己焼=4 : 1?1 : 1)浸提，冰水中 超声20?40min后磁力揽拌30min?化，分液漏斗液-液分离，收集有机溶剂氮吹，正己焼 复溶，0. 22um滤膜过滤两次后上样进行HPLC检测分析。
[0039] 在步骤S105中，冻干菌体前处理方法为；冻干菌体称重，经氯仿-正己焼混合溶液 (体积比氯仿：正己焼比例为4 : 1?1 : 1)超声溶解20?40min后静置SOmin?化， 25°C，5000?1000化pm离也5?15min，氮气吹干，氯仿-正己焼混合溶液复溶，0. 22um滤 膜过滤两次后上样进行HPLC检测分析。
[0040] 在步骤S106中，HPLC检测MK-7含量，其特征在于：检测器为紫外检测器；流动 相为甲醇：己膳=60% -80% : 40% -20% ;柱温为20-4(TC ;检测波长为248nm ;流速为 1. 0血/min ;标品溶剂为正己焼；标品浓度为0. 00176-0. 088mg/ml。
[0041] 本发明的具体实施例：
[0042] 实施例1 ;
[0043] 纳豆芽抱杆菌初筛
[0044] 1材料与方法：
[0045] 1. 1实验菌株，纳豆芽抱杆菌化CC1-0048、纳豆芽抱杆菌化CC1-0053、纳豆芽抱杆 菌 MXC1-0054 ;
[0046] 1. 2发酵培养基及培养条件：
[0047] 两种培养基配方：
[004引种子培养基；葡萄糖0.2%，蛋白腺1%，牛肉膏0.5%，化Cl 0.5%，pH 7. 2-7. 4; [004引发酵培养基；酵母膏5%，丙；醇5%，蛋白腺10%，K2HP04 0 . 06% ;
[0050] 培养条件：摇床培养37 °C，2化，转速12化pm,然后45 °C静置培养5d。
[0051] 1. 3发酵结束后，离也分离发酵液及菌体，菌体冷冻干燥。
[0052] 1. 4发酵菌体与发酵液中MK-7含量测定：
[0053] 称取适量冻干菌体（约25mg)，经氯仿：正己焼=2 : 1 (体积比）混合溶液浸提， 冰水超声30min后静置化，25°C，80(K)巧m离也lOmin，收集有机溶剂氮气吹干，氯仿：正己 焼=2 : 1(体积比）混合溶液复溶，经0.22um的滤膜过滤两次后上样进行HPLC检测分析。
[0054] 发酵液上清浓缩（比例10-100 : 1)，浓缩液同体积有机溶剂（氯仿：正己焼= 2 : 1)混合浸提，冰水超声30min，磁力揽拌化，分液漏斗液液分离，收集
[00 巧]
【权利要求】
1?一种具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌，其特征在于，该具有产MK-7能力的纳豆芽孢 杆菌：该纳豆芽孢杆菌种命名为纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053,已于2014年1月16日保藏于 中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2014028。
2.如权利要求1所述的具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌，其特征在于，该具有产MK-7 能力的纳豆芽孢杆菌生物学特性如下：菌体呈杆状，很少成链，染色均匀；芽孢呈椭圆形， 培养基上成圆形或不规则形；表面色暗，可起皱，成淡黄色或淡棕色；革兰氏阳性；通常在 35?50°C能生长，种子液最适温度42°C，上罐发酵最适温度45°C。 3?-种具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于，该具有产MK-7能力的纳 豆芽孢杆菌的应用包括以下步骤： 步骤一，斜面培养：将冻干菌粉接种于固体斜面培养基上，在35?45 °C培养20?28h ; 步骤二，一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL?100mL种子液体 培养基中，在35?45°C条件下，静置培养12?24h，制得一级种子液； 步骤三，扩大培养：以1?5 %的接种量，将一级种子液接于500mL?1000mL种子液体 培养基中，在35?45°C条件下，静置培养12?24h，制得二级种子液； 步骤四，发酵罐培养：以1?5%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中， 37°C，120rpm培养12?24h，转至40?50°C条件下，静置培养5?7d ; 步骤五，发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2?3遍后冷冻干燥， 粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品； 步骤六，发酵液与冻干菌粉前处理后，上样，高效液相色谱法测定MK-7的含量。
4. 如权利要求3所述的具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于，在步骤 二和步骤三中，种子液体培养基成分为：葡萄糖0. 2 %，蛋白胨1. 0 %，氯化钠0. 5%，酵母膏 0.5%，？11值7.0;发酵培养基成分为：蛋白胨10%，丙三醇3%、恥(：10.5%，1( 2册040 . 02%， pH7. 0-7. 2。
5. 如权利要求3所述的具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于，在步 骤四中，种子液培养条件为35?45°C条件下，静置培养12?24h ;发酵培养条件为：37°C， 120rpm摇床培养12?24h，转至40?50°C条件下，静置培养5?7d。
6. 如权利要求3所述的具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于，在步骤 四中，发酵液前处理方法为：发酵液上清浓缩比例10-100 : 1，经浓缩液同体积氯仿-正己 烷混合溶液，体积比氯仿：正己烷=4 : 1?1 : 1，浸提，冰水中超声20?40min后磁力 搅拌30min?2h，分液漏斗液-液分离，收集有机溶剂氮吹，正己烷复溶，0. 22um滤膜过滤 两次后上样进行HPLC检测分析。
7. 如权利要求3所述的具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于，在步骤 五中，冻干菌体前处理方法为：冻干菌体称重，经氯仿-正己烷混合溶液，体积比氯仿：正 己烷比例为4 : 1?1 : 1，超声溶解20?40min后静置30min?2h，25°C，5000?lOOOOrpm 离心5?15min，氮气吹干，氯仿-正己烷混合溶液复溶，0. 22um滤膜过滤两次后上样进行 HPLC检测分析。
8. 如权利要求3所述的具有产MK-7能力的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于， 在步骤六中，HPLC检测MK-7含量，检测器为紫外检测器；流动相为甲醇：乙腈= 60% -80% : 40% -20% ;柱温为20-40°C ;检测波长为248nm ;流速为1. OmL/min ;标品溶 剂为正己烷；标品浓度为〇? 00176-0. 088mg/ml。
【文档编号】C12P7/66GK104357355SQ201410621082
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】单宝龙, 王静, 任宝涛, 张颜廷, 刘虹, 刘中青 申请人:山东凤凰生物有限公司