一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明具体涉及一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用。所述菌株分类命名为酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）CECLFN524，已于2010年11月05日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC NO. 4299。该菌株从中国新疆楼兰葡萄酒厂小无核白葡萄自然发酵过程中分离筛选得到，其筛选方法是通过WL培养基分离纯化后接入发酵液，用醋酸铅试纸显色法和硫化氢检测管法分别进行低产硫化氢菌株的初筛和复筛，并检测发酵液中硫化氢和氨基甲酸乙酯的含量，最终筛选得到低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酿酒酵母。该菌株可以应用于葡萄酒酿造工业。CGMCC NO. 429920101105
【专利说明】一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方 法和应用
[0001] 一、【技术领域】： 本发明具体涉及一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母及其筛选方法和应用。
[0002] 二、【背景技术】： 硫化氢（H2S)是对葡萄酒风味有重要影响的挥发性硫化物，在葡萄酒的发酵过程中，会 通过酿酒酵母的硫代谢产生痕量的H2S，它的挥发性很强，具有不愉快的气味，通常描述为 臭鸡蛋味、臭fi自味、大蒜味或洋葱味（赵光鳌等译（Boulton R B et al.)，葡萄酒酿造学： 原理及应用，北京：中国轻工业出版社，1989, 166-168)，其气味阈值为10-80 μ g/L (丁书 美等，酿酒，2007, 34(2):90-92)。硫化氢如再进一步与醇类物质结合可形成硫醇。硫醇类 物质对于葡萄酒质量的影响是双面的。一方面，某些硫醇类物质又是葡萄酒香气特性的组 成部分，例如：4_巯基-4-甲基-2-戊酮（4-MMP)可以给赤霞珠干红带来黑醋栗、黄杨木和 金雀花的香气，还可以给长相思干白带来典型的黑醋栗芽孢和猫尿味（Suomalainen H and Lehtonen M，Journal of the Institute of Brewing 1979，85 (3): 149-156)。另一方 面，低级硫醇有毒，有害健康，破坏酒的风味，给人以不愉快的感觉（宋尔康译（Dittrich， Η. Η.著)，葡萄酒微生物学，北京：轻工业出版杜，1989, 188-201)，虽然它们的生成水平只 有每升数十至数百微克，但其感官刺激作用明显，对葡萄酒风味有破坏作用。而且其风味一 旦形成，就难以用通气等一般方法简单地去除。在葡萄酒的酿造中，这种影响具有普遍性。
[0003] 氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate, EC,又叫Urethane)早在1943年就被证实 是一种致癌物质（Conacher H B S and Page B D, Proceedings of Euro Food Tox II · Ziirich, 1986, 237-242; Zimmerli B and Schlatter J, Mutation Research, 1991, 259: 325-350;陆建，曹钰，食品与发酵工业，1996，（3): 79-82)，研究表明，对啮齿类 动物，EC是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病，并且乙醇对EC 的致癌性有促进作用（Sakano K et al·，Free Radical Biology and Medicine, 2002， 33: 703-714;Miller Y E et al. , Cancer Letters, 2003, 198: 139-144; Tomisawa M et al. , Toxicology Letters, 2003, 142: 111-117; Beland F A et al. , Food and Chemical Toxicology, 2005, 43: 1-19)。1971 年，Lofroth和Gejvall 在葡萄酒中发现了 EC，1976年，Ough在酸乳酪和葡萄酒中检测到了 ECXOugh C S，J Agric Food Chem，1976， 24: 323-328; Ough, C S, J Agric Food Chem, 1976，24: 328-331)。葡萄酒中EC的形成 和葡萄汁中精氨酸和尿素浓度（U S FDA publication: Ethyl Carbamate - Preventative Action Manual. 1997; Butzke CE, Am J Enol Vitic, 1998, 49 (2): 220-224; Spano G et al. , World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, 22: 769-773)> 葡萄汁营养添加剂(如憐酸氢二铵）(Virginia D M et al·, FEMS Yeast Research, 2003, 3: 269-287; Inglis D, Cool Climate Oenology and Viticuture, Brock University, 2002)及葡萄酒的酿造工艺等有关（Ough C S et al·，Am J Enol Vitic, 1991，42 (1): 26-40; Valero E et al. , Biotechnology Letters, 1999, 21: 555-559; Valero E et al. , Journal of the Science of Food and Agriculture, 2003, 83: 83〇-835)〇
[0004] 对于去除葡萄酒中硫化氢的工艺处理主要有铜沉淀法和惰性气体去除法，但是这 两种方法都存在一定的问题：铜沉淀法可能会造成葡萄酒中铜离子超标，因此必须将其降 至国家标准允许范围内；通过惰性气体去除挥发性物质可能会同时带走其他重要的挥发性 物质，从而造成葡萄酒香气物质的损失。酵母分泌的尿素是葡萄酒中EC的主要前体物质之 一，葡萄酒酵母代谢精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特异性（Ough C S et al.，Am J Enol Vitic, 1991, 42 (1): 26-40; Daudt C E et al. , Am J Enol Vitic, 1992, 43 (4): 318-322; An D and Ough C S, American Journal of Enology and Viticulture, 1993, 44 (I): 35-40; Torrea-Goni D and Ancin-azpilicueta C, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 94 (1): 15-22)。研究表明，不同酵母菌对降解精氨酸产生尿素 有显著差异。构建酵母工程菌也是降低尿素分泌的措施之一，但是由于所构建基因在葡萄 酒环境中还不能充分表达，因此选育不分泌尿素或分泌尿素量低的酵母菌株，特别是选育 精氨酸酶活力低或用分子育种手段选育精氨酸酶缺陷型酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含 量的主要措施之一。因此针对尚无自己本土酵母的中国产区而言，寻找能够酿造有中国各 产区特色葡萄酒的优良酵母不仅能够提高葡萄酒的质量还对中国葡萄酒本土酵母的发展 具有重要意义。
[0005] 三、
【发明内容】
： 本发明为了解决上述【背景技术】中的不足之处，提供一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的 葡萄酒酵母及其筛选方法和应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯 的葡萄酒酵母，其特征在于：所述的葡萄酒酵母为酿酒酵母CECLFN524 cerehsiae CECLFN524)，该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心" 保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保藏日 期为2010年11月05日。
[0007] 所述的酿酒酵母CECLFN524的DNA序列图谱，26S D1-D2区序列（577bp)为： CCCCAACCGGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGT GCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAG GGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGC TCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAG ATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTG TTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAA ATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGAC GTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTAA ； 5. 8S-ITS 序列（818bp)为：AAAAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCAT GAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGG CTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTC AATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA CAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATAT TAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATT GCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGC GTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCA TTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTAC CAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATG TTCTTAAAGTTTGACCTCACATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAACCGGAGGAGAAGAAT。
[0008] -种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母的筛选方法，其特征在于：所述的 筛选方法为采摘新疆小无核白葡萄，在自然发酵过程中取发酵液，在ImL发酵液样品中加 入9mL无菌水进行梯度稀释，涂布WLN固体培养基平板，在温度为28°C下培养5d，根据酿酒 酵母在WLN培养基上的菌落特征：选择表面光滑奶油色，中央锥形突起，四周有暗黄色或浅 绿色环，不透明，奶油状的单菌落，挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化， 然后在纯化后WLN培养基上挑取酿酒酵母单菌落转接入YEH)液体培养基中，在温度为28 °C 下培养2d后，将酿酒酵母菌株采用甘油冷冻法保藏备用，同时，用接种环将YEH)培养液在 YEro固体培养基上划线，28°C下培养3d后，提取酵母菌落DNA，对rRNA基因的26S D1/D2 区进行聚合酶链式反应（PCR)扩增，对PCR扩增产物（即rRNA基因的26S D1/D2区）进行 测序，测序结果与国家生物技术信息中心（NCBI)上的Nucleotide collection (nr/nt)数 据库进行序列比对，鉴定为酿酒酵母菌株；得酿酒酵母菌株；将保藏备用的酿酒酵母菌株 进行活化后接入发酵液中，分别采用醋酸铅试纸法初筛、硫化氢检测管复筛和亚甲基兰分 光光度法检测发酵液中硫化氢含量，并检测发酵液中氨基甲酸乙酯的含量，筛选获得硫化 氢和氨基甲酸乙酯产量低的酿酒酵母CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心"保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC NO. 4299,保藏日期为2010年11月05日）。
[0009] 酿酒酵母CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心"保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保 藏日期为2010年11月05日)用于低产硫化氢、低产氨基甲酸乙酯的优质、安全葡萄酒的生 产。
[0010] 酿酒酵母CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心"保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保 藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干白葡萄酒。
[0011] 酿酒酵母CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心"保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保 藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干红葡萄酒。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明筛选得到的一株低产硫 化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株是从中国新疆楼兰葡萄酒厂小无核白葡萄自然发 酵过程中分离筛选得到的，具有优良的酿酒特性，能够有效应用于葡萄酒酿造工业，优化葡 萄酒工艺，对于提高葡萄酒的质量具有重要意义。
[0013] 本发明筛选获得的酵母是从葡萄酒自然发酵过程中分离筛选得到的，具有低产硫 化氢和氨基甲酸乙酯的功能，并且具有优良的酿酒特性，该菌株能够有效应用于葡萄酒酿 造行业，优化葡萄酒生产工艺，对于提高葡萄酒质量具有重要意义。
[0014] 四、【专利附图】
【附图说明】： 图1为酿酒酵母在WLN培养基上的菌落特征； 图2为发酵装置及硫化氢检测管显色情况； 图3为醋酸铅试纸显色情况示意图； 图4为EC校正标准曲线图； 图5为干白葡萄酒发酵工艺流程图； 图6为干红葡萄酒发酵工艺流程图； 图7为2010年CECLFN524的新疆霞多丽葡萄酒发酵曲线； 图8为本发明菌株CECLFN524的Interdelta指纹图谱。
[0015] 五、【具体实施方式】： 本发明一株低产硫化氢和氨基甲酸乙酯葡萄酒酿酒酵母的筛选方法为：采摘新疆小无 核白葡萄，在自然发酵过程中取发酵液，在ImL发酵液样品中加入9mL无菌水进行梯度稀 释，涂布WLN固体培养基平板，在温度为28°C下培养5d，根据酿酒酵母在WLN培养基上的菌 落特征：选择表面光滑奶油色，中央锥形突起，四周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状的 单菌落，挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化，然后在纯化后WLN培养基 上挑取酿酒酵母单菌落转接入YEH)液体培养基中，在温度为28°C下培养2d后，将酿酒酵 母菌株采用甘油冷冻法保藏备用。同时，用接种环将YEro培养液在YEro固体培养基上划 线，28°C下培养3d后，提取酵母菌落DNA，对rRNA基因的26S D1/D2区进行聚合酶链式反 应（PCR)扩增，对PCR扩增产物（即rRNA基因的26S D1/D2区）进行测序，测序结果与国家 生物技术信息中心（NCBI)上的Nucleotide collection (nr/nt)数据库进行序列比对，鉴 定为酿酒酵母菌株，得酿酒酵母菌株。将保藏备用的酿酒酵母菌株进行活化后接入发酵液 (菌株筛选时发酵液为TripleM模拟汁，实验室小容器发酵及酒厂酿酒试验验分别为不同葡 萄品种的葡萄汁/葡萄醪）中，分别采用醋酸铅试纸法初筛、硫化氢检测管复筛和亚甲基兰 分光光度法检测发酵液中硫化氢含量，并检测发酵液中氨基甲酸乙酯的含量，筛选获得硫 化氢和氨基甲酸乙酯产量低的CECLFN524。
[0016] 所述的小无核白葡萄在中国新疆楼兰葡萄酒厂采摘。
[0017] 所述的甘油冷冻法的冷冻温度为-80°C，甘油的体积分数为40%，菌液与40%甘油 的体积比为1:1。
[0018] 所述的CECLFN524在葡萄酒酿造工业中的应用。
[0019] 酿酒酵母CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心"保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保 藏日期为2010年11月05日)用于低产硫化氢、低产氨基甲酸乙酯的优质、安全葡萄酒的生 产。
[0020] 酿酒酵母CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心"保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保 藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干白葡萄酒。
[0021] 酿酒酵母CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心"保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保 藏日期为2010年11月05日）用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干红葡萄酒。
[0022] 实施案例1 :低产硫化氢和氨基甲酸乙酯葡萄酒酿酒酵母的筛选 1方法 I. 1酵母菌的分离纯化、鉴定及保藏：无菌称量约IOOg新鲜成熟度良好的葡萄，放入无 菌的500mL三角瓶，以无菌的研锤破碎，置于27°C培养，每隔24-72h取发酵液lmL，加入9mL 无菌水中进行梯度稀释，取5〇μ?稀释后菌液放入WLN固体培养基，以无菌刮铲涂布均匀， 28°C培养5d。根据酿酒酵母在WLN培养基单菌落特征：表面光滑奶油色，中央锥形突起，四 周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状。试验中WLN培养基上的酿酒酵母菌落图见图1。 挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化，将纯化好的菌株挑取酿酒酵母单菌 落转接入YEH)液体培养基中28°C培养2d，采用甘油冷冻法(菌液：40%甘油=1:1，-80°C) 保藏菌株。
[0023] I. I. 1酵母菌DNA提取 将上述的YEro培养液在YEro固体培养基上划线培养，于28°C下培养3d后，挑取适量 菌落提取DNA。
[0024] (1)用接种环取平板上菌落2~4环于200 μ L裂解液中，加入3/10总体积石英砂 在匀浆机振荡13min，每隔4min将离心管取出用力甩几下。（如果菌龄过大可将破壁时间延 长一些）然后65°C水浴IOmin。
[0025] (2)加入 200 μ L 5mol/L KAc，冰浴 8min ; (3) HOOOrpmX5min转移上清至新的离心管中； (4) 加入 3mol/L NaAc 35ul，加入异丙醇 200 μ L 混勻后冰浴 8min，HOOOrpmX 5min 收 集沉淀； (5) 200 μ L TE 溶解，加入 RNase 10 μ L，65°C水浴 IOmin; (6) 加入200 μ L氯仿一异戊醇（24:1)抽提； (7) 温柔地取上清150 μ L，加入20 μ L 3mol/L NaAc及375 μ L无水乙醇，混匀后 HOOOrpmX 8min 收集 DNA ; (8) 70%乙醇洗涤沉淀，吹干后TE溶解，-20°C保藏。
[0026] 1.1.2 26S rDNA D1/D2 区扩增及 5. 8S-ITS 区扩增 使用引物 NLl (5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3)和 NL4 (5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3) 进行26S rRNA D1/D2区的扩增。PCR循环为：95 °C预变性5min，94 °C变性lmin，52 °C 退火lmin，72 °C延伸lmin20s;循环36次；72 °C保温8miruPCR反应体系（50yL体 系）:10XPCR buffer5yL;25 mM MgCl2 3yL;10mM dNTP 1μ?;10μΜ 引物各 lyL;Taq酶 I. 5U，IOng-I μ g/ μ L模版DNA I μ L ;最后加双蒸水定容至50 μ L。
[0027] 使用引物 ITSl ( 5 0 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 0) /ITS4 (50 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-30)进行菌株的 5. 8S-ITS 区基因扩增（White TJ, · ei a/ 1990)。？〇?循环为951：5111丨11，951：1111丨11，521：2111丨11，721：2111丨11，循环次数35次，最后， 72°C 延伸 IOmin15PCR 反应体系总体积为 50yL，PCR 反应体系：10XPCR buffer(Taq buffer with KCL)5yL;25 mM MgCl26yL;10mM dNTPs 1μ?;10μΜ 引物各 2.5yL;Taq 酶 2.0U， 模版DNA I μ L ;加双蒸水至50 μ L)。
[0028] PCR反应产物的电泳检测：取5 μ L PCR扩增原液点样于1%的琼脂糖凝胶（I X TAE 缓冲液）电泳，溴化乙锭（EB)染色后在紫外灯照射下初步确定是否扩出所要片段。扩增成 功后，进行测序。测序结果与国家生物技术信息中心（NCBI)上的Nucleotide collection (nr/nt)数据库进行序列比对，对酵母菌株是否为酿酒酵母菌株进行鉴定。
[0029] I. I. 3 Interdelta 序列扩增 (1) 以基因组DNA为模板，使用优化的Interdelta引物进行PCR扩增；正反向引物序 列如下（Legras & Karst, 2003): deltal2 (5, -TCAACAATGGAATCCCAAC-3' ） delta21 (5' -CATCTTAACACCGTATATGA-3' ） (2) ?0?反应体系为25以1^，每管中加入1\卩0?1311打6410臟〇1/11'1^8-(：1口!18.4， 50mmol/L KC1) ;2.5mmol/L的MgCl2;0.5ymol/L delta引物；200ymol/L dNTPs;模板DNA 30-100ng，Taq 酶 2. 0U。ddH20 补齐； (3) PCR循环为预变性95°C 4min，变性95°C 30s，复性46°C 30s，延伸72°C 90s，循环 次数35次；最后72°C补平IOmin ; (4) 扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳2. 5h，电压100V，电流80mA ;在紫外成像仪上观 察，照相。
[0030] Interdelta扩增图谱是菌株的分子指纹图谱。
[0031] L 2低产H2S葡萄酒酵母的筛选 1. 2. 1低产硫化氢酿酒酵母的初筛=Triple M模拟汁培养基过滤除菌后分装至试管， 每管5mL。将活化好的菌液接种到Triple M模拟汁培养基中，把事先制备好的干燥的醋 酸铅试纸插在管口，28°C，120 r/min摇床培养4d，观察其显色情况并进行分类、记录，每菌 株2个重复。对照用商业酵母UCD522、UCD819,是酿酒酵母，来自The Enology Culture Collection, Department of Viticulture and Enology，UC Davis。
[0032] I. 2. 2低产硫化氢酿酒酵母的复筛：将初筛中得到的较低产H2S的菌进行Triple M模拟汁发酵，用硫化氢检测管法检测H 2S的生成量进行复筛。对照用商业酵母UCD522、 U⑶819,同时从初筛时高产和中产H2S的培养类型中挑取10株作为对照。取IOOmL已灭菌 小玻璃瓶，向其中注入90mL经过过滤除菌的Triple M模拟汁，每瓶按5 X IO5 cfu/mL (利 用血球计数板计数对数期培养的菌株以控制接种量）接种量接入模拟葡萄汁活化酵母菌 液，用2孔硅胶冒封好口，其中硫化氢检测管通过球形玻璃弯管与发酵罐内部相连，检测管 在娃胶冒下方露出2-3_，注意要和液面有较大距离，以免在摇床培养时接触模拟汁，另一 孔中插入长不锈钢注射针头到发酵液面以下，发酵装置见图2。将小瓶放入摇床中28°C下 120 r/min进行培养，3, 5-二硝基水杨酸（DNS)法检测还原糖含量监控发酵，还原糖含量低 于2 g/L终止发酵测量硫化氢检测管的显色长度，计算硫化氢生成量，每菌株3个重复；并 检测发酵液中氨基甲酸乙酯的含量，参照GB/T 15038-2006检测其酒度、残糖及挥发酸。
[0033] 1. 3模拟酒中氨基甲酸乙酯（EC)含量的测定 EC标准溶液：母液：1. 00mg/mL，将IOOmg的EC用丙酮溶解，以IOOmL容量瓶定容。标 准溶液：10. 0 μ g/mL，将I. OmL EC母液加入IOOmL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度。
[0034] PC标准溶液：母液：I. 00mg/mL，将IOOmg的PC用丙酮溶解，以IOOmL容量瓶定容。 标准溶液：1〇. 〇 μ g/mL，将ImL PC母液加入IOOmL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度。
[0035] PC内标溶液：800ng/mL，将8mL PC标准溶液加入IOOmL容量瓶中，用蒸馏水稀释 至刻度。
[0036] 标准曲线的绘制： ①校正标准溶液的配制：用二氯甲烷EC标准溶液和PC标准溶液进行稀释，得到以下浓 度的EC-PC溶液：（5ng EC + 800ng PC)/mL、（10ng EC + 800ng PC)/mL、（20ng EC + 800ng PC)/mL、 （40ng EC + 800ng PC)/mL、 （60ng EC + 800ng PC)/mL 、 （80ng EC + 800ng PC)/ mL、 （IOOng EC + 800ng PC)/mL 和（150ng EC + 800ng PC)/mL。
[0037] ②校正标准曲线的绘制：准确吸取各浓度的校正标准溶液lmL，置于250mL小烧杯 中，加入9mL蒸馏水，混合均匀，再加入IOg硅藻土，充分搅拌均匀后，装入玻璃色谱层析柱 中，然后用二氯甲烷进行洗脱。洗脱液流经装有IOg无水硫酸钠的漏斗，收集在蒸馏烧瓶 中，流速控制在2mL/min。洗脱液用真空旋转蒸发仪在30°C条件下进行浓缩，浓缩至4mL左 右转至KD瓶中，用少量的二氯甲烷润洗圆底烧瓶，使EC完全转入KD瓶中，在同样条件下浓 缩至lmL，转至离心管中进行GC/MS定量分析。对EC-nPC的峰面积比值和EC的浓度（5ng/ mL, 10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，60ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，150ng/mL)绘制标准曲线不意 图，并计算出标准曲线回归方程。
[0038] 模拟酒的萃取：准确量取葡萄酒样品10. OmL于250mL小烧杯中，加入I. OmL PC内 标溶液，混合摇匀，加入硅藻土 10. 〇g，用玻璃棒搅拌均匀，装入玻璃色谱层析柱中，然后用 75ml二氯甲烷进行洗脱。洗脱液浓缩程序同上。
[0039] GC-MS条件：①色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱30mX0. 25mmX0. 25μπι，进样口温 度190°C，柱温程序：初温40°C，保持2min，然后以10°C /min升至180°C，保持0. 5min，再以 50°C /min的速度升至220°C，保持4min。载气为高纯氦气，流速I. OmL/min，不分流进样，进 样量I. 0 μ L。②质谱条件：离子源温度220°C ;电子能量70eV ;接口温度220°C ;电子倍增 电压1568V;检测离子m/z 62、74、89，定量离子111/2 62。溶剂延迟1〇111；[11。
[0040] 2结果与分析 2. 1酵母菌株分子鉴定结果 2.1.1. 26S D1-D2 区序列（577bp): CCCCAACCGGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAA AGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTC TATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTT CGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGAC CGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGA AAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTG GGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAA TACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTAA 与相关模式菌株NRRL Y-12632相似性：99. 30%，鉴定为酿酒酵母 cerevisiae〇
[0041] 2. 1.2. 5.8S-ITS 部分序列（818bp) : AAAAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTT TTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCG CGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAA TTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGG GGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGA AATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA CGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCA TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATT GCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCG TTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTC TAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCACATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAACCG GAGGAGAAGAAT 与相关模式菌株MUCL51208相似性：99. 13%。
[0042] 经分子鉴定确认为酿酒酵母，图1为其在WLN培养基上的菌落特征形态特征。
[0043] 2. I. 3. Interdelta 图谱： Interdelta序列扩增 以基因组DNA为模板，使用优化的Interdelta引物（deltal2、delta21) (Legras & Karst, 2003)进行PCR扩增，菌株CECLFN524的Interdelta指纹图谱见图8。
[0044] 2. 2低产硫化氢和氨基甲酸乙酯葡萄酒酿酒酵母的筛选 (1)低产H2S酿酒酵母菌株的初筛：本研究采用的筛选方法为醋酸铅试纸法，此方法 可将筛选与检测H2S生成量一次完成。将初筛采用的醋酸铅试纸按照显色程度进行分级、 标号。根据附图中的图3醋酸铅显色可以分为4级，颜色最深的棕黑色记录为（+++)，属于 高产硫化氢的菌株；而显色结果为棕黄色则记录为（++)，属于中产型；显色结果为微黄色 或几乎无色则记录为（+ )或（_)，属于低产硫化氢的菌株。试验结果见表1，根据试验得出 CECLFN524 (该菌种已在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"保藏，保藏地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保藏日期为2010年 11月05日）的显色结果为微黄色，比对照工业酵母U⑶522的硫化氢产量低，初筛结果属于 低产硫化氢菌株。
【权利要求】
1. 一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母，其特征在于：所述的葡萄酒酵母为 酿酒酵母0￡〇^^524(5'<3<^力<3/'〇?/^615 1<^61/'611^'51/<36 10￡〇^：^524)，该菌种已在"中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心"保藏，保藏编号为CGMCC NO. 4299,保藏日期为2010 年11月05日。
2. 根据权利要求1所述的一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母，其特征在 于：所述的酿酒酵母CECLFN524的DNA序列图谱，26S D1-D2区序列（577bp)为： CCCCAACCGGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGT GCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAG GGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGC TCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAG ATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTG TTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAA ATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGAC GTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTAA ； 5. 8S-ITS 序列（818bp)为：AAAAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCAT GAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGG CTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTC AATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA CAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATAT TAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATT GCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGC GTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCA TTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTAC CAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATG TTCTTAAAGTTTGACCTCACATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAACCGGAGGAGAAGAAT。
3. 根据权利要求1所述的一种低产硫化氢和氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母的筛选方法， 其特征在于：所述的筛选方法为采摘新疆小无核白葡萄，在自然发酵过程中取发酵液，在 lmL发酵液样品中加入9mL无菌水进行梯度稀释，涂布WLN固体培养基平板，在温度为28°C 下培养5d，根据酿酒酵母在WLN培养基上的菌落特征：选择表面光滑奶油色，中央锥形突 起，四周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状的单菌落，挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN 培养基上划线纯化，然后在纯化后WLN培养基上挑取酿酒酵母单菌落转接入YEH)液体培 养基中，在温度为28°C下培养2d后，将酿酒酵母菌株采用甘油冷冻法保藏备用，同时，用接 种环将YEH)培养液在YEH)固体培养基上划线，28°C下培养3d后，提取酵母菌落DNA，对 rRNA基因的26S D1/D2区进行聚合酶链式反应（PCR)扩增，对PCR扩增产物（即rRNA基 因的26S D1/D2区）进行测序，测序结果与国家生物技术信息中心（NCBI)上的Nucleotide collection (nr/nt)数据库进行序列比对，鉴定为酿酒酵母菌株；得酿酒酵母菌株；将保藏 备用的酿酒酵母菌株进行活化后接入发酵液中，分别采用醋酸铅试纸法初筛、硫化氢检测 管复筛和亚甲基兰分光光度法检测发酵液中硫化氢含量，并检测发酵液中氨基甲酸乙酯的 含量，筛选获得硫化氢和氨基甲酸乙酯产量低的酿酒酵母CECLFN524。
4. 如权利要求1酿酒酵母CECLFN524用于低产硫化氢、低产氨基甲酸乙酯的优质、安全 葡萄酒的生产。
5. 如权利要求1酿酒酵母CECLFN524用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干白葡萄 酒。
6. 如权利要求1酿酒酵母CECLFN524用于葡萄酒酿造工业中应用，生产优质干红葡萄 酒。
【文档编号】C12R1/865GK104480029SQ201410664785
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】刘延琳, 秦义, 宋育阳, 宫雪, 白稳红 申请人:西北农林科技大学