一种降胆固醇发酵乳及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种降胆固醇发酵乳及其制备方法，主要以生鲜乳或乳粉为发酵原料，将乳杆菌DMDL9010接入上述原料中，进行发酵生产，制得降胆固醇发酵乳；所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.5172。该菌在体外的降解胆固醇中最高能降解90mg/100mL的胆固醇，在大鼠体内也表现出很好的降血脂胆固醇的效果，并有很好的耐酸性，本发明得到的发酵乳制品凝乳时间合适，后酸化不严重，口感细腻，风味香浓的发酵乳，本发明的工艺简单，操作方便，具有重要的工业价值。
【专利说明】一种降胆固醇发酵乳及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于乳酸菌和乳品加工的【技术领域】，具体涉及一种降胆固醇发酵乳及制备 方法。
【背景技术】
[0002] 胆固醇作为人体中重要的固醇类物质，在体内有广泛的生理作用，但随着人们日 常膳食摄入的动物性食品日益增多，不合理的膳食结构导致人体内的胆固醇含量容易增 多，这便会导致高胆固醇血症，从而引发冠心病、动脉粥样硬化、脑中风等心脑血管疾病。目 前国内对于降胆固醇乳酸菌的研宄尚处于起步阶段，大多数学者的研宄都集中于菌株的筛 选及其特性研宄，对作用机理的探讨不深，还未见有筛选出的具有高效降胆固醇功效的乳 酸菌在食品中应用的报道。因此，研宄具有降胆固醇功效的食品及其加工方法，可望使人们 在人体正常代谢不受干扰，也不必服用药物的情况下控制体内的血清胆固醇水平，有益人 体健康。
[0003] 据大量的研宄结果表明，乳酸菌具有降胆固醇的效果，经常食用含有这些具有 降胆固醇乳酸菌的发酵制品及其制剂，有助于降低血清中胆固醇的含量。专利号为ZL 200710123106.0的中国发明专利中筛选得到四种高产胆盐水解酶（BSH)的乳酸菌，并用于 酸奶的发酵，其菌株KS4最多能降解胆固醇为42. 90mg/100mL。专利号ZL 201110119378. X的中国发明专利中BBE8和BBE7菌株降解胆固醇的最好效果分别为7. 28mg/1 OOmL和 7. 16mg/100mL。专利号ZL 200910091381. 8的中国发明专利中筛选得到的乳酸菌和酵母菌 的降胆固醇的效果只以相对降解率89. 3%来衡量，能降解胆固醇的绝对量未标明。研宄论 文"具有胆盐水解酶活力乳酸菌的筛选及16SrDNA分子生物学鉴定（董改香，王俊国，段智 变，等.中国乳品工业，2008, 36(11) :7-10, 28) "、"植物乳杆菌LpTl和LpT2体外降胆固醇 机制（于平，孙海森，励建荣，等.微生物学报，2011，51(4) :561-565)"、"降胆固醇乳酸菌 的筛选及对大鼠血脂的影响（杨琴，胡颖，甘盛力，等。食品科学，2011，32(21) :223-228)"、 "具有降胆盐水解酶活性的乳酸菌对高血脂症大鼠血脂的调节作用（王俊国，孟和毕力格， 包秋华，等。食品科学，2013, 34(1) :257-262)"等论文并未涉及到这些菌在发酵乳中的具 体应用方法。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有乳酸菌降胆固醇的效果及其在发酵乳中的不足，目的是提供一种 降胆固醇的发酵乳及其制备方法。本发明一种降胆固醇的发酵乳具有降解胆固醇效果好的 特点，制作过程简单，制品的口感和风味符合"国家标准GB19302-2010发酵乳"中规定的要 求。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0006] 一种降胆固醇发酵乳的制备方法，以生鲜乳或乳粉为发酵原料，将乳杆 菌DMDL9010接入上述原料中，进行发酵生产，制得降胆固醇发酵乳；所述乳杆菌 (Lactobacillus sp.)DMDL 9010,已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 5172,地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。该乳杆菌（Lactobacillus sp.)DMDL 9010 菌株具有如下性质：①形态特征：二联杆菌，无芽孢，菌落表面光滑半透明，边缘整齐，有光 泽；②生理特征：接触酶阴性，氧化酶阴性，不液化明胶，不还原硝酸盐，精氨酸水解阴性， 酪素水解阴性，V-P试验阳性，革兰氏染色为阳性菌，兼性厌氧菌，可利用阿拉伯糖、木糖、半 乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、鹿糖、麦芽糖、核糖、山梨糖、海藻糖、七叶灵，不能利用鼠李糖 和棉籽糖。能在15°C、37°C、40°C温度下生长，在45°C温度不生长。根据16SrDNA寡核苷酸 序列，生理生化特性和编码乳酸脱氢酶基因的LDH1上下游片断的序列鉴定DMDL 9010为植 物乳杆菌。
[0007] 具体发酵生产步骤如下：
[0008] (1)将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于28°C -43°c的条件下培养 16h?24h，得到的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；
[0009] ⑵以体积比为5?10 :100的比例，将步骤⑴所得的种子液接种至含胆固醇的 液体培养基中，于28°C _43°C的条件下静止培养16h?24h，得到的菌体溶液为具有降胆固 醇的DMDL 9010诱导种子液；
[0010] (3)将具有降胆固醇的DMDL 9010诱导种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细 胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵 剂；
[0011] ⑷按体积百分比为5%?10%的比例将发酵剂接入到发酵原料中，在温度 28°C -43°C进行发酵，当发酵酸度达到75° T时终止发酵，即制得降胆固醇发酵乳，所述发 酵剂至少含有DMDL 9010发酵剂。
[0012] 所述发酵剂中还加入嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，其中，DMDL9010与嗜热链球 菌、保加利亚乳杆菌的细胞个数比为（0. 5?1. 25) :1 :1。
[0013] 所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨0. 8?1. 2份，酵母 粉0.2?0.8份，牛肉膏0.5?1.5份，葡萄糖1.5?2. 5份，柠檬酸三胺0. 1?0.3份，七 水合硫酸镁〇. 01?〇. 03份，磷酸氢二钾0. 05?0. 35份，四水合硫酸锰0. 001?0. 009份， 乙酸钠0. 05?0. 35份，抗坏血酸0. 02?0. 04份，胆固醇0. 05?0. 50份，吐温800. 05? 〇. 50份，蒸馏水91?96份。
[0014] 所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：
[0015] (1)按配方将胆固醇与吐温80混和并在沸水浴中充分溶解，混和均匀后，得到B溶 液；将其他原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却至80°C?85°C，得到A溶液；
[0016] (2) B溶液灭菌后将温度控制在80 °C?85 °C，然后将其缓慢加入到A溶液中，并不 断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后即可。
[0017] 所述MRS液体培养基为：以重量份数计，蛋白胨0.8?1. 2份，酵母粉0.2?0.8 份，葡萄糖1. 5?2. 5份，柠檬酸三胺0. 1?0. 3份，七水合硫酸镁0. 01?0. 03份，牛肉膏 0. 5?1. 5份，磷酸氢二钾0. 05?0. 35份，四水合硫酸锰0. 001?0. 009份，乙酸钠0. 05? 0. 35份，吐温800. 05?0. 15份，蒸馏水92. 8?96. 7份，培养基的pH为6. 0?7. 0。
[0018] 本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：
[0019] (1)本发明的乳酸菌DMDL9010是已知降解胆固醇的能力最高的，目前专利和文献 公开的乳酸菌的降解能力都在10mg/100mL左右，而DMDL 9010能降解69mg/100mL以上。
[0020] (2) DMDL9010菌株具有很好的耐酸性，作为益生菌提供了一个基础条件。
[0021] (3)DDL9010与发酵乳发酵剂（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌）按特定比例复配后 进行发酵乳发酵，其凝乳时间控制在5?6小时，发酵温度为28°C?43°C。发酵后的发酵 乳，后酸化不严重，在4°C?5°C温度下贮藏31天内酸度维持在108 ° T之内，口感风味不 错，表明在贮藏期内后酸化不严重。其中，胆固醇的降解量最高达到90mg/100mL。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是乳酸菌DMDL 9010与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌在发酵乳发酵过程中的 产酸曲线；其中按"0. 25 :1 :1"配比的发酵乳的发酵酸度不够、"0. 50 :1 :1"为实施例3的 情况、"0. 75 :1 :1"为实施例5的情况、"1 :1 :1"为实施例4的情况、"1. 25 :1 :1"为实施例 7的情况、按"1. 50 :1 :1"的配比的发酵乳的发酵过快。
[0023] 图2是含DMDL 9010菌株的发酵乳在4°C?5°C温度下贮藏31天内酸度的变化情 况；其中，"10% LCA9010"为实施例2，"0. 50 :1 :1"为实施例3，"0. 75 :1 :1"为实施例5， "1:1:1"为实施例4，"1.25:1:1"为实施例7。
[0024] 图3是实施例1中实验组大鼠肝脏大体形态的观察图，其中a、b、c、d、e分别为正 常组、高脂模型组、阳性组、9010高剂量组、9010低剂量组。
[0025] 图4是实施例1中实验组大鼠肝脏病理切片观察图（HEX400)，其中a、b、c、d、e 分别为正常组、高脂模型组、阳性组、9010高剂量组、9010低剂量组。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局 限于此。
[0027] 实施例1
[0028] 乳杆菌DMDL 9010在体外降解胆固醇的作用非常明显，并且具有很好的耐酸性和 降解胆固醇作用。
[0029] (1)乳杆菌DMDL 9010在体外降解胆固醇的作用
[0030] 利用邻苯二甲醛比色法（0PA法）测定在体外降胆固醇的相对含量，来衡量胆固醇 的降解效果。将其置于胆固醇含量为lOOmg/lOOmL的MRS液体培养基中，胆固醇的去除率 为30. 59±0. 67%。所述含胆固醇的MRS液体培养基（简称MRS-CH0L培养基）的配方为： 蒸馏水100mL，MRS培养基5. 4g，胆固醇0. lg，吐温80 2mL，牛胆盐0. 3g。分装至离心管中。 所述配制MRS-CH0L培养基方法为：①胆固醇为脂溶性物质，不溶于水，故先将其置于吐温 80中溶解，使其沸腾后充分溶解后趁热缓慢倒入培养基后，呈胶束溶液状态，此培养基的颜 色呈不透明的淡黄色。②配制好的培养基在经高温杀菌处理后，会在底部形成深黄色胶状 沉淀，该沉淀是吐温和胆固醇的混合物。此时应趁热将离心管晃动或上下颠倒振荡，以使该 胶状物完全溶解，并置于室温中自然冷却。若冷却速度过快或没有趁热震荡试管，则该沉淀 物会沉积在试管底部，无法溶解。③如果发现胆固醇没有溶解好，要增加吐温80的用量。
[0031] 将DMDL 9010接种于MRS液体培养基中，进行活化后，按体积百分比为5%接种至 MRS-CHOL培养基中，于37°C培养箱中培养24h后将菌液进行高压灭菌处理，再离心，取上清 液检测胆固醇的相对含量，计算胆固醇的去除率。为使得所测得的吸光度在线性范围内，稍 做修改，具体如下：①将样品经离心（3000r/min，10min)处理后，菌株沉积至试管底部，分 别吸取〇.5mL的上清液置于试管中作为样品；②分别添加3mL无水乙醇和2mL 50%的氢氧 化钾溶液，混匀后置于60°C水浴中加热10分钟，使其充分反应；③待溶液冷却后，加入5mL 正己烧，用振荡器使其混匀后，再加入3mL蒸馏水，再震荡混匀；④于室温中静置5分钟以使 溶液中的各相分离，其中上层的透明液体即为正己烷层，取〇.5mL正己烷层于试管中，用氮 吹仪于60°C中挥发尽溶剂；⑤加入邻苯二甲醛显色剂4mL(浓度为0. 25mg/mL，溶剂为冰乙 酸），静置10分钟后，再加入2mL浓硫酸，用振荡器使其充分混匀；⑥静置10分钟后，置于 A 55tol处测量吸光度，检测时间不超过90分钟；⑦由于所用的MRS-CH0L培养基本身具有颜 色（杀菌处理后呈金黄色），参照文献的方法，故测定胆固醇相对含量的方法来检测菌株对 胆固醇的去除率，无接种的MRS-CH0L培养基为对照组，测定吸光度时，以不加入样品，仅含 4mL显色剂和2mL浓硫酸的空白溶液为参比。菌株对胆固醇的去除率的公式：胆固醇去除 率=(1-实验组上层清液的吸光度/对照组无菌MRS-CH0L培养基的吸光度）X 100%。
[0032] 不同降解时间对胆固醇去除率的影响：在MRS-CH0L培养基中培养了不同时间后， 各菌株对胆固醇的去除率如表1所示，从表中可看出，胆固醇的去除率随着时间的延长而 得到提高，但相同的培养时间内，不同乳酸菌的胆固醇降解能力仍是有较大的差别。在表1 中植物乳杆菌NDC75017的降胆固醇的最高为32. 87%，实际降解量最高为19. 72mg/L(王 今雨，满朝新，杨相宜，等.植物乳杆菌NDC75017的降胆固醇作用，食品科学，2013,34(3): 243-247)。乳酸菌的胆固醇降解率随时间的延长而提高，其胆固醇降解率在72h后即趋于 稳定，至96h降解后效果最好，表现最明显的是DMDL 9010，至96h后其降解的胆固醇的能力 达到69. 05%，即培养基中69. 05mg/100mL的胆固醇被降解掉。
[0033] 表1不同降解时间对胆固醇的去除率（％ )
[0034]
【权利要求】
1. 一种降胆固醇发酵乳的制备方法，其特征在于，以生鲜乳或乳粉为发酵原料，将 乳杆菌DMDL9010接入上述原料中，进行发酵生产，制得降胆固醇发酵乳；所述乳杆菌 (Lactobacillus sp.)DMDL 9010,已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 5172。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体发酵生产步骤如下： (1) 将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于28°C -43°C的条件下培养16h? 24h，得到的菌体溶液为DMDL 9010的种子液； (2) 以体积比为5?10 :100的比例，将步骤⑴所得的种子液接种至含胆固醇的液体 培养基中，于28°C -43°C的条件下静止培养16h?24h，得到的菌体溶液为DMDL 9010诱导 种子液； (3) 将DMDL 9010诱导种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心， 去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂； ⑷按体积百分比为5%?10%的比例将发酵剂接入到发酵原料中，在温度28°C -43°C 进行发酵，当发酵酸度达到75° T时终止发酵，即制得降胆固醇发酵乳，所述发酵剂至少含 有DMDL 9010发酵剂。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵剂还含有嗜热链球菌和保加利 亚乳杆菌，其中，DMDL9010与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的细胞个数比为（0. 5?1. 25): 1 :1〇
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述含胆固醇的液体培养基的配方 为：以重量份数计，蛋白胨0. 8?1. 2份，酵母粉0. 2?0. 8份，牛肉膏0. 5?1. 5份，葡萄糖 1. 5?2. 5份，柠檬酸三胺0. 1?0. 3份，七水合硫酸镁0. 01?0. 03份，磷酸氢二钾0. 05? 0. 35份，四水合硫酸锰0. 001?0. 009份，乙酸钠0. 05?0. 35份，抗坏血酸0. 02?0. 04 份，胆固醇0. 05?0. 50份，吐温800. 05?0. 50份，蒸馏水91?96份。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含胆固醇的液体培养基的制备方法 为： (1) 按配方将胆固醇与吐温80混和并在沸水浴中充分溶解，混和均匀后，得到B溶液； 将其他原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却至80°C?85°C，得到A溶液； (2) B溶液灭菌后将温度控制在80 °C?85 °C，然后将其缓慢加入到A溶液中，并不断搅 拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后即可。
6. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述MRS液体培养基为：以重量份数 计，蛋白胨0.8?1.2份，酵母粉0.2?0.8份，葡萄糖1.5?2. 5份，柠檬酸三胺0. 1? 0. 3份，七水合硫酸镁0. 01?0. 03份，牛肉膏0. 5?1. 5份，磷酸氢二钾0. 05?0. 35份， 四水合硫酸锰〇. 001?〇. 009份，乙酸钠0. 05?0. 35份，吐温800. 05?0. 15份，蒸馏水 92. 8?96. 7份，培养基的pH为6. 0?7. 0。
7. -种由权利要求1?6任意一项方法制备的降胆固醇发酵乳。
8. 权利要求1所述乳杆菌DMDL 9010在制备降胆固醇食品和药品中的应用。
【文档编号】C12R1/225GK104430851SQ201410687203
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】冯立科, 杨爱君, 刘冬梅 申请人:广东燕塘乳业股份有限公司