一种富含β-葡聚糖的发酵乳及其制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种富含β-葡聚糖的发酵乳及其制备工艺，属于生物发酵【技术领域】。其由诱变选育的β-葡聚糖高产菌株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌作为发酵菌种，经过发酵，冷却，后熟等工艺步骤制得。本发明制备的发酵乳β-葡聚糖产量达268μg/ml，原菌株制作的发酵乳β-葡聚糖含量238μg/ml，比原菌株产β-葡聚糖能力提高了12.2%，而且风味未受影响。
【专利说明】一种富含β-葡聚糖的发酵乳及其制备工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物发酵【技术领域】，特别是涉及一种生物发酵用乳酸菌用于乳制品发 酵。
【背景技术】
[0002] 随着乳酸菌对人体健康有益的作用机理被揭示，乳酸发酵食品日益受到人们的重 视。而用于制作发酵食品的乳酸菌在生长代谢过程中会形成胞外多糖，在这些胞外多糖中 就含有β-葡聚糖，β-葡聚糖是低热量的食品原料，食用后不易被人消化吸收，可减少血 液中葡萄糖含量的增加，能预防糖尿病和控制肥胖病、糖尿病，降低体重，防止心血管疾病 的发生。由于β_葡聚糖有吸水膨胀的性质，人吃后在胃中能吸水膨胀，使人产生饱满感， 延缓从胃进入小肠的速度。进入肠道的β_葡聚糖仅有25%被消化吸收，其余60%继续向 肠下部移动，促进肠道蠕动，加之在结肠处渗透作用，防止便秘，缩短了废弃物通过肠道的 时间，减少了肠内致癌物对肠管的污染，达到防癌的作用。目前我国市场上的大多数发酵乳 制品中利用乳酸菌发酵产生的β_葡聚糖含量较低，筛选能定向发酵β_葡聚糖含量较高 的高产β -葡聚糖生产菌株对提高人们生活质量，进行功能性乳酸制品的开发具有重要意 义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有菌种的不足，提供一种由诱变选育的β -葡聚糖高产菌 株嗜热链球菌（St)与保加利亚乳杆菌（Lb )制备的发酵乳，所得发酵乳中富含大量β_葡聚 糖。
[0004] 本发明一种富含β -葡聚糖的发酵乳，经诱变选育的β -葡聚糖高产菌株嗜热链 球菌与保加利亚乳杆菌发酵制得，具体由如下制备工艺制得： (1) 将诱变选育的β -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌二者混合，经过 活化，扩培，制备成发酵剂，备用； (2) 将全脂乳粉调制成12%复原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下杀菌5min， 再冷却至45°C ; (3) 将步骤（1)制备的发酵剂接种到步骤（2)中冷却的复原乳中，进行发酵培养； (4 )最后经过冷却，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步骤（1)中保加利亚乳杆菌和诱变选育的β-葡聚糖高产菌株嗜热链球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌种比例混合； 所述步骤（2)中蔗糖添加量质量百分比为1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步骤（3)中菌种接种量为2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步骤（3)中的发酵温度为37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
[0005] 所述步骤（1)中保加利亚乳杆菌和诱变选育的β -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌的 菌种混合比例为2:1。
[0006] 所述步骤（2)中鹿糖添加量为6%。
[0007] 所述步骤（3)中菌种接种量为5%。
[0008] 所述步骤（3)中的发酵温度为41°C。
[0009] 所述的诱变选育的β -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌的制备方法如下： 将利用乳酸菌培养选择出的嗜热链球菌作为出发菌株，通过不同培养基的选择培养对 其进行纯化，同时对纯化得到的菌株进行性能测试，选择性能良好的菌株制成单细胞菌体 悬浮液，通过平板培养进行悬浮液菌落计数；利用紫外诱变和亚硝基胍诱变，对菌体悬浮液 进行诱变剂处理，利用乳酸菌培养对诱变剂处理后的菌体悬浮液进行菌落计数，计算致死 率；利用中间培养和平板涂布进行突变菌株分离，将分离出的菌株进一步筛选，首先进行初 筛，对筛选出的菌株进行复筛，对复筛出的菌株进行遗传稳定性经测定，即得。
[0010] 所述紫外诱变使用人工制作的紫外诱变灯发出的波长为253. 7 nm的紫外线，诱变 时间为120秒。
[0011] 所述亚硝基胍诱变处理剂量是0. 3mg/ml，诱变时间为50分钟。
[0012] 本发明富含β -葡聚糖的发酵乳的制备方法，具体包括如下工艺步骤： (1) 将诱变选育的β -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌二者混合，经过 活化，扩培，制备成发酵剂，备用； (2) 将全脂乳粉调制成12%复原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下杀菌5min， 再冷却至45°C ; (3) 将步骤（1)制备的发酵剂接种到步骤（2)中冷却的复原乳中，进行发酵培养； (4 )最后经过冷却，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步骤（1)中保加利亚乳杆菌和诱变选育的β-葡聚糖高产菌株嗜热链球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌种比例混合； 所述步骤（2)中蔗糖添加量质量百分比为1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步骤（3)中菌种接种量为2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步骤（3)中的发酵温度为37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
[0013] β -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌（St)的制备方法及检验具体如下。
[0014] (一）出发菌株的确定 1、因溴甲酚紫指示剂在酸性条件下呈黄色，在碱性条件下呈紫色，本实验用MRS培养 基的PH为6. 5,故加入溴甲酚紫指示剂后呈紫色，乳酸菌(嗜热链球菌株）在该培养基中培 养，由于分解葡萄糖产生乳酸，使菌落呈黄色，菌落周围的培养基也变为黄色。说明如果平 板由原来的紫色变为黄色说明该菌株能产酸。
[0015] 2、在1所述培养基中加入CaCO3，乳酸菌产生的乳酸可以溶解培养基中的CaCO 3，在 菌落周围形成明显的透明圈，既容易识别，又通过透明圈直径的大小，可以半定量地判断该 菌株产酸能力的高低，产酸量高的菌株透明圈大，产量低的透明圈小。
[0016] 3、通过1、2所述，试验选择溴甲酚紫_0&〇)3平板培养基进行菌株的分离和筛选。
[0017] 4、脱脂乳培养基：配方：脱脂乳粉12g，蒸馏水100mL，12rC，高压灭菌15min。脱 脂乳中含有大量的复合氮源、乳糖（4.8% )、矿物质（0.5%)和酶，是乳酸菌生长的良好底物 乳酸菌活化、发酵培养基。
[0018] 5、将乳酸菌(嗜热链球菌）接入MRS液体培养基中活化三代，然后进行梯度稀释。 在3所述溴甲酚紫-碳酸钙平板培养基上进行涂布分离，37 °C培养2天后，挑选透明圈和变 色圈大的单个菌落，接种到4所述脱脂乳培养基中，37°C培养2天。
[0019] 6、选择5所述凝乳良好的菌株进行刚果红检测，确定β -葡聚糖产量高且产酸稳 定的菌株作为诱变的出发菌株。方法是：将加热灭菌的发酵液搅拌，然后静置使蛋白质变 性沉淀。在5000r/min条件下离心IOmin,加入粉末活性炭1. 5%，充分搅拌，在50°C下静置 30-40min以吸附杂质，之后用真空抽滤法去除活性炭，然后采用冷冻结晶法去除大部分乳 酸钙，根据EDTA-Ca盐法测定的钙含量，加入定量的Na 2CO3生成CaCOjX淀离心除去钙离子， 得到乳酸发酵提取液。取4支具塞试管，在室温下依次加入3ml0. 2mol/LPH8的磷酸缓冲液， 25mg/L的刚果红溶液0. lml，其中3支试管依次加入0. 4mlPH调节为8的发酵液，余下体积 用去离子水补齐至4ml，另外1支直接用去离子水补齐至4ml，混匀，20°C条件下反应15min， 在550nm波长处测吸光度值，取平均值，查标准曲线得发酵液中实际β -葡聚糖的含量。
[0020] (二）紫外（UV)诱变 1、UV诱变出发菌株对数生长期的确定 将溴甲酚紫-CaCO3平板筛选出来的出发菌株接种于MRS试管液体培养基中，恒温37°C 传代培养进行活化，调整活菌数为108cfu/mL，按3%的接种量接种于装有MRS液体培养基的 三角瓶中，37°C恒温培养。每间隔2h取发酵液，在600nm波长下测定其OD值，以时间为横 坐标，以〇D_值为纵坐标作图，可得到出发菌株的对数生长曲线(每个测定值作三个重复， 取其平均值)。选取对数生长中后期的菌株制备单细胞悬浮液。
[0021] 2、单细胞悬浮液的制备 将培养至对数生长期的出发菌株发酵菌液4000rpm，5min离心得菌体，弃去上清液洗 涤两次，再用生理盐水适当稀释，在带有玻璃珠的三角瓶中震荡20min即制备成细胞悬浮 液，逐级稀释并在MRS平板上进行菌落计数。一般诱变处理细菌，调整其营养细胞浓度为 10 7-108cfu/mL。
[0022] 3、UV诱变处理 诱变过程应在暗室进行，照明采用红灯泡。紫外线的波长为136-390nm，其中波长为260 nm的紫外线杀菌能力最强。人工制作的紫外诱变灯发出的紫外线波长为253. 7 nm，其不仅 杀菌能力强，而且稳定，诱变效果好。
[0023] 取5-10mL菌体悬浮液置于Φ90的无菌平皿中，平皿中央放灭菌大头针一枚，开启 紫外灯（20W，照射距离30cm)预热20-30min，使光波稳定。打开磁力搅拌器，然后打开皿盖， 分别照射30s，60s，90s，120s，150s，180s和210s。以不经紫外照射的菌液作对照，分别取 紫外照射和未经照射的菌液lmL，经适当稀释分离。诱变处理后的菌液，浸在冰水浴中2-3h 后37°C恒温培养2h。取0. ImL菌液涂平板，每组三个平皿，平板用黑布或牛皮纸包裹置于 恒温箱培养。
[0024] 4、致死率的计算 待诱变处理的菌液长出菌落后进行计数，取三个平皿的平均值，以未经紫外照射的菌 液作对照，按照如下公式计算致死率。
[0025]
【权利要求】
1. 一种富含3 -葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述发酵乳经诱变选育的3 -葡聚糖 高产菌株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌发酵制得，具体由如下制备工艺制得： (1) 将诱变选育的3 -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌二者混合，经过 活化，扩培，制备成发酵剂，备用； (2) 将全脂乳粉调制成12%复原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下杀菌5min， 再冷却至45°C ; (3) 将步骤（1)制备的发酵剂接种到步骤（2)中冷却的复原乳中，进行发酵培养； (4 )最后经过冷却，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步骤（1)中保加利亚乳杆菌和诱变选育的3 -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌种比例混合； 所述步骤（2)中蔗糖添加量质量百分比为1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步骤（3)中菌种接种量为2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步骤（3)中的发酵温度为37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
2. 如权利要求1所述的富含P -葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述步骤（1)中保加利 亚乳杆菌和诱变选育的3 -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌的菌种混合比例为2:1。
3. 如权利要求1所述的富含￠-葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述步骤（2)中蔗糖添 加量为6%。
4. 如权利要求1所述的富含￠-葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述步骤（3)中菌种接 种量为5%。
5. 如权利要求1所述的富含￠-葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述步骤（3)中的发酵 温度为41°C。
6. 如权利要求1所述的富含P -葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述的诱变选育的 3-葡聚糖高产菌株嗜热链球菌的制备方法如下： 将利用乳酸菌培养选择出的嗜热链球菌作为出发菌株，通过不同培养基的选择培养对 其进行纯化，同时对纯化得到的菌株进行性能测试，选择性能良好的菌株制成单细胞菌体 悬浮液，通过平板培养进行悬浮液菌落计数；利用紫外诱变和亚硝基胍诱变，对菌体悬浮液 进行诱变剂处理，利用乳酸菌培养对诱变剂处理后的菌体悬浮液进行菌落计数，计算致死 率；利用中间培养和平板涂布进行突变菌株分离，将分离出的菌株进一步筛选，首先进行初 筛，对筛选出的菌株进行复筛，对复筛出的菌株进行遗传稳定性经测定，即得。
7. 如权利要求6所述的富含0 -葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述紫外诱变使用人 工制作的紫外诱变灯发出的波长为253. 7 nm的紫外线，诱变时间为120秒。
8. 如权利要求6所述的富含0 -葡聚糖的发酵乳，其特征在于：所述亚硝基胍诱变处 理剂量是〇. 3mg/ml，诱变时间为50分钟。
9. 一种如权利要求1所述富含0 -葡聚糖的发酵乳的制备方法，其特征在于：所述发 酵乳经诱变选育的3 _葡聚糖高产菌株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌发酵制得，具体包括 如下工艺步骤： (1) 将诱变选育的3 -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌二者混合，经过 活化，扩培，制备成发酵剂，备用； (2) 将全脂乳粉调制成12%复原乳，然后加入蔗糖，溶解后在90°C -95°C下杀菌5min， 再冷却至45°C ; (3)将步骤（1)制备的发酵剂接种到步骤（2)中冷却的复原乳中，进行发酵培养； (4 )最后经过冷却，后熟，制得成品，在4 °C下冷藏，即得； 所述步骤（1)中保加利亚乳杆菌和诱变选育的3 -葡聚糖高产菌株嗜热链球菌以1 :3、 1 :2、1 :1、2 :1或3 :1的菌种比例混合； 所述步骤（2)中蔗糖添加量质量百分比为1%，3%，5%，6%、7%或9% ; 所述步骤（3)中菌种接种量为2%、4%、5%、6%、8%或10% ; 所述步骤（3)中的发酵温度为37°C、39°C、41°C、43°C*45°C。
【文档编号】A23C9/127GK104489085SQ201410848145
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】孙鸿雁 申请人:临沂格瑞食品有限公司