一种火麻蛋白ace抑制肽的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，包括以下几个步骤：步骤A：称取脱脂火麻仁粕，干燥，粉碎，过筛去除杂质，加水至固定料液比，用胶体磨进行匀浆，过筛，调节 pH 值，超声波辅助提取，恒温碱提蛋白，等电点沉淀，离心除去上清液，沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机进行均质，过筛，调节 pH 值，等电点沉淀，离心除去上清液，中和，干燥得到火麻仁分离蛋白；步骤B：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节 pH 值，加入混合蛋白酶，恒温酶解，沸水浴灭酶，离心取上清液；步骤C：将火麻仁蛋白酶解液分离纯化，将收集所得火麻仁蛋白ACE抑制肽进行冷冻干燥，即制得。本发明提供的方法操作简单，产物得率高，ACE抑制效果好。
【专利说明】一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物活性肽【技术领域】，尤其涉及一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 目前，国内对火麻仁的研究和利用主要集中在火麻仁油的提取和利用上，火麻仁 油富含亚油酸，α -亚麻酸和油酸和类花生酸，对于恢复人体的免疫系统所引起的慢性疾病 和辅助治疗有帮助。在国内，一直以来都是将火麻仁榨油，渣滓用作动物饲料，造成大量的 资源浪费。随着对火麻蛋白营养功能的进一步认识，已有企业和科研人员开始利用榨取油 脂后的火麻渣滓进行产品加工，但多限制于饮料等产品的研究中。
[0003] 火麻仁中蛋白质的含量约为25%，含有20种已知氨基酸，其中包括9种人体必 需氨基酸。火麻仁蛋白质主要含麻仁球蛋白和麻仁白蛋白，火麻仁蛋白中80%为麻仁球蛋 白（esedstin)，20%约为白蛋白（albumin)。麻仁球蛋白含有酸性亚基和碱性亚基，相对 无磷，用火麻仁蛋白进行的体外试验，即用胃蛋白酶水解后接着用胰蛋白酶水解，结果表明 麻球蛋白易于消化，其必需氨基酸要比大豆分离蛋白高出很多。火麻仁蛋白所含必需氨基 酸足以满足2-5岁儿童的生长发育需要。因此麻仁蛋白是一种十分优异的植物蛋白新资 源。而且火麻仁所含的麻仁球蛋白和人类血浆的球蛋白极其相似，麻仁球蛋白可作为人体 血浆的组成成分。火麻仁蛋白质有相当高含量的精氨酸，是大豆蛋白的约1.5倍。同时， 有比较高含量的组氨酸，与大豆蛋白和葡萄籽蛋白很接近，精氨酸和组氨酸对儿童期的生 长非常重要，同时精氨酸能在体内转化为一氧化氮，具有扩张血管，降低血压，保持血管畅 通且有弹性的作用，精氨酸可以治疗高血压、肝昏迷、肝硬化等，西方国家用精氨酸来预防 和治疗心血管疾病已经比较成熟，在许多功能性食品中添加了 L-精氨酸。因此，如何实现 火麻蛋白的工业化生产更是国内外学者的研究热点。
【发明内容】
[0004] 目前来说，抑制ACE成为控制血压升高的有效途径。但是，目前化学ACE抑制剂 副作用大，而生物ACE抑制剂由于采用生物酶法存在生产条件要求高、生产工艺复杂、设备 价格昂贵。
[0005] 为了解决上技术问题，本发明提供一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，包括以 下几个步骤： 步骤A :火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁柏，干燥，粉碎，过筛去除杂质。加水至 固定料液比，用胶体磨进行匀浆，过筛，调节PH值，超声波辅助提取，恒温碱提蛋白，等电 点沉淀，离心除去上清液，沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机进行均 质，过筛，调节pH值，等电点沉淀，离心除去上清液，中和，干燥得到火麻仁分离蛋白； 步骤B :火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节pH 值，加入混合蛋白酶，恒温酶解，沸水浴灭酶，离心取上清液； 步骤C :火麻仁蛋白ACE抑制肽的纯化制备：将火麻仁蛋白酶解液分离纯化，将收集 所得火麻仁蛋白ACE抑制肽进行冷冻干燥，即制得高纯度火麻仁蛋白ACE抑制肽。
[0006] 优选的，所述步骤A中，超声波辅助处理采用温度20~30°C，作用功率120~200W， 占空比为20:20s/s，时间为40~80 min。
[0007] 优选的，所述步骤A中，碱提的条件是pH=8~9. 5,提取温度45~55°C，料液比1 : 10~20 g/mL，提取时间为 40~80min。
[0008] 优选的，所述步骤A中，离心速度为5000~6000 r/ min,离心时间为10~20 min。
[0009] 优选的，步骤B中，混合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，所述 混合质量比为1~2 :1~3 :1~3。
[0010] 优选的，步骤B中，加酶量为4500~8000U/g，底物质量浓度6~16%，温度为 45~55°C，ρΗ=8~9· 5,酶解时间为 2~4h。
[0011] 优选的，步骤B中，离心速度为7000~8000r/min，离心时间为5~10 min。
[0012] 优选的，步骤A中，匀浆后的物料过400目筛，均质后的物料过600目筛；匀浆温度 为25°C，胶体磨间隙为在0. l~lmm，勻楽时间为5~10min ;均质温度为55~65°C、均质压力为 5~30MPa，均质次数为2~3次。
[0013] 优选的，所述步骤C包括以下几个步骤： 步骤1)火麻水解蛋白肽脱盐采用大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温 25~30°C，火麻水解蛋白肽上样浓度为50~100mg /mL，上样流速为100~200mL/h，上样结束 后用去离子水洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用体积分数为体积分数为 75%的乙醇进行解吸，收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇； 步骤2)采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱 填料：S印hadexG~15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为100~200mg/mL，缓冲液为 pH=8.0~8. 5的碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速4~8 mL /min，收集洗脱体积40~400 mL的组 分，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。
[0014] 优选的，所述步骤C包括以下几个步骤： 步骤1)火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：操作压力： 0· 5~0· 8MPa，料液浓度为 5~10ug/mL，pH =8~8· 5,温度为 35°C ; 步骤2)采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组 件进行超滤，压力〇. 4~0. 5MPa，温度30°C，料液浓度50~80mg/ml，取滤过液进行二级超滤， 二级超滤采用IKD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 5~0. 6MPa，温度30°C，取浓缩液，浓缩液 为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。
[0015] 本发明提供的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法操作简单，制备出的ACE抑制肽具 有抗氧化性，易于消化，氨基酸含量高，并具有扩张血管，降低血压，保持血管畅通且有弹性 的作用；提升火麻精深加工利用水平，充分利用火麻副产物资源，提高广大农户收益。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1 一次性灌胃火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响。
[0017] 图2注射火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响。
[0018] 图3连续灌胃火麻蛋白ACE抑制肽对SHR大鼠血压的影响。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明： 实施例1 1、火麻仁蛋白质的提取：火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁柏，干燥，粉碎，过筛 去除杂质。加水至料液比为I :12g/mL，用胶体磨进行匀浆，匀浆温度为25°C，胶体磨间隙 为0. 1mm，匀浆时间为5min，匀浆后的物料过600目筛，调节pH值为8. 5,进行超声波辅助 提取，温度25°C，作用功率120W，占空比为20:20s/s，在水浴温度50°C条件下，恒温碱提 蛋白60 min，然后用I mol /L的HCl溶液调至火麻仁蛋白质等电点，充分搅拌后，静止沉 淀，让蛋白质充分下沉，以5000 r/ min转速，离心20 min,除去上清液；沉淀进行第二次碱 提蛋白，加水至固定料液比，用均质机均质3次，均质温度为55 °C、均质压力为25MPa，过600 目筛，调节pH值，等电点沉淀，以8000 r/ min转速，离心10 min,除去上清液，用蒸馈水洗 涤沉淀3次，中和至中性，冷冻干燥得到火麻仁分离蛋白。
[0020] 2、火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节pH值 为9. 0,加入由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为1 :1 :1组成的混合蛋白 酶，加酶量为7000U/g，底物质量浓度为7%，45°C恒温酶解4h，后用沸水浴10 min终止反应， 灭酶后迅速冷却，以转速8000r/min离心分离10 min，收集上清液； 3、火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备： ①火麻水解蛋白肽脱盐采用DA201-C大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温 25°C，火麻水解蛋白肽上样浓度为50mg /mL，上样流速为100mL/h，上样结束后用去离子水 洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用75%的乙醇进行解吸，收集洗脱液，真 空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇。
[0021] ②采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填 料：S印hadexG-15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为100mg/mL，缓冲液为pH=8. 0的 碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速4 mL /min，收集洗脱体积40 mL的组分，真空冷冻干燥，即 为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。
[0022] 实施例2 1、火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁柏，干燥干燥，粉碎，过筛去除杂质。加水至 料液比为I :20 g/mL，用胶体磨进行匀浆，匀浆温度为25°C，胶体磨间隙为在1mm，匀浆时间 为8min，匀浆后的物料过600目筛，调节pH值为8,进行超声波辅助提取，温度30°C，作用 功率150W，占空比为20 :20s/s，在水浴温度55°C条件下，恒温碱提蛋白80 min，然后用1 mol /L的HCl溶液调至火麻仁蛋白质等电点，充分搅拌后，静止沉淀，让蛋白质充分下沉， 以6000 r/ min转速，离心15 min,除去上清液；沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料 液比,用均质机均质2次，均质温度为55°C、均质压力为30MPa，过600目筛，调节pH值，等 电点沉淀，以7000 r/ min转速，离心5min，除去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀5次，中和至中 性，50 °C热风烘干得到火麻仁分离蛋白。
[0023] 2、火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节pH值 为9. 5,加入由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比为2 :3 :3组成的混合蛋白 酶，加酶量为4500U/g，底物质量浓度为6%，55°C恒温酶解3h，后用沸水浴10 min终止反 应，灭酶后迅速冷却，以转速8000r/min离心分离5min，收集上清液。
[0024] 3、火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备： ①火麻水解蛋白肽脱盐采用DA201~C大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温 28°C，火麻水解蛋白肽上样浓度为80mg /mL，上样流速为150mL/h，上样结束后用去离子水 洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用体积分数为75%的乙醇进行解吸，收集 洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇。
[0025] ②采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填 料：S印hadexG~15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为150mg/mL，缓冲液为pH=8. 3的 碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速6 mL /min，收集洗脱体积200 mL的组分，真空冷冻干燥，即 为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。
[0026] 实施例3 1、火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁柏，干燥，粉碎，过筛去除杂质。加水至料液 比为I :15 g/mL,用胶体磨进行匀楽,匀楽温度为30°C,胶体磨间隙为在0. 5mm,匀楽时间为 IOmin,匀浆后的物料过600目筛，调节pH值为8,进行超声波辅助提取，温度20°C，作用 功率200W，占空比为20 :20s/s，在水浴温度45°C条件下，恒温碱提蛋白40 min，然后用1 mol /L的HCl溶液调至火麻仁蛋白质等电点，充分搅拌后，静止沉淀，让蛋白质充分下沉， 以6000 r/ min转速，离心15 min,除去上清液；沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料 液比,用均质机均质3次，均质温度为60°C、均质压力为30MPa，过600目筛，调节pH值，等 电点沉淀，以7500 r/ min转速，离心10 min,除去上清液，用蒸馈水洗漆沉淀3次，中和至 中性，冷冻干燥得到火麻仁分离蛋白。
[0027] 2、火麻仁蛋白肽的水解：采用混合蛋白酶的制备火麻仁蛋白肽的工艺条件为：混 合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，混合质量比为2 :2 :3,加酶量8000 U/g，底物浓度16%，温度55°C，pH=9. 5,酶解时间4h，后用沸水浴10 min终止反应，灭酶后 迅速冷却，以转速7500r/min离心分离10 min,收集上清液。
[0028] 3、火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备： ①火麻水解蛋白肽脱盐采用DA201~C大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温 30°C，火麻水解蛋白肽上样浓度为IOOmg /mL，上样流速为200mL/h，上样结束后用去离子水 洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用体积分数为75%的乙醇进行解吸，收集 洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇。
[0029] ②采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱填 料：S印hadexG~15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为200mg/mL，缓冲液为pH=8. 5的 碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速8 mL /min，收集洗脱体积400 mL的组分，真空冷冻干燥，即 为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。
[0030] 实施例4 与实施例1不同的是：火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备采用如下方式： 火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：纳滤膜NF400,操作压力： 0. 5MPa，料液浓度为5ug/mL，pH=8、温度为35°C。采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋 白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 4MPa，温度30°C，料液浓度50mg/ ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用IKD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 5MPa，温度 30°C，取浓缩液，浓缩液为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋 白ACE抑制肽。
[0031] 实施例5 与实施例2不同的是，火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备采用如下方式： 火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：纳滤膜NF400,操作压力： 0. 8MPa，料液浓度为10ug/mL，pH=8. 5、温度为35°C。采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解 蛋白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 5MPa，温度30°C，料液浓度50mg/ ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用IKD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 6MPa，温度 30°C，取浓缩液，浓缩液为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋 白ACE抑制肽。
[0032] 实施例6 与实施例3不同的是，火麻仁蛋白ACE抑制肽的制备采用如下方式 火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：纳滤膜NF400,操作压力： 0. 6MPa，料液浓度为8ug/mL，pH=8. 5,温度为35°C。采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋 白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 5MPa，温度30°C，料液浓度50mg/ ml，取滤过液进行二级超滤，二级超滤采用IKD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 6MPa，温度 30°C，取浓缩液，浓缩液为分子量在1KD~5KD范围的多肽，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋 白ACE抑制肽。
[0033] 实施例7 性能测试： 一、 火麻蛋白ACE抑制肽脱盐率的测定 盐分含量采用灰分法GB/T 5009. 4 - 2003测定 脱盐率=(Mci -M1)/MtlX 100% M1:脱盐后盐分含量（％) Mtl:脱盐前盐分含量（％) 二、 火麻蛋白ACE抑制肽短肽得率测定 短肽得率=VNtlX 100% Ntl:脱盐前总氮含量,mg; N1:脱盐后氣含量，mg ; 通过对大孔树脂脱盐及纳滤法脱盐结果进行比较，两种方法对火麻蛋白ACE抑制肽脱 盐率和短肽得率的测定结果如表1所示，采用大孔树脂进行脱盐，测定火麻蛋白ACE抑制肽 的脱盐率达到87.43%，短肽得率为77.38%，采用纳滤膜进行脱盐，测定火麻蛋白ACE抑制 肽的脱盐率为66. 43%，短肽得率为89. 37%。试验表明大孔树脂的脱盐效果明显比纳滤脱盐 效果高，但是短肽的率较纳滤比较少，因此如果需要得到纯度较大含盐量较少的肽选用大 孔树脂法脱盐，而对肽纯度要求不高时选用纳滤法脱盐。
[0034] 表1不同处理对火麻蛋白ACE抑制肽脱盐率和短肽得率
【权利要求】
1. 一种火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤： 步骤A :火麻仁蛋白质的提取：称取脱脂火麻仁柏，干燥，粉碎，过筛去除杂质，加水至 固定料液比，用胶体磨进行匀浆，过筛，调节pH值，超声波辅助提取，恒温碱提蛋白，等电 点沉淀，离心除去上清液，沉淀进行第二次碱提蛋白，加水至固定料液比，用均质机进行均 质，过筛，调节pH值，等电点沉淀，离心除去上清液，中和，干燥得到火麻仁分离蛋白； 步骤B:火麻仁蛋白肽的定向酶解制备：将火麻仁分离蛋白加入去离子水，调节pH 值，加入混合蛋白酶，恒温酶解，沸水浴灭酶，离心取上清液； 步骤C :火麻仁蛋白ACE抑制肽的纯化制备：将火麻仁蛋白酶解液分离纯化，将收集 所得火麻仁蛋白ACE抑制肽进行冷冻干燥，即制得高纯度火麻仁蛋白ACE抑制肽。
2. 如权利要求1所述的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，所述步骤A中， 超声波辅助处理采用温度20~30°C，作用功率120~200W，占空比为20:20s/s，时间为 40?80 min〇
3. 如权利要求1所述的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，所述步骤A 中，碱提的条件是pH=8~9. 5,提取温度45~55°C，料液比为1:10~20 g/mL，提取时间为 40?80min。
4. 如权利要求1所述的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，所述步骤A中， 离心速度为5000 ~6000r/ min，离心时间为10~20 min。
5. 如权利要求1所述的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤B中，混合 蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，所述混合质量比为1~2 :1~3 :1~3。
6. 如权利要求1所述的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤B中，加酶 量为4500~8000U/g，底物质量浓度6~16%，温度为45~55°C，pH=8~9. 5,酶解时间为2~4h。
7. 如权利要求1所述的火麻蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤B中，离心 速度为7000~8000r/min，离心时间为5~10 min。
8. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A中，勻浆后的物料过400目筛，均 质后的物料过600目筛；匀浆温度为25°C，胶体磨间隙为在0. 匀浆时间为5~10min ; 均质温度为55~65°C、均质压力为5~30MPa，均质次数为2~3次。
9. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C包括以下几个步骤： 步骤1)火麻水解蛋白肽脱盐采用大孔吸附树脂，制备型层析柱，层析条件为：室温 25~30°C，火麻水解蛋白肽上样浓度为50~100mg /mL，上样流速为100~200mL/h，上样结束 后用去离子水洗涤层析柱，当电导率降至与去离子水相当时，采用75%的乙醇进行解吸，收 集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩蒸去乙醇； 步骤2)采用凝胶过滤层析色谱分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，色谱条件为：色谱柱 填料：S印hadexG~15凝胶，脱盐火麻水解蛋白肽的上样浓度为100~200mg/mL，缓冲液为 pH=8.0~8. 5的碳酸氢铵缓冲液溶解，洗脱流速4~8 mL /min，收集洗脱体积40~400 mL的组 分，真空冷冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。
10. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C包括以下几个步骤： 步骤1)火麻水解蛋白肽脱盐采用纳滤膜分离装置，脱盐条件为：操作压力： 0? 5~0. 8MPa，料液浓度为 5~10ug/mL，pH =8~8. 5、温度为 35°C ; 步骤2)采用超滤装置分离纯化脱盐火麻水解蛋白肽，一级超滤采用5KD的膜过滤组 件进行超滤，压力0. 4~0. 5MPa，温度30°C，料液浓度50~80mg/ml，取滤过液进行二级超滤， 二级超滤采用1KD的膜过滤组件进行超滤，压力0. 5~0. 6MPa，温度30°C，取浓缩液，真空冷 冻干燥，即为纯化火麻蛋白ACE抑制肽。
【文档编号】C12P21/06GK104480177SQ201410848038
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】游向荣, 张雅媛, 卫萍, 孙健, 李志春, 李明娟, 杨媚 申请人:广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所