本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种提高龙须菜品质的发酵方法。
背景技术：
龙须菜是较为常见的大型海藻，因其具有重要经济价值和生态功能而被广泛研究，并在我国沿海地区实现人工栽培养殖，成为继海带、紫菜、裙带菜后的又一个新兴的海藻产业群。龙须菜主要成分是琼胶多糖和粗纤维，约占藻体的59.4％。龙须菜的蛋白质含量为14.5-22.8％，氨基酸组成均衡，脂肪含量较低，为0.4-0.8％。同时，龙须菜维生素和矿质元素含量丰富，特别是Mg、Fe、Ca、K、Na、Zn等元素。因此，龙须菜是一种高膳食纤维、高蛋白质、低脂肪的富含维生素和矿物质的海藻饲料原料，充分利用这些优势，可以将它进一步开发利用。然而，龙须菜中过高的琼胶多糖和粗纤维会降低其在动物胃肠内的消化吸收，降低其营养价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高龙须菜品质的发酵方法，利用黄杆菌的特性，低温发酵，快速降低龙须菜中胶多糖和粗纤维含量，提高龙须菜中动物可消化吸收利用的寡糖含量和蛋白质含量，分解原料部分有害物质，降低其毒性，提高龙须菜作为饲料原料的营养价值和利用价值。
为了实现上述的目的，采用如下的技术方案。一种提高龙须菜品质的发酵方法，所述方法包括以下步骤：
1龙须菜原料的制备
①龙须菜采集：龙须菜采集后，清洗，去除杂质，晒干；
②龙须菜粉制备：将晒干的龙须菜放入干燥箱烘干，水分含量控制在10～15％，然后用粉碎机粉碎至40～100目，备用。
2发酵菌种的选择
本发明优选菌种为海洋琼胶酶高产菌——黄杆菌(Flavobacterium sp.)，该菌种由汕头大学理学院生物系所筛选,于2008年1月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为：CGMCC NO.2342。专利CN101608166A公开了该菌种的分离筛选和鉴定方法。
2.1菌种活化培养基
种子培养基(2216E培养基)组成：蛋白胨5g，酵母粉1g，磷酸铁0.01g，陈海水1000ml，调节pH为7.2～7.6，121℃灭菌20min；
摇瓶培养基：2216E培养基添加0.2％的琼脂粉；
固体培养基：2216E培养基添加1.5％的琼脂粉；
发酵培养基：龙须菜含量3％，NaCl含量2％，蒸馏水配制，pH7.6，121℃灭菌20min备用。
2.2培养方法
S1摇瓶发酵培养：将-80℃保存的细菌按2％的接种量接入2216E培养基中，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min培养58小时，在600nm波长下，用分光光度计测定OD值，每6小时测定一次并记录，测定结果见表1，从表1可看出菌液在40小时浓度最高；
S2菌种活化：将-80℃保存的细菌划线接于固体培养基平板活化，然后再转接于100ml摇瓶培养基中于25℃继续活化培养40h，得到菌液；
S3甘油保种：将培养好的菌液和50％的甘油溶液按1:1的比例混匀分装在菌种瓶中，保存于-80℃备用。
表1不同培养时间菌液的浓度变化
3单因素试验优化发酵条件
对龙须菜添加量、菌种接种量、NaCl添加量、龙须菜粉碎颗粒大小、发酵时间等5个因素依次进行单因素试验优化，根据发酵后龙须菜发酵液中的粗蛋白质、寡糖含量及粗纤维素含量，筛选出最佳的发酵条件。每一次发酵结束后，取部分发酵样品65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质，寡糖和粗纤维素含量。
3.1龙须菜添加量的优化
将培养活化的菌液,按5％(v/v)的接种量接入含2％(w/v)NaCl的龙须菜培养基中，设置5个不同梯度的龙须菜添加量(w/v)，分别为1％、2％、3％、4％、5％，每个处理3个重复。pH7.6，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min转速下培养30小时后，测定结果见表2。
表2不同龙须菜添加量发酵产物变化
注：同列数据中，无相同小写字母标注者表示相互间差异显著(P<0.05)。
由表2可知，粗蛋白含量随着龙须菜添加量的增加而逐渐升高，3％时含量最高，为16.43％，随后又降低；寡糖含量随着龙须菜添加量的增加不断升高，3％时含量最高，为2.07％，随后又降低；粗纤维素含量随着龙须菜添加量的增加而逐渐降低，3％时含量最低，为3.75％，随后又升高。因此，选择龙须菜添加量为3％较好。
3.2龙须菜粉碎颗粒大小优化
将培养活化的菌液,按5％(v/v)的接种量接种于含3％(w/v)龙须菜，2％(w/v)NaCl的发酵培养基中，设置4个不同比例的龙须菜粉碎颗粒，分别为40、60、80、100目，每个处理3个重复。pH7.6，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min转速下培养30小时后，测定结果见表3。
表3不同龙须菜颗粒大小的发酵产物变化
注：同列数据中，无相同小写字母标注者表示相互间差异显著(P<0.05)。
由表3可知，粗蛋白和寡糖含量在龙须菜粉碎颗粒过40目时最高，为16.38％和1.88％，随着龙须菜粉碎颗粒越细，粗蛋白和寡糖含量均降低；粗纤维素含量在龙须菜粉碎颗粒过40目时最低，为3.88％，随着龙须菜粉碎颗粒越细，粗纤维素含量升高。因此，龙须菜粉碎颗粒过40目较好。
3.3发酵培养基NaCl添加量的优化
本方法采用在蒸馏水中添加不同含量的NaCl方法来替代陈海水，从而优化培养基。设置4个不同比例的NaCl添加量(w/v)，分别为1％、2％、3％、4％，将培养活化的菌液,按5％(v/v)的接种量转接于含3％(w/v)龙须菜发酵培养基中，每个处理3个重复。pH7.6，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min转速下培养30小时后，测定结果见表4。
表4添加不同NaCl含量的发酵产物变化
注：同列数据中，无相同小写字母标注者表示相互间差异显著(P<0.05)。
由表4可知，粗蛋白含量随着发酵培养基NaCl添加量的增加而逐渐升高，3％时含量最高，为16.50％，随后又降低；寡糖含量随着发酵培养基NaCl添加量的增加不断升高，3％时含量最高，为1.97％，随后又降低；粗纤维素含量随着发酵培养基NaCl添加量的增加而逐渐降低，3％时含量最低，为3.77％，随后又升高。因此，选择发酵培养基中添加3％的NaCl较好。
3.4发酵菌液接种量的优化
将培养活化的菌液,设置5个不同比例的菌液接种量(v/v)，分别为1％、2％、5％、10％、15％，分别接种于含3％(w/v)龙须菜，3％(w/v)NaCl的发酵培养基中，每个处理3个重复。pH7.6，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min转速下培养30小时后，测定结果见表5。
表5接种不同含量菌液的发酵产物变化
注：同行数据中，无相同小写字母标注者表示相互间差异显著(P<0.05)。
由表5可知，粗蛋白含量随着发酵菌液接种量的增加而逐渐升高，10％时含量最高，为16.86％，随后又降低；寡糖含量随着发酵细菌接种量的增加不断升高，10％时含量最高，为2.13％，随后又降低；粗纤维素含量随着发酵细菌接种量的增加而逐渐降低，10％时含量最低，为3.88％，随后又升高。因此，发酵细菌接种量选择在10％较好。
3.5发酵时间的优化
将培养活化的菌液,按10％(v/v)的接种量接入含3％(w/v)龙须菜，3％(w/v)NaCl的发酵培养基中，设置9个发酵时间点，分别为12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h，每个处理3个重复。pH7.6，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min转速下培养，隔一段时间取样检测，测定结果见表6。
表6不同发酵时间的产物变化
注：同列数据中，无相同小写字母标注者表示相互间差异显著(P<0.05)
由表6可知，粗蛋白含量随着发酵时间的延长而逐渐升高，72h含量最高，为16.50％，随后又降低；寡糖含量随着发酵时间的延长不断升高，72h含量最高，为2.97％，随后又降低；粗纤维素含量随着发酵时间的延长而逐渐降低，72h含量最低，为3.81％，随后又升高。因此，发酵时间选择在72小时较好。
4正交试验优化发酵条件
在单因素试验的基础上，选择龙须菜添加量(A)，菌液接种量(B)，NaCl浓度(C)，龙须菜颗粒大小(D)四个因素进行4因素3水平的正交设计，进一步优化发酵条件，每组3个重复。正交试验因素水平表见表7。发酵温度25℃，pH7.6，恒温摇床培养箱转速150r/min发酵72小时。发酵结束后，取部分鲜样65℃烘干，用于测定寡糖含量。
表7正交试验设计的因素和水平
表8正交试验寡糖产量极差分析表
表9寡糖产量方差分析表
由极差分析(表8)寡糖含量R值可知，影响试验结果因素的先后顺序为：A>C>B>D，即影响龙须菜发酵产寡糖的因素依次为：龙须菜添加量、NaCl添加浓度、菌液接种量、龙须菜颗粒大小。
根据寡糖含量的K值可得最佳组合是A3B3C2D1，即发酵龙须菜含量3％，NaCl浓度2％，菌液接种量10％，龙须菜颗粒大小40目。发酵温度25℃，pH7.6，恒温摇床培养箱转速150r/min，发酵时间72小时。龙须菜发酵条件优化后，寡糖含量达到2.42％，而优化前寡糖含量为0.81％，寡糖含量提高了1.99倍。
由方差分析(表9)的F值可以看出，影响试验结果因素的先后顺序为：A>C>B>D，即影响龙须菜发酵产寡糖的因素依次为：龙须菜添加量、NaCl浓度、菌液接种量、龙须菜颗粒大小,且四个因素对龙须菜发酵产寡糖的影响都显著。
结合单因素试验得到龙须菜发酵的最佳条件，发酵龙须菜含量3％，NaCl浓度2％，发酵菌种接种量10％，龙须菜颗粒大小40目。发酵温度25℃，发酵时间72小时，发酵液pH7.6，发酵罐转速150r/min。
5确定最优发酵条件
结合单因素实验设计及正交试验设计确定龙须菜发酵的最优条件：发酵龙须菜含量3％，NaCl浓度3％，发酵菌种接种量10％，龙须菜颗粒大小40目，发酵温度25℃，发酵时间72小时，发酵液pH7.6，恒温摇床培养箱150r/min。以此条件，在5L发酵罐中发酵龙须菜，设3个重复。发酵结束后，发酵产物65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定干物质、粗灰分、粗纤维、粗脂肪、粗蛋白、寡糖含量，测定结果见表10。
表10饲料原料发酵龙须菜、龙须菜的营养成分
由表10可知，以最优条件发酵后，与对照组相比，在干物质基础上，粗灰分由30.4％提高到34.3％，粗蛋白质由15.22％提高到16.42％，粗脂肪由0.57％降低到0.47％，寡糖由0.83％提高到1.90％，粗纤维由6.32％降低到3.87％。
综上所述，本发明利用海洋琼胶酶高产菌——黄杆菌(Flavobacterium sp.)发酵技术改善龙须菜品质，发酵方法包括以下步骤：
S1将龙须菜洗净烘干，粉碎至小颗粒；
S2制作发酵培养基，龙须菜颗粒加入蒸馏水，用NaCl调节盐度，NaCl用量为1-4％(w/v)，混合均匀，调节pH值7.2-7.6；
S3高压灭菌，冷却后接种发酵菌液1-15％(v/v)；
S4发酵，设置温度25℃，发酵罐转速150r/min，发酵时间12-48小时。
其中，S3中的发酵菌液由以下方法制得：黄杆菌接种于2216E固体培养基平板活化，然后再转接于100ml摇瓶培养基中，pH7.6，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min转速下活化培养40小时，得到菌液。
作为优选，步骤S1中，所述龙须菜烘干后，水分含量控制在10～15％，粉碎颗粒大小为40目。
作为优选，步骤S1中，所述发酵培养基中龙须菜的添加量为3％(w/v)。
作为优选，步骤S2中，所述发酵培养基中NaCl添加量为2％(w/v)。
作为优选，步骤S2中，所述发酵培养基初始pH值为7.6。
按照上述发酵方法制得的龙须菜发酵产物，比未经发酵的龙须菜中的营养成分更理想，更适合作为经济鱼类的饲养饲料，经过发酵，龙须菜中琼胶多糖和粗纤维含量降低了，增加动物可消化吸收利用的寡糖和蛋白质含量，同时经过发酵后提高发酵产物中蛋白质含量，此外通过微生物发酵可以分解原料中部分有害物质，降低其毒性。
与现有技术相比，本发明采用单一菌种发酵处理龙须菜，选用的黄杆菌发酵可以生产琼胶酶，能够有效快速增加龙须菜中寡糖的含量，提高其作为经济鱼类饲料的营养价值，而且该菌种不需要琼脂，只需要有NaCl，来源非常简单，龙须菜发酵产物作为饲料既能提高营养价值又不会污染环境，该发酵方法温度较低，速度快，步骤简单，可操作性较强，容易放大实现工厂化生产，对龙须菜作为动物饲料的进一步开发和应用有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的描述。
本实施以优选参数为发酵条件，具体发酵方法包括以下几个步骤：
S1将龙须菜洗净晒干，放入烘干箱烘干至水分含量10-15％，然后用粉碎机至颗粒大小40目；
S2制作发酵培养基，按照龙须菜3％(w/v)加入蒸馏水，用NaCl调节盐度，NaCl用量为2％(w/v)，混合均匀，调节pH值7.6；
S3将黄杆菌接种于2216E固体培养基平板活化，然后再转接于100ml摇瓶培养基中，pH7.6，25℃，恒温摇床培养箱中150r/min转速下活化培养40小时，得到菌液；
S4高压灭菌，121℃20分钟，冷却后接种发酵菌液10％(v/v)；
S5发酵，设置温度25℃，发酵罐转速150r/min，发酵时间72小时。
设3个重复，在5L发酵罐中发酵龙须菜，发酵结束后，发酵产物65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定干物质、粗灰分、粗纤维、粗脂肪、粗蛋白、寡糖含量，以最优条件发酵后，与对照组相比，在干物质基础上，粗灰分由30.4％提高到34.3％，粗蛋白质由15.22％提高到16.42％，粗脂肪由0.57％降低到0.47％，寡糖由0.83％提高到1.90％，粗纤维由6.32％降低到3.87％。