本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种富含SOD的刺梨酵素的制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶，SOD，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。
刺梨是云贵高原特有的野生资源，以贵州为主产地。刺梨属于蔷薇属的野生灌木植物，刺梨果实为球形浆果，成熟时为黄棕色，是集药用、保健、食用、观赏为一体的绿色水果，具有独特的芳香味，营养丰富，尤其是Vc、Vp和SOD含量高，有“三王水果”之美誉。近年刺梨果汁、刺梨果脯等初加工产品日益丰富，关于诸如SOD的刺梨精深加工的产品，则是市场趋势。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种富含SOD的刺梨酵素的制备方法，所制得的刺梨酵素丰富了刺梨精深加工产品系列，特别是富含SOD的刺梨精深加工产品。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种富含SOD的刺梨酵素的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，原料预处理：将刺梨果洗净后加至Vc-Na和K2S2O5的混合液中打浆，在所得浆液中加入纤维素酶和果胶酶的混合酶液进行酶解，得到酶解果浆；
步骤2，菌种扩培：将椭圆酿酒酵母菌种活化后进行扩培，得到扩培液；
步骤3，原液发酵：在步骤1所得酶解果浆中加入FeCl3，再接种步骤2所得扩培液，25℃发酵24h，然后加入ZnCl2，继续在25℃发酵12h，得到发酵液；
步骤4，发酵液处理，将步骤3所得发酵液依次通过不锈钢滤网和硅藻土过滤器，得到所述富含SOD的刺梨酵素。
进一步地，步骤1中是将80-150kg刺梨果加至100LVc-Na和K2S2O5的混合液打浆，再加入500mL纤维素酶和果胶酶的混合酶液。
进一步地，所述Vc-Na和K2S2O5的混合液中Vc-Na的浓度为50-200g/100L、K2S2O5的浓度为10-100g/100L；所述纤维素酶和果胶酶的混合酶液中纤维素酶的浓度为10-30g/500mL、果胶酶的浓度为5-20g/500mL。
进一步地，步骤1中酶解条件为30-50℃，静置酶解1-5h。
进一步地，步骤2中扩培是将活化后的椭圆酿酒酵母菌种先用5-20°麦芽原汁1L、在20-35℃下扩培至1.0×106个-2.5×107个细胞/mL，再全部接种至10°的麦芽原汁20L、在20-35℃条件下扩培至1.0×106个-2.5×107个细胞/mL。
进一步地，步骤3中FeCl3是以水溶液的形式加入的，加入量为1L，FeCl3的浓度为1-10g/1L。
进一步地，步骤3中扩培液和酶解果浆的用量比为20L：100-500L。
进一步地，ZnCl2是以水溶液的形式加入的，加入量为1L，ZnCl2的浓度为1-8g/1L。
进一步地，所述不锈钢滤网为40-200目的不锈钢滤网。
本发明的显著优点在于：
1、选用刺梨原料绿色天然，本身具有极高的营养价值；
2、加工条件温和，能够最大限度保留原料本身的营养价值；
3、通过发酵条件控制，显著提高刺梨酵素当中SOD酶活，加强营养价值。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
本发明所述的椭圆酿酒酵母菌种通过以下步骤分离得到：
1、首先在贵州六盘水市盘县的刺梨种植基地选取1颗成熟非常高的刺梨果实，在研钵中磨细，取样1g放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。激烈震荡约10min,使菌体分散并悬浮与液体中。用无菌吸管吸取1ml刺梨果悬液注入盛有9ml生理盐水的试管中，吸取三次并混匀。再去一只无菌吸取管，从此试管中吸取1ml，注入另一盛有9ml生理盐水的试管中，取三次并混匀。同法类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的各种稀释度的刺梨果悬液。
2、取新鲜麦芽汁200mL在65℃水浴中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。加水约400mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。将糖化液用4—6层纱布过滤。将滤液稀释到10波美度，pH约6.4，加入2％琼脂即成。121℃灭菌30min。培养皿采用干热灭菌(蒸汽灭菌锅)。已过滤灭菌的培养基进行分装。分装完毕后，用棉塞堵住管口。塞好棉塞的试管和锥形瓶盖上厚纸用绳捆札，然后灭菌。培养基灭菌后，趁培养基未凝固时进行制作斜面培养基和平板培养基。
3、将麦芽汁琼脂培养基加热熔化，冷却至55-60℃。加入抗生素1ml并混匀。在超净工作台的酒精灯火焰旁倒制平板。将上述培养基的5个培养基的四个平板分别标上10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五种稀释度。取5只无菌吸管，分别从四种刺梨果悬液的稀释液中各取0.1ml。对号放于已标记好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻涂布均匀。再重复此步骤。
4、将培养基平板倒置，与30-32℃温箱中培养2天。观察培养后长出的酵母菌的单个菌落，分别挑取并接种于斜面培养基上，再培养。待菌苔长好后，检查是否有杂菌，若有则需再一次进行分离纯化，直到获得纯菌株培养物。
实施例1
步骤1，采摘100kg纯天然、无污染、无腐败的刺梨果作为原料，采用SSTQXJ061型洗果机将刺梨果实清洗干净，将100g的Vc-Na和25g偏重亚硫酸钾溶于100L饮用水，采用MKK-XM-307型多功能水果蔬菜破碎机将果实打碎成原果浆(约200L)。
将16g纤维素酶和10g果胶酶分别溶于500mL饮用水，再将纤维素酶溶液和果胶酶溶液与原果浆混合均匀，加热至40℃，静置酶解2h。
步骤2，菌种扩培
将刺梨果园中提取分离的椭圆酿酒酵母菌种活化，用10°麦芽原汁1L，在25℃条件下扩培至1.5×107个细胞/mL，再全部接种至20L浓度10°的麦芽原汁，在25℃条件下扩培至1.5×107个细胞/mL。
步骤3，原液发酵
将2.6g的FeCl3溶于1L饮用水，再将此FeCl3溶液与原果浆搅匀，再将上述20L扩培液全部接种至200L刺梨原果浆，在25℃条件下发酵24h。再将1g的ZnCl2溶于1L饮用水，再将此ZnCl2溶液与上述发酵液搅匀，在25℃条件下继续发酵12h。
步骤4，发酵液处理
将发酵液通过160目不锈钢滤网(自制)，得到初滤液；将初滤液通过WK-220型硅藻土过滤器，得到精滤液，即所述富含SOD的刺梨酵素。
本实施例所采用的对照样通过以下方法制备得到：
步骤1，采摘1kg纯天然、无污染、无腐败的刺梨果作为原料，清洗干净，将1g的Vc-Na和0.25g偏重亚硫酸钾溶于1L饮用水，用破碎机将果实打碎成原果浆。
将0.16g纤维素酶和0.1g果胶酶分别溶于5mL饮用水，再将纤维素酶溶液和果胶酶溶液与原果浆混合均匀，加热至40℃，静置酶解2h。
步骤2，加入10°麦芽原汁210mL，静置。
步骤3，将0.0026g的FeCl3溶于10mL饮用水，再将此FeCl3溶液与原果浆搅匀，再将上述210mL混合液全部加入至2L刺梨原果浆，在25℃条件下静置24h。再将0.001g的ZnCl2溶于10mL饮用水，再将此ZnCl2溶液与上述混合液搅匀，在25℃条件下继续置12h。
步骤4，混合液处理：将混合液通过160目不锈钢滤网(自制)，得到初滤液；将初滤液通过WK-220型硅藻土过滤器，得到精滤液。采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活，SOD酶活为1494U/L。
采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活，对照样当中SOD酶活为1494U/L，精滤液当中SOD酶活为4663U/L，精滤液当中的SOD酶活显著高于对照样。
实施例2
步骤1，采摘120kg纯天然、无污染、无腐败的刺梨果作为原料，采用SSTQXJ061型洗果机将刺梨果实清洗干净，将115g的Vc-Na和28g偏重亚硫酸钾溶于125L饮用水，采用MKK-XM-307型多功能水果蔬菜破碎机将果实打碎成原果浆(约245L)。
将20g纤维素酶和15g果胶酶分别溶于500mL饮用水，再将纤维素酶溶液和果胶酶溶液与原果浆混合均匀，加热至35℃，静置酶解4h。
步骤2，菌种扩培
将刺梨果园中提取分离的椭圆酿酒酵母菌种活化，用12°麦芽原汁1L，在23℃条件下扩培至2×107个细胞/mL，再全部接种至20L浓度12°的麦芽原汁，在23℃条件下扩培至2×107个细胞/mL。
步骤3，原液发酵
将3g的FeCl3溶于1L饮用水，再将此FeCl3溶液与原果浆搅匀，再将上述20L扩培液全部接种至200L刺梨原果浆，在23℃条件下发酵30h。再将1g的ZnCl2溶于1L饮用水，再将此ZnCl2溶液与上述发酵液搅匀，在23℃条件下继续发酵15h。
步骤4，发酵液处理
将发酵液通过160目不锈钢滤网(自制)，得到初滤液；将初滤液通过WK-220型硅藻土过滤器，得到精滤液，即所述富含SOD的刺梨酵素。
采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活，对照样当中SOD酶活为1615U/L，精滤液当中SOD酶活为4726U/L，精滤液当中的SOD酶活显著高于对照样。
实施例3
步骤1，采摘200kg纯天然、无污染、无腐败的刺梨果作为原料，采用SSTQXJ061型洗果机将刺梨果实清洗干净，将210g的Vc-Na和60g偏重亚硫酸钾溶于200L饮用水，采用MKK-XM-307型多功能水果蔬菜破碎机将果实打碎成原果浆(约400L)。
将40g纤维素酶和25g果胶酶分别溶于500mL饮用水，再将纤维素酶溶液和果胶酶溶液与原果浆混合均匀，加热至45℃，静置酶解2h。
步骤2，菌种扩培
将刺梨果园中提取分离的椭圆酿酒酵母菌种活化，用10°麦芽原汁2L，在25℃条件下扩培至3×107个细胞/mL，再全部接种至30L浓度10°的麦芽原汁，在25℃条件下扩培至3×107个细胞/mL。
步骤3，原液发酵
将6g的FeCl3溶于1L饮用水，再将此FeCl3溶液与原果浆搅匀，再将上述30L扩培液全部接种至400L刺梨原果浆，在25℃条件下发酵24h。再将3g的ZnCl2溶于1L饮用水，再将此ZnCl2溶液与上述发酵液搅匀，在25℃条件下继续发酵12h。
步骤4，发酵液处理
将发酵液通过160目不锈钢滤网(自制)，得到初滤液；将初滤液通过WK-220型硅藻土过滤器，得到精滤液，即所述富含SOD的刺梨酵素。
采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活，对照样当中SOD酶活为1556U/L，精滤液当中SOD酶活为4803U/L，精滤液当中的SOD酶活显著高于对照样。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。