一种超声波辅助植物乳杆菌发酵苹果汁同时促进苹果酸乳酸转化和多酚衍化的方法与流程

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种超声波处理辅助植物乳杆菌发酵苹果汁同时促进苹果酸乳酸转化和多酚衍化的方法。

技术背景

苹果富含有机酸、膳食纤维、维生素和多酚等多种营养成分。食用苹果可以抑制心血管疾病、糖尿病等慢性疾病。中国目前是国际上最大的苹果产量国和消费国，年产量达4300万吨。但在我国苹果产业中，64％的苹果用于鲜果，25％用于浓缩汁加工，其他制品仅占10％，苹果深加工方式匮乏。近年来益生菌发酵果蔬汁受到广泛的关注。而益生菌，尤其是植物乳杆菌，因其在调节肠道菌群、提高机体免疫、缓解胃肠道疾病、改善身体健康等方面的突出作用，备受消费者的青睐。因此，富含植物乳杆菌的发酵苹果汁具有较好的生产前景和广大的消费市场。研究发现植物乳杆菌发酵过程中存在苹果酸乳酸转化，即乳酸菌以双羧基的l-苹果酸为底物，在苹果酸乳酸酶催化作用下转变为单羧基l-乳酸和co2的过程，这一转化过程使植物乳杆菌能够以有机酸作为主要碳源增殖，突破乳酸发酵的技术瓶颈，同时赋予果蔬汁愉快协调的发酵香；另外，涩味酚类物质的降解和咖啡酸等酚酸还原生成的风味衍生物也可改善苹果汁的风味和口感。同时乳酸发酵过程中多酚衍化可通过脱羧、还原等反应生成抗氧化活性更强的物质，增强苹果汁的抗氧化活性，从而提升其营养价值。但是苹果汁酸度高、体系中缺少植物乳杆菌发酵所需的生长因子，因此在植物乳杆菌发酵苹果汁的生产中存在着微生物生长缓慢，无法快速形成优势菌群而易被杂菌污染，以及酚类物质转化率低等缺陷。

专利201811074098.x公开了一种富含活性植物乳杆菌的发酵苹果汁的制备方法，其通过在果汁中添加增殖因子和用于促进植物乳杆菌增殖的无机盐，使得植物乳杆菌能够在苹果汁中快速发酵。专利202010243654.2公开了一种提高苹果汁多酚生物利用度的方法，其采用鼠李糖杆菌，经过活化和一系列的驯化后发酵苹果汁，使苹果多酚转化为小分子易吸收的物质，从而提高多酚在体内的生物利用度。诚然，添加增殖因子可使植物乳杆菌在苹果汁中快速发酵，且活菌数达到10⁹cfu/ml，但是专利202010243654.2所述方法中，前期菌种驯化的过程一般会消耗7天左右，这将不利于工业化高效生产。因此需要开发更为简便高效的技术增强苹果汁在乳酸发酵中的多酚转化，提高多酚的生物利用度，同时可在已有技术基础上进一步加快微生物生长和苹果酸乳酸转化。

相关研究表明，适度的超声波刺激能改变细胞膜的通透性，增强物质运输。超声处理不仅可以促进微生物生长和增殖、增强代谢反应活性，提高发酵产物得率，此外还能促进生物活性物质的转化，提高发酵液的生物活性。因此可将超声波应用到功能性发酵制品的开发中。专利cn103865714公开了一种低强度间歇式超声波辅助酿造黄酒的方法，其利用低强度间歇式超声波对黄酒酿造过程进行辅助处理，通过调节超声波频率、功率、工作时间和间歇时间等对黄酒发酵过程进行调控，结果使黄酒发酵时间大大缩短，而且超声辅助酿造的黄酒与无超声发酵黄酒的各项指标基本达到一致。专利201610208464.0公开了在乳酸菌发酵过程中，利用超声作为辅助手段使乳酸菌生物量增加12～55％，产酸量提高15～60％。但是现有专利均未体现不同生长时期超声处理对微生物生长及相关代谢的影响，而且迄今为止，超声波处理增强乳酸菌发酵果蔬汁过程中多酚衍化和苹果酸乳酸转化的文章和专利鲜见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种超声波辅助植物乳杆菌发酵苹果汁促进苹果酸乳酸转化和多酚衍化的方法。本发明可在添加增殖因子的基础上，进一步提高植物乳杆菌在发酵过程中的增殖速率，而且促进苹果酸乳酸转化和多酚衍化，提高发酵苹果汁的抗氧化活性；同时，明确只在微生物生长的延滞期和对数期超声处理能达到这些有益效果，而稳定期超声处理不能。该方法具有工艺简单，技术先进、安全性高、生产成本低和适合工业化生产等特点。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种超声波处理辅助植物乳杆菌发酵苹果汁同时促进苹果酸乳酸转化和多酚衍化的方法，以植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)为出发菌种，具体步骤如下：

(1)制备种子培养基和苹果汁；

(2)将植物乳杆菌接种于种子培养基活化菌种；

(3)将活化后的菌种接种到苹果汁中，测定其生长曲线；

(4)将活化后的菌种接种到苹果汁中，超声波处理，再将处理后的苹果汁继续培养得到发酵苹果汁产品。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)种子培养基的主要成分为mrs肉汤，配制方法为：称取市售mrs肉汤49.3g，溶解于1l水中，121℃高压灭菌20min。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)苹果汁的制备方法如下：挑选性状优良、果实成熟的红富士苹果为原料，洗净晾干，去除果皮和果芯，切分，用打浆机将苹果块破碎，破碎的同时加入质量分数为0.1-0.5％的d-异抗坏血酸钠和10％的纯净水，将所得的苹果浆液用纱布过滤去除沉淀，然后再将苹果汁在离心取上清液得到苹果汁，调节ph至6.0，加入0.1～0.8％的酵母浸粉后，灭菌，备用。

优选的，所述纱布目数为120目。

优选的，所述离心条件为：4000r/min下离心20min。

优选的，所述灭菌条件为：85℃灭菌20min。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(3)生长曲线的测定方法为：挑取植物乳杆菌接种于50ml无菌mrs肉汤中，37℃培养24h；将上述培养好的菌液按照2％的接种量接入到苹果汁中，采用控温细菌生长测定仪控制温度为30℃，在600nm下定时测定苹果汁的吸光值；以吸光值为y轴，培养时间为x轴，绘制生长曲线。

作为本申请的优选技术方案，所述所述步骤(3)和步骤(4)活化后的菌种接种到苹果汁的步骤和条件为：将种子液以2％的接种量接种到苹果汁中，初始菌数约为7.0logcfu/ml，于30℃下发酵。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(4)超声波的处理方法和条件为：根据生长曲线的测定结果，在苹果汁中植物乳杆菌生长的停滞期(发酵后0～4h)或对数期(发酵后4～12h)进行超声波处理，超声功率密度为10～100w/l，超声频率为20～30khz，超声时间为10～60min，超声脉冲发声条件为超声5-20s间歇5-20s。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(4)苹果汁继续培养的方法和条件为：将超声波处理后的样品放置在30℃培养箱中再静置培养24h。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)进一步促进植物乳杆菌发酵苹果汁过程中菌体增殖和苹果酸乳酸转化。超声使苹果汁中活菌数量在发酵过程中比无超声组提高30-200％，乳酸含量在发酵过程中比无超声组提高5-70％，苹果酸含量在发酵过程中比无超声组降低5-40％。植物乳杆菌数量和乳酸含量快速增长使优势菌群和酸性发酵环境快速形成，减小杂菌污染风险。

(2)直接通过低强度超声波处理增强苹果汁发酵过程中多酚衍化，使发酵过程中苹果汁的抗氧化活性比无超声组提高5-30％，省去菌种驯化过程，大大缩短生产周期，有利于工业化高效生产。

(3)本发明明确只在微生物生长的延滞期和对数期超声处理能达到这些有益效果，而稳定期超声处理不能。

(4)该方法具有工艺简单，技术先进、安全性高、生产成本低和适合工业化生产等特点。

附图说明

图1a，b，c分别为实施例1与对比例1，实施例2与对比例1，对比例2与对比例1发酵过程中活菌数量比较；

图2，3，4分别为实施例2与对比例1，实施例1与对比例1，对比例2与对比例1发酵过程中体外抗氧化活性比较。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

本发明具体实施例内所用植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)为lactobacillusplantarumbncc337796冻干粉，购于北京北纳生物保藏中心。

实施例1

(1)制备种子培养基和苹果汁：

称取市售mrs肉汤49.3g，溶解于1l水中，121℃高压灭菌20min，冷却后作为种子培养基；

挑选性状优良、果实成熟的红富士苹果为原料，洗净晾干，去除果皮和果芯，切分，用打浆机将苹果块破碎，破碎的同时加入质量分数为0.15％的d-异抗坏血酸钠和10％的纯净水，将所得的苹果浆液用120目纱布过滤去除果渣，然后再将苹果汁在4000r/min下离心20min取上清液得到苹果汁，调节ph至6.0，加入0.3％的酵母浸粉后85℃灭菌20min，备用。

(2)将植物乳杆菌接种于种子培养基活化菌种：

挑取植物乳杆菌接种于50ml无菌mrs肉汤中，37℃培养24h。

(3)将活化后的菌种接种到苹果汁中，测定其生长曲线：

将上述培养好的菌液按照2％的接种量接入到苹果汁中，采用控温细菌生长测定仪控制温度为30℃，在600nm下定时测定苹果汁的吸光值。以吸光值为y轴，培养时间为x轴，绘制生长曲线。

(4)超声辅助发酵苹果汁：

将活化后的菌种按照2％接种量接种到苹果汁中，苹果汁发酵初始菌落数约7.0logcfu/ml，于30℃下发酵。在植物乳杆菌发酵0h后(延滞期)进行超声波处理，超声功率密度为93.6w/l，超声频率为20khz，超声时间为30min，超声脉冲发声条件为超声5s间歇5s。超声结束后将样品放置在30℃培养箱中再静置培养24h。

实施例2

(1)制备种子培养基和苹果汁：

称取市售mrs肉汤49.3g，溶解于1l水中，121℃高压灭菌20min，冷却后作为种子培养基；

挑选性状优良、果实成熟的红富士苹果为原料，洗净晾干，去除果皮和果芯，切分，用打浆机将苹果块破碎，破碎的同时加入质量分数为0.15％的d-异抗坏血酸钠和10％的纯净水，将所得的苹果浆液用120目纱布过滤去除果渣，然后再将苹果汁在4000r/min下离心20min取上清液得到苹果汁，调节ph至6.0，加入0.3％的酵母浸粉后85℃灭菌20min，备用。

(2)将植物乳杆菌接种于种子培养基活化菌种：

挑取植物乳杆菌接种于50ml无菌mrs肉汤中，37℃培养24h。

(3)将活化后的菌种接种到苹果汁中，测定其生长曲线：

将上述培养好的菌液按照2％的接种量接入到苹果汁中，采用控温细菌生长测定仪控制温度为30℃，在600nm下定时测定苹果汁的吸光值。以吸光值为y轴，培养时间为x轴，绘制生长曲线。

(4)超声辅助发酵苹果汁：

将活化后的菌种按照2％接种量接种到苹果汁中，苹果汁发酵初始菌落数约7.0logcfu/ml，于30℃下发酵。在植物乳杆菌发酵8h后(对数期)进行超声波处理，超声功率密度为93.6w/l，超声频率为20khz，超声时间为30min，超声脉冲发声条件为超声5s间歇5s。超声结束后将样品放置在30℃培养箱中再静置培养24h。

对比例1

除不进行超声波处理外，其他条件均与实施例1和2相同的发酵。

对比例2

除在苹果汁发酵18h后(稳定期)超声外，其他条件均与实施例1和2相同。

实施例3

(1)制备种子培养基和苹果汁：

称取市售mrs肉汤49.3g，溶解于1l水中，121℃高压灭菌20min，冷却后作为种子培养基；

挑选性状优良、果实成熟的红富士苹果为原料，洗净晾干，去除果皮和果芯，切分，用打浆机将苹果块破碎，破碎的同时加入质量分数为0.1％的d-异抗坏血酸钠和10％的纯净水，将所得的苹果浆液用120目纱布过滤去除果渣，然后再将苹果汁在4000r/min下离心20min取上清液得到苹果汁，调节ph至6.0，加入0.8％的酵母浸粉后85℃灭菌20min，备用。

(2)将植物乳杆菌接种于种子培养基活化菌种：

挑取植物乳杆菌接种于50ml无菌mrs肉汤中，37℃培养24h。

(3)将活化后的菌种接种到苹果汁中，测定其生长曲线：

将上述培养好的菌液按照2％的接种量接入到苹果汁中，采用控温细菌生长测定仪控制温度为30℃，在600nm下定时测定苹果汁的吸光值。以吸光值为y轴，培养时间为x轴，绘制生长曲线。

(4)超声辅助发酵苹果汁：

将活化后的菌种按照2％接种量接种到苹果汁中，苹果汁发酵初始菌落数约7.0logcfu/ml，于30℃下发酵。在植物乳杆菌发酵6h后(对数期)进行超声波处理，超声功率密度为100w/l，超声频率为20khz，超声时间为10min，超声脉冲发声条件为超声5s间歇20s。超声结束后将样品放置在30℃培养箱中再静置培养24h。

实施例4

(1)制备种子培养基和苹果汁：

称取市售mrs肉汤49.3g，溶解于1l水中，121℃高压灭菌20min，冷却后作为种子培养基；

挑选性状优良、果实成熟的红富士苹果为原料，洗净晾干，去除果皮和果芯，切分，用打浆机将苹果块破碎，破碎的同时加入质量分数为0.5％的d-异抗坏血酸钠和10％的纯净水，将所得的苹果浆液用120目纱布过滤去除果渣，然后再将苹果汁在4000r/min下离心20min取上清液得到苹果汁，调节ph至6.0，加入0.1％的酵母浸粉后85℃灭菌20min，备用。

(2)将植物乳杆菌接种于种子培养基活化菌种：

挑取植物乳杆菌接种于50ml无菌mrs肉汤中，37℃培养24h。

(3)将活化后的菌种接种到苹果汁中，测定其生长曲线：

将上述培养好的菌液按照2％的接种量接入到苹果汁中，采用控温细菌生长测定仪控制温度为30℃，在600nm下定时测定苹果汁的吸光值。以吸光值为y轴，培养时间为x轴，绘制生长曲线。

(4)超声辅助发酵苹果汁：

将活化后的菌种按照2％接种量接种到苹果汁中，苹果汁发酵初始菌落数约7.0logcfu/ml，于30℃下发酵。在植物乳杆菌发酵2h后(延滞期)进行超声波处理，超声功率密度为10w/l，超声频率为30khz，超声时间为60min，超声脉冲发声条件为超声20s间歇5s。超声结束后将样品放置在30℃培养箱中再静置培养24h。

不同生长时期超声对苹果汁发酵过程中微生物生长的影响

由图1a可知，延滞期超声处理可缩短植物乳杆菌在苹果汁中发酵的延滞期，在刚经过0.5h的超声处理后，超声发酵苹果汁中活菌数比无超声发酵苹果汁高0.51logcfu/ml。图1b显示对数期超声可加快微生物生速率，使微生物提前进入稳定期。在刚经过0.5h的超声处理后，超声发酵苹果汁中活菌数比无超声发酵样品中高0.31logcfu/ml。而如图1c所示稳定期超声对微生物生长无明显影响。不同生长时期超声对苹果汁发酵过程中微生物生长的影响不同，一方面是因为处于不同生长时期的微生物生理状态不同，对超声刺激的敏感性不同，另一方面是因为在不同生长时期微生物所处发酵环境有较大差异。延滞期和对数期超声均可促进植物乳杆菌生长，是因为在延滞期和对数期，苹果汁中营养物质丰富，乳酸含量低，ph值较高，超声处理可对植物乳杆菌细胞膜进行修饰，形成可修复小孔，从而增强细胞膜通透性，有利于营养物质的传递和胞内ph调整，从而促进微生物生长。稳定期超声无显著影响则可能是因为，进入稳定期后，乳酸积累或营养物质缺乏从根本上限制植物乳杆菌生长。

对实施例2(对数期超声)和对比例1的苹果汁发酵过程中苹果酸、乳酸、酚类物质含量以及体外抗氧化活性进行检测，结果如下：

(1)超声辅助发酵和无超声发酵苹果汁发酵过程中苹果酸和乳酸含量

表1实施例2与对比例1发酵过程中苹果酸和乳酸含量(mg/l)比较

注：大写字母不同表示不同发酵时间样品差异显著(p<0.05),小写字母不同表示不同处理样品差异显著(p<0.05)。实施例2中对数期超声指在发酵8h后超声。

由表1可知，在对数期超声处理刚结束，即发酵至8.5h时，超声发酵苹果汁中苹果酸含量比无超声发酵苹果汁低178.81mg/l，而乳酸含量比无超声苹果汁高233.14mg/l。说明超声促进苹果酸乳酸转化的发生，这可能是源于超声可以促进微生物的生长，增强细胞膜的通透性，加速细胞内外的传质。

(2)超声辅助发酵和无超声发酵苹果汁发酵过程中酚类物质含量

表2实施例2与对比例1发酵过程中酚类物质含量(mg/l)比较

注：大写字母不同表示不同发酵时间样品差异显著(p<0.05),小写字母不同表示不同处理样品差异显著(p<0.05)。实施例2中对数期超声指在发酵后8h超声。

乳酸发酵中绿原酸可降解转化为咖啡酸，咖啡酸又可在酚酸脱羧酶和还原酶的作用下转化为抗氧化活性更强的物质或风味衍生物。发酵早期可水解单宁和没食子酸酯等没食子酸衍生物水解使没食子酸和儿茶素含量增加，发酵后期没食子酸可脱羧生成抗氧化活性更强的焦棓酸。原花青素b2是表儿茶素的一种二聚体，其在人体胃肠道中不易被吸收，但是经乳酸菌分解成表儿茶素或直接转化为其他小分子物质后可在小肠部位被快速吸收。乳酸发酵中酚类物质的转化可以增强发酵苹果汁的抗氧化活性、改善风味，并且提高酚类物质的生物利用度。

由表2可知，在发酵过程中，超声发酵组绿原酸含量显著低于无超声发酵组，超声发酵组的咖啡酸含量在超声刚结束显著高于无超声发酵组，说明超声处理促进绿原酸向咖啡酸转化；超声发酵组的原花青素b2含量在超声刚结束时显著低于无超声发酵组，说明超声处理促进了原花青素b2的分解代谢；超声发酵组的没食子酸含量在发酵过程中显著低于无超声发酵组，说明超声处理也可增强没食子酸的脱羧转化。超声发酵组的儿茶素的含量在发酵过程中显著高于无超声发酵组，说明超声可能促进没食子酸酯类物质水解。

超声处理促进发酵苹果汁中多酚衍化可能是因为超声的空化作用通过修饰细胞膜结构，提高了微生物细胞膜通透性；超声提高了物质传递速率，从而加快多酚衍化相关反应速率；其次，超声可提高多酚衍化相关酶的活性；最后，超声刺激可以调节多酚衍化相关酶基因的表达。本课题组研究发现，发酵苹果汁中植物乳杆菌在对数期(发酵8h后)超声处理后，基因tanl，ubid和lp_2953表达上调，其中tanl是编码单宁酸酶，可以水解单宁生成没食子酸，ubid在没食子酸脱羧反应中有重要作用，只有在ubid表达的情况下，没食子酸可脱羧生成焦棓酸，lp_2953编码酯酶，其可能与绿原酸水解生成咖啡酸，没食子酸酯水解生成没食子酸和儿茶素有关。

(3)超声辅助发酵和无超声发酵苹果汁发酵过程中体外抗氧化活性

由图2可知，超声处理后，超声发酵组的abts阳离子自由基清除能力均显著高于无超声发酵组。在发酵结束时，超声发酵组的抗氧化活性比无超声发酵组高16.9％，说明超声处理可以增强发酵苹果汁的体外抗氧化活性。这可能是因为超声处理增强了乳酸发酵中多酚衍化，其通过水解、脱羧、氧化和还原等反应生成更多强抗氧化活性物质，从而增强发酵苹果汁的抗氧化活性。

对实施例1(延滞期超声)和对比例1的苹果汁发酵过程中乳酸含量、酚类物质含量以及体外抗氧化活性进行检测，结果如下：

(1)超声辅助发酵和无超声发酵苹果汁发酵过程中苹果酸和乳酸含量

表3实施例1与对比例1发酵过程中苹果酸和乳酸含量(mg/l)比较

注：大写字母不同表示不同发酵时间样品差异显著(p<0.05),小写字母不同表示不同处理样品差异显著(p<0.05)。实施例1中延滞期超声指在发酵0h后超声。

由表3可知，在延滞期超声处理后的发酵过程中，超声发酵组的乳酸含量显著高于无超声发酵组，超声发酵组的苹果酸含量显著低于无超声发酵组，说明延滞期超声处理也可以促进苹果酸乳酸转化。在超声处理6h后，即发酵6.5h时，93.6w/l超声苹果汁中乳酸含量比无超声苹果汁高298.2mg/l，而苹果酸含量比无超声苹果汁低110.36mg/l。

(2)超声辅助发酵和无超声发酵苹果汁发酵过程中酚类物质含量

表4实施例1与对比例1发酵过程中酚类物质含量(mg/l)比较

注：大写字母不同表示不同发酵时间样品差异显著(p<0.05),小写字母不同表示不同处理样品差异显著(p<0.05)。实施例1中延滞期超声指在发酵0h后超声。

由表4可知，延滞期超声处理后的发酵过程中，超声发酵组绿原酸含量显著低于无超声发酵组，超声发酵组的咖啡酸含量显著高于无超声发酵组，说明延滞期超声处理促进绿原酸向咖啡酸转化；超声发酵组的原花青素b2含量在超声刚结束时显著低于无超声发酵组，说明延滞期超声处理促进了原花青素b2的分解代谢；超声发酵组的没食子酸含量在发酵过程中显著低于无超声发酵组，说明延滞期超声处理也可增强没食子酸的脱羧转化。超声发酵组的儿茶素的含量在发酵过程中显著高于无超声发酵组，说明延滞期超声可能促进没食子酸酯类物质水解。(3)超声辅助发酵和无超声发酵苹果汁发酵过程中体外抗氧化活性

由图3可知，延滞期超声处理第6h及以后，超声发酵组的abts阳离子自由基清除能力均显著高于无超声发酵组，说明延滞期超声处理也可以增强发酵苹果汁的体外抗氧化活性。

对比例2(稳定期超声)和对比例1的苹果汁发酵过程中乳酸含量、酚类物质含量以及体外抗氧化活性比较，结果如下：

由表5、表6及图4可知，与延滞期和对数期超声处理相比，稳定期超声超声发酵组中乳酸、绿原酸、咖啡酸、原花青素b2、儿茶素、没食子酸含量及abts·⁺自由基清除能力与无超声发酵无显著差异,即稳定期超声对植物乳杆菌发酵苹果汁过程中乳酸合成，绿原酸、咖啡酸、原花青素b2、儿茶素和没食子酸等多酚衍化和苹果汁抗氧化活性影响较小。

表5对比例2与对比例1发酵过程中苹果酸和乳酸含量(mg/l)比较

注：大写字母不同表示不同发酵时间样品差异显著(p<0.05),小写字母不同表示不同处理样品差异显著(p<0.05)。对比例2中稳定期超声发酵指的是在发酵18h后。

表6实施例1与对比例1发酵过程中酚类物质含量(mg/l)比较

注：大写字母不同表示不同发酵时间样品差异显著(p<0.05),小写字母不同表示不同处理样品差异显著(p<0.05)。对比例2中稳定期超声发酵指的是在发酵18h后。

以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。