专利名称：生产棒酸及/或其盐类的方法
一种生产棒酸及/或其盐类的方法，是用带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)选出的菌株以严格控制发酵期间存在的水溶磷酸盐浓度并以选择的碳源如类脂化合物，最好用甘油三酯进行发酵。
棒酸的分子式为
其有效性是基于它具有抑制称为β-内酰胺酶的多种酶的能力，这些酶在诸如大肠杆菌、气生克雷白杆菌之类的某些革兰氏阳性及革兰氏阴性的致病菌中都含有。由于其作用便赋予它们具有对某些β-内酰胺抗生素的对抗力。因此，掺有该抗生素的棒酸将增强其抗菌的广谱性。
人们知道，生产棒酸通过一些属于链霉菌属的菌株进行的，例如，带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus ATCC 27064美国典型菌种保藏中心菌种编号27064号)，朱蒙金链霉菌(Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741，美国农业研究服务培养物保藏中心菌种编号5741号)，等等。
如同已公开的先前专利(欧洲专利0,182,522B1)所述，当发酵期间投加例如甘油或麦芽糖等可同化的碳源而不是只在开头时投加时，批量发酵可以提高棒酸产量。然而，用这种方法取得生产率提高是相当低的。因此，本发明的一个目的就是要实现一种获得棒酸及/或其盐类的方法，该方法比起先前已知技术的各种方法所获得的产率明显提高。
许多作者已经用实验证明磷酸盐对抗生素产率的抑制作用(参见杰·弗·马丁，1977，生物化学工程进展，6卷105-127页，Martin，J.F.，1977，Adv.Biochem，Eng.6105-127)，特别是发现了磷酸盐对用带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)合成头孢菌素的抑制作用(参见克·鲁比等，1985，发酵微生物学档案，140卷317-320页，Lübbe，C，et al.1985，Archives Microbiol.140317-320)和克·鲁比等，1984，欧洲微生物学联合会(FEMS)微生物学快报，25卷75-79页(Lubbe，C，et al.，1984，FEMSMicrobiol.Lett.2575-79)；伊·阿鲁诺维奇等，1977，微生物学档案，115卷167-173页(Aharonowithz，Y.et al.1977，Arch，Mi-crobiol.115167-173)；杰·姜等，1989，欧洲微生物联合会会刊，57卷145-150页(Jhang，J.et al.，1989，FEMS，57145-150)，还有，磷酸盐对用前述微生物合成棒酸的抑制作用[参见阿·菜布尼希等，1987，应用微生物学生物技术，26卷130-135页(Lebrihi，A.etal，1987，Appl.Microbiol.BiotechnoL.，26130-135)；杰·罗考罗等，1984，应用微生物学生物技术，20卷318-325页(Romero，J.etal，1984，Appl.Microbiol，Biotechnol.20318-325)]。然而，与上述研究报告相反，我们惊奇地发现，当培养基中可溶性磷酸盐水平达到最佳的有效范围并且维持在所述范围内，可实际提高棒酸及其盐类的产率而不是磷酸盐对棒酸产率发生负效应。更进一步说，我们发现了严格控制培养基中可溶性磷酸盐的浓度，比起实际投加营养物对于此体系提高产率有着更大的影响。
批量培养或半连续(分批投料)培养的带小棒链霉菌用来生产棒酸以及其他抗生素或典型二级代谢的分子。为本说明书的目的，术语批量投料培养是指只在初始时就把营养物投入其中的发酵，且只在过程终止时从发酵罐中提取发酵液。半连续(分批投料)培养一词意指不但在初始时而且在发酵的全过程把营养物分批投入其中的发酵，且只在过程终止时从发酵罐中提出酵液。棒酸其一批或分批投料的生产过程显示出发酵的某些特殊性质，即在其开始时就产生粘度明显升高，随即为延长生产周期而保持可接受的溶解氧水平带来困难。结果，菌丝断裂、粘性降低、产量减少便发生了，其过程结局成为不可避免。
连续培养常被选用于取得生物体、氨基酸和其他初级的代谢产物(见图书Hospodka，J.1996，Theoretical and MethodologicalBasis of Continuous Culture of Microorganisms，pp 493-645；Malek，J.and Fencl，Z.ed s.Academic Press New York)。但是，对连续培养以取得二级代谢物(抗菌素)并没有真正加以说明，或者以有限的功效加以实施(参见Vu-Trong，K.and Grey，1982，Biotechnol.Bioengineering，241093-1103；Trangott C.S.etal.，1993，Appl.Microbiol.Biote chnol.，39433-437；Noack，D.，1988，J.Bas.Microbiol.，28101-106)。为本说明书的目的，术语连续培养是指在发酵初始且在发酵全过程把营养物流加到发酵罐中，并从发酵罐中提取发酵液的某些部分而不只在发酵终止之时。我们现在发现，把可溶性磷酸盐投加到培养基中去而且/或者贯穿发酵始终控制并确定其浓度，这使得连续培养中以高产率取得棒酸和/或其盐类是有可能并有益处的。在连续培养过程中用适当稀释培养的方法，在整个过程中粘度逐渐降低，使得溶解氧浓度(＞40％)保持更长时间而不要加强搅拌，避免了菌丝断裂并延长了棒酸的生产周期。由于投加营养物和水的结果，完全达到设计能力，要求发酵过程自始至终，不是间歇地而是连续地，不断提取发酵液以保持恰当的工作容量。采用这种方法，通过控制在培养基中自始至终加进可溶性磷酸盐的过程，会取得发酵周期的延长及已达到的总产量的提高，反过来，每一几何设置容积的产量也提高了。
因此，本发明提供一种生产棒酸及/或其盐类的方法，该方法通过培养选出的带小棒链霉菌ATCC27064菌株和/或其突变菌株，以深层发酵并加通气搅拌，批量培养、半连续培养或连续培养，其中培养基中可溶性磷酸盐的浓度在发酵过程中自始至终被确定而且/或者保持在设定的范围内，该范围取决于所采用的每一种培养类型，在批量培养中在发酵初始时为500-4000毫克/升，在半连续(分批投料)或连续培养的情况下，发酵开始时在150毫克/升和600毫克/升之间，而贯穿发酵始终则要在20毫克/升和150毫克/升之间。
根据本发明生产棒酸及/或其盐类的方法，是在可同化碳源和氮源以及任选无机盐参与的情况下实现的。发酵是在通气及深层培养的条件下实施的。
理想的发酵温度最好在20℃至40℃之间，特别是在22℃至30℃之间。
碳源作为单一的或复合的营养物，可以分别只在初始时投加(就批量培养而言)，或者在半连续培养(分批投料)或连续培养情况下，在发酵全过程用间歇投加或连续投加，这取决于所采用的菌株。这些碳源包括碳水化合物(糊精、淀粉、麦芽糖等等)，诸如甘油的多羟基化合物，例如类脂(主要是天然的或合成的甘油三酯)。总而言之，任何可以使微生物生长的碳源。我们特别发现了类脂，尤其是天然的或合成的甘油三酯，可以看做是实施本发明方法的优先采用的一种，而在已有技术中并无此效应的参考文献。事实上，我们已经发现采用这样的碳源，甚至仅仅靠初始一次投加到培养基(批量培养)中，只要将可溶性磷酸盐浓度保持在本发明所界定的之内，棒酸及/或其盐类的产量就会有明显的提高。
培养基还必须含有一种可同化吸收的有机或无机氮源，例如黄豆粉、玉米浸泡液、可溶性蒸馏液、酵母提取物、棉籽粉、胨、酪朊或硫酸铵。
各样无机盐如钠、钾、铵、铁、钙、锰、氯化物、硫酸盐、磷酸盐在培养基中也要含有。
棒酸的浓度可以用微生物学的方法进行测定，即用一种能产生β-内酰胺酶的微生物例如气生克雷白杆菌(Klebsiella aerogenes)，虽然最好采用高性能液相色谱法进行测定。
用离子交换树脂或溶剂或其他已知的常规方法从培养液中提取棒酸或盐类，可以采用提取其他抗生素，特别是其他β-酰胺的提取方法来提取。
可以用简单快捷的方法测定初始培养液中的可溶磷酸盐，例如用一种商用仪器(波林格.曼海模自动分析法，BM/Hitachi仪器704)。该方法的原理是无机磷与钼酸铵进行反应，然后这种无机磷以硫酸盐来表示。对于分析可溶性磷酸盐，此样品(均匀采自培养液)必须事先经过孔径0.45μm左右的微孔过滤器过滤，以便去除固态颗粒。此样品必须在培养基灭菌之后再采集，因为在灭菌过程中可溶性磷酸盐浓度可能会有波动。采样也可以贯穿发酵过程的始终。
取1毫升的全培养液做全硫酸盐的试验，加1毫升硫酸和5毫升硝酸。将此溶液加热蒸发，使其具有最终容积为1毫升的半透明溶液。把这一最终容积用蒸馏水加到25毫升，用上述方法对可溶性磷酸盐进行测试。
当发酵分批进行时就会发现在发酵初始阶段，可溶性磷酸盐的最适宜含量是在500-4000毫克/升之间，最好在800-1600毫克/升之间。
如果由于所用的原材料性质以及其浓度的缘故而可溶性磷酸盐的含量远远高于或低于这些限度，那就要加以校正。为了这一目的，当含量低于低限时，在灭菌之前或之后，可以加入更多的无机磷酸盐，例如以钾盐或钠盐形式直至达到所要求的含量。从另一方面说，如果其含量非常高，加沉淀剂可把部分可溶性磷酸盐沉淀下来，例如用氢氧化钙或醋酸盐之类的钙类化合物，或者用任何其他方法保证这一目的一定要达到。
根据本发明，与批量培养的培养基中对初始投加可溶性磷酸盐不加控制的发酵体系相比较，已经观察到产率提高到五倍。表1示出几种以可溶性磷酸盐最适宜含量以及超出此含量所完成的发酵结果。表1
提高百分率(％)是指棒酸及/或其盐类的产量，以最终值(以微克/毫升为单位)乘以100再将此数除以311(在72小时培养的情况下)或420(在96小时情况下)所表示的结果，就代表了可溶性磷酸盐含量处在最佳范围之外的结果。
此磷酸盐必须是可溶于发酵液，如表2示出的下列结果，其中总磷酸盐的相似含量导致不同批次的发酵产生截然不同的结果，这取决于可溶性磷酸盐是否在最佳范围内。表2发酵批次可溶性磷酸 全磷酸盐棒酸盐(毫克/升) (毫克/升) (微克/毫升，96小时)4 15802380 22407(对比) 2302265 920微生物在不同磷酸盐含量中生长的差异并不象是造成不同产量的原因，至少做为一个主要因素来说。在表3中，可以观察到(微生物)生长相似而产量却在不同水平的，因此磷酸盐含量再一次看来象是产量提高的原因。菌丝体容量已用离心机以2500g(g表示重力)持续10分钟加以测定。表3发 酵可溶性磷酸 菌丝体容量(％)棒酸(微克/毫升)批 次盐(毫克/升)72小时 96小时72小时 96小时1.(对比) 18 23 22 311 4202.(对比) 100 22 22 560 7903 900 30 30 1410221041580 30 30 1550224053000 30 30 141017506.(对比) 7000 27 28 410 780在发酵期间，可以实行分批投料的过程，贯穿整个发酵始终，投加所需磷酸盐还有其他营养物。已经发现全部可溶性磷酸盐的最适宜含量(初始的和后加的)比批量投料培养的方式略少一些，在400-2000毫克/升之间。
这种投入必须以这样的方法来实现，可溶性磷酸酸初始含量在150-600毫克/升之间，而贯穿发酵始终含量在20-150毫克/升之间。为此目的，实现投加可溶性磷酸盐离子或任一沉淀剂钙化合物是适宜的，如同批量投料发酵那样取决于是否要求分别提高或降低磷酸盐含量，以维持其在指定的限度内。表4表示几批次半连续发酵的结果，这些批次的发酵是以原本就有的和后投加的不同浓度的可溶性磷酸盐做出的。
可以观察到当实施所述的投加是贯穿发酵始终的而不是只在初始时，投加的磷酸盐总量是相当高的，并没有降低产量。所做的所有这些试验都在发酵中始终把可溶性磷酸盐浓度保持在指定的水平，只是第8、9及10批次的水平较高些。表4发 酵 可溶性磷酸盐(毫克/升) 棒酸批 次初始浓度总量(含后加)(微克/毫升)(％)8 80 0 990 339265 0 1230 4110520 0 2400 8011990 0 2080 6912 1530 0 1920 6413228 618 300010014510 570 402013415722 594 327010916950 603 2730 9117278 1710 360012018230 2280 3360112在连续培养方面，通过适宜的稀释培养液在全过程中逐步降低粘度，以求维持溶解氧浓度(＞40％)时间更长而不必加强搅拌，从而避免菌丝体断裂而延长棒酸生产周期。由于投加营养物和水的结果，完全达到设计能力，要求不断提取发酵液以保持适当的工作容量。采用这一方法，通过控制在培养基中自始至终加进可溶性磷酸盐过程，会取得发酵周期的延长及已达到的总产量的提高，反过来每一几何设置容积的产量也随着提高了。
在连续培养中，如同以上批量培养和半连续培养(分批投料)的情况一样，一开始就投加可溶性磷酸盐，不过这样投加量比批量培养和半连续培养一般要少一些，按150-600mg/L的顺序，最好起点就在200-400mg/L，随后以同样顺序在发酵液中以20-150mg/L水平保持较长一段时间(50-100小时)。
在连续培养中，如同批量或半连续发酵一样，为了在每一例中设定所需要的初始浓度并在发酵期间保持此所要求的浓度，就要完成投入可溶性磷酸盐或钙化合物或其他有效的多价螯合剂。可溶性磷酸盐的投加总量和半连续发酵相似或略高一些。
另外，从32小时起在培养基中加入水，其目的在于保持发酵液的粘度值在700cP，此粘度值容许增加在传统体系中所添加的营养物数量，保持溶解氧水平在40％以上，并延长生产棒酸时间达150-170小时的水平。
在整个过程期间内，一般能达到总稀释度1.5-1.6，而不是传统培养那样只0.9-1.1，使得几何设置容量能节约可行。此过程是以这样的方法，即从发酵自始至终向初始培养基不断地投加营养物来进行的。这些营养物主要是碳源。从100小时起，每日连续或间歇提取发酵液，以发酵罐体积2.5-14％的比率来进行，其目的在于保持体积恒定，培养基粘度低于700cP。此过程可以延长到160-170小时。
表5表明实施例19至实施例25以不同营养物和可溶性磷酸盐不同水平的分批投料培养和连续培养的情况。表5TABLE V
注*(荷兰)INDUSTRA QUIMCA LASSEM公司产品WEICHOL-92(合成甘油三酯)**(荷兰)UNICHENTA公司产品PRIOLUBE(三油酸甘油酯)下列实施例即以例解作出说明。
实施例1(对比实例)按以下组分配制培养基鱼粉2克甘油 1.5克可溶性淀粉 1.5克碳酸钙 0.2克蒸馏水(适量) 100毫升将pH调至6.7，培养基分装在几个250毫升锥形烧瓶内，每瓶40毫升，塞好瓶塞，以121℃灭菌20分钟。
这样制备的培养基被接种上以生产棒酸过剩的突变菌株孢子悬浮物，而这种突变株用带小棒链霉菌ATCC 27064在具有N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍的一个步骤及在紫外光下突变的几个步骤而获得的。这种悬浮物是以容许芽孢形成生长的营养培养基斜面或平皿制备的。
接种后，培养基置于一偏心率为5cm的旋转摇床上以250rpm、温度25℃培养2天。
这样制备的培养物按5％的比例接种到由下列组分配制的发酵培养基中。
黄豆粉 4克玉米糊精 1克缓冲剂[3-(N-吗啉代)丙烷磺基酸](3-[N-morpholino]propane-sulphonic acid)1克氯化钙 10毫克氯化钠 10毫克氯化镁 10毫克乙酸钠 0.1克黄豆油 2克蒸馏水(适量) 100毫升将培养基pH调至7.0，然后分装在几个250ml的锥形烧瓶中，每瓶30ml。把这些烧瓶塞好，在温度121℃下灭菌20分钟。灭菌后测定一个烧瓶中可溶性磷酸盐，其值为100mg/L。
用实施例说明示于表1中的发酵批次1，将0.5ml的0.5％氢氧化钙溶液加入每一烧瓶的发酵结果。在投加之后再在一烧瓶中测试可溶性磷酸盐的水平，得到18mg/L值，所说的第1批发酵现在就在该水平上进行。
这样制备和接种的发酵培养基置于一偏心率为5cm旋转摇床上以250rpm、温度25℃培养。经过96小时培养，获得的棒酸的产率为420μg/ml(高压液相色谱法)。
实施例2(对比实例)本实施例的程序与实施例1的情况相同，但不投加氢氧化钙。结果是在含100mg/L可溶性磷酸盐的培养基中进行发酵。经过96小时培养，棒酸的产率为790μg/ml(高压液相色谱法)(参阅表1第2批发酵)。
实施例3本实施例的程序与实施例1的情况相同，但此例不投加氢氧化钙，在调整pH之前投加的0.12％磷酸二氢钾(KH2PO4)已包括在发酵培养基的配方内。在灭菌后从一锥形瓶测试可溶性磷酸盐，证实发酵是在含有900mg/L可溶性磷酸盐的培养基中进行的，经过96小时培养，棒酸的产率达2210μg/ml(高压液相色谱法)(参阅表1的第3批发酵)。
实施例4程序与实施例3相同，但此例的配方中包括有0.21％的磷酸二氢钾(KH2PO4)。在灭菌后从一锥形瓶测试可溶性磷酸盐，证实在含有1580mg/L可溶性磷酸盐培养基中进行发酵。在此例中测定了全磷酸盐，其值为2380mg/L，如表2所示。经过96小时培养，棒酸的产率为2240μg/ml(高压液相色谱法)(参阅表1第4批发酵)。
实施例5程序与实施例3相同，但此例配方包括有0.4％的磷酸二氢钾。在灭菌后从一锥形烧瓶测试可溶性磷酸盐，证实在含有3000mg/L可溶性磷酸盐的培养基中进行发酵。经过96小时培养，棒酸的产率为1750μg/ml(高压液相色谱法)(参阅表1第5批发酵)。
实施例6(比较实例)程序与实施例3相同，但此例配方包括有0.95％的磷酸二氢钾，在灭菌后从一锥形瓶测试可溶性磷酸盐，证实在含有7000mg/L可溶性磷酸盐培养基中进行发酵。经过96小时培养，棒酸的产率为780μg/ml(参阅表1第6批发酵)。
实施例7(比较实例)本实施例的流程与实施例3相同，只是此例的配方含0.245％的三元磷酸钙而不含磷酸二氢钾。灭菌后从一锥形瓶测试可溶性磷酸盐，其结果得出230mg/L的可溶性磷酸盐。在此例中也测定了全磷酸盐，结果是2265mg/L(参阅表2第7批发酵)。经过96小时培养，棒酸的生产能力为920μg/ml(高压液相色谱法)。
实施例8至实施例18(参阅表4)配制一种与实施例1相同组分的培养基，置于若干个2000ml锥形烧瓶中各500ml培养基。烧瓶加塞，以121℃温度灭菌20分钟。
当以类似于实施例1所用的孢子悬浮液完成接种时，该培养基置于一偏心率为5cm的旋转摇床上以250rpm、温度25℃培养2天。
取此培养液400ml用于接种150升以下列组分配制的培养基罐中，该培养基组分为黄豆粉 2克糊精2克磷酸二氢钾(KH2PO4)0.04克黄豆油0.1克UCON防沫剂(聚亚烷基二醇) 0.1克水(适量)100毫升调整此培养基的pH至7.3，以温度121℃灭菌20分钟。在温度28℃下保温培育约30小时，摇床速率115rpm，通气0.5v/v/min，发酵罐拱顶压力1kg/cm2。
取45升按上述条件培养的培养液，转移到450升以下列组分配制的培养基罐中，该培养基组分为黄豆粉 4克糊精 2克黄豆油 0.1克UCON防沫剂 0.1克氯化镁 0.02克氯化铁 0.003克氯化钙 0.01克水(适量) 100毫克将培养基的pH调至7.0，在温度121℃下灭菌20分钟。灭菌后，测定可溶性磷酸盐，在此例中给出200-300mg/L的结果。必要时，为取得不同的初始浓度的目的，此数值可投加适量的1％磷酸二氢钾溶液(实施例10，11，12，14，15及16)或钙化物(实施例8，投加适量的氢氧钙溶液)予以调整。当可溶性磷酸盐调整完成时，将45升接种培养液进行转移，开始发酵。发酵在开始24小时内保持恒温25℃、115rpm，0.5v/v/min而第25小时至发酵终止通气为1.5v/v/min，而发酵罐拱顶内压力均为0.5kg/cm2。
在整个发酵过程中可溶性磷酸盐的不同浓度是用投加不同量的10％无菌磷酸二氢钾溶液获得的(实施例13至18)。
对pH要进行自动控制，使后来的pH值在6.8和7.2之间。以下添加物也要投加
黄豆油 100ml/h，从第10小时至120小时33％的甘油 400ml/h，从第32小时至120小时1％的磷酸二氢钾400-1400ml/h，从0小时至25小时1500-5000ml/h，从25小时至50小时经120小时保温培养之后，依照表4棒酸产量在990μg/ml至4020μg/ml之间不等。
实施例19培养基的制备和发酵条件的制定如同实施例8至18一样，但在初始周期内糊精浓度为34g/L。省去投加甘油，只是补充Weichol-92(荷兰Industria Quimica Lassem公司制造的用60％油酸的合成甘油三酯)和1％磷酸二氢钾，均按下列程序投加Weichol-92 100ml/h，从10小时至120小时磷酸二氢钾(1％) 400-1400ml/h，从0小时到25小时1500-5000ml/h，从25小时到50小时。
实施例20程序与实例19相同，只是投加黄豆油以取代投加Weichol-92的合成甘油三酯。
实施例21程序与实例19相同，只是发酵延长至172小时，连续发酵体系是以从发酵100小时起每24小时按2.5％比例提取发酵液，使发酵罐内全部发酵液相当于灭菌后发酵的初始容积而建立起来的。
按以下程序投加甘油(33％)，Priolube(荷兰Unichehta公司制造的三油酸甘油酯)和磷酸二氢钾(1％)Priolube 100ml/h，从10小时开始到结束甘油(33％) 400ml/h，从32小时开始到结束磷酸二氢钾(1％)400-1400ml/h，从0小时到25小时1500-5000ml/h，从25小时到50小时实施例22程序如同实施例21，不过发酵只延长至150小时为止，对发酵液按每24小时9％的比例进行提取。投料按以下程序加以变动Priolube 100ml/h，从10小时到100小时200ml/h，从100小时开始到结束甘油(33％)420ml/h，从32小时开始到100小时780ml/h，从100小时到结束磷酸二氢钾(1％) 400-1400ml/h，从0小时到25小时1500-5000ml/h，从25小时到50小时300ml/h，从50小时到结束无菌水312ml/h，从32小时开始到100小时625ml/h，从100小时到结束实施例23程序如同实施例22，发酵延长到172小时以每24小时提取14％。为了保持粘度低水平，添加无菌水的程序也包括在内。
Priolube 130ml/h，从10小时到100小时240ml/h，从100小时开始到结束甘油(33％) 515ml/h，从32小时开始到100小时960ml/h，从100小时到结束磷酸二氢钾(1％)400-1400ml/h，从0小时到25小时1500-5000ml/h，从25小时到50小时300ml/h，从50小时到结束无菌水 630ml/h，从32小时开始到100小时1260ml/h，从100小时到结束实施例24程序如同实施例23，只是初始发酵培养基对其所有的初始物料增加30％。发酵达到155小时，每24小时提取14％。采用的投料程序为
Priolube 130ml/h，从10小时到100小时240ml/h，从100小时到结束甘油(33％)515ml/h，从32小时到100小时960ml/h，从100小时到结束磷酸二氢钾(1％) 400-1400ml/h，从0小时到25小时1500-5000ml/h，从25小时到50小时300ml/h，从50小时到结束无菌水630ml/h，从32小时到100小时1260ml/h，从100小时到结束实施例25程序如同实施例21，发酵延长至150小时，每24小时9％的比例进行提取。完全省去投加甘油而增加三油酸甘油脂(Priolube)。投加磷酸盐和无菌水与实施例22相同。按以下程序投加三油酸甘油酯(Priolube)Priolube(三油酸甘油酯) 320ml/h，从10小时到100小时590ml/h，从100小时到结束
权利要求
1.一种生产棒酸及/或其盐类的方法，其特征在于通过培养带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus ATCC 27064)或其突变菌株并以批量培养、半连续培养或连续培养的方式在通气和搅拌的情况下进行深层发酵，其中可溶性磷酸盐的浓度在发酵开始就加以确定且/或在发酵的全过程中保持所设定的范围。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在批量培养中发酵一开始就确定培养基中可溶性磷酸盐的浓度，并在培养过程中固定在500mg/L和4000mg/L范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在半连续培养或连续培养中发酵一开始就确定培养基中可溶性磷酸盐的浓度，并在发酵全过程中确定在150mg/L和600mg/L两者之间的范围，且/或保持在一设定的范围内，最好发酵自始至终保持在20-150mg/L范围内。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其特征在于培养基中存在的可溶性磷酸盐浓度一开始就确定不变，且/或通过把可溶性磷酸盐离子以其任何一种形式投加到所述培养基中并保持发酵始终。
5.根据权利要求1至3所述的方法，其特征在于培养基中可溶性磷酸盐浓度一开始就确定不变，且/或如其超过期望的限度，通过沉淀该可溶性磷酸盐以保持发酵始终。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于通过向培养基投加钙化合物的方法沉淀该可溶性磷酸盐。
7.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于所用的碳源包括一种或多种天然的或人工合成的甘油三酯，在发酵一开始和/或贯穿发酵始终就予以投加。
8.根据前述任可一项权利要求所述的方法，其特征在于那些在发酵一开始和/或贯穿发酵始终就投加的一种或多种天然的或人工合成的甘油三酯被用来作为唯一的碳源。
9.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于发酵是在温度20-40℃下进行的。
10.根据前述任何一项权利要求所述的方法，其特征在于发酵是在温度22-30℃下进行的。
全文摘要
用带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus ATCC 27064)菌株或其突变菌株进行批量的、连续的或半连续的发酵。此发酵方法是以严格控制培养基中可溶性磷酸盐,包括从发酵开始至发酵结束全过程。作为碳源的类脂类化合物优先使用甘油三酯,获得抗生素产率显著提高的效果。
文档编号C12P17/18GK1178556SQ96192509
公开日1998年4月8日 申请日期1996年11月15日 优先权日1995年11月23日
发明者加·罗得第格斯·奥特罗, 密·安·摩雷那·瓦叶, 马·耶·洛佩斯·聂托, 阿·胡·老科耶多斯, 阿·维塔耶尔·阿尔巴 申请人:抗生素股份公司