专利名称：一种发酵生产β－胡萝卜素的方法
技术领域：
本发明是用孢子接种在气升式发酵罐中发酵培养丝状真菌制备β-胡萝卜素的工艺。β-胡萝卜素是维生素类药物，它是维生素A的前体，在人体内通过氧化酶的作用游离出二分子维生素A，起维生素A的作用。它对日光照射原卟啉所产生的过氧化基有清除作用，因此在医药和食品业有广泛的用途。
在此发明以前发酵制备β-胡萝卜素多采用摇瓶菌丝的进种子罐方法培养种子，即菌种通过斜面培养或摇瓶培养成菌丝后再接入种子罐繁殖产生大量菌丝作发酵用种，此种子制备工艺操作步骤多，周期长，增加杂菌污染的机会。另外，在本发明以前种子培养的发酵采用带有机械搅拌装置的通用式发酵罐。机械搅拌易将丝状真菌的菌丝打断，造成菌丝损伤，生物量减少，使发酵β-胡萝卜素的产量降低，而且发酵要求通风量高，能耗大，成本高。
本发明的目的在于提供一种工艺简单，发酵β胡萝卜素产量高，制造成本低的发酵生产β-胡萝卜素的方法。
本发明通过下列方案实现。
该方法包括a、一级种培养；b、二级种培养；c、发酵；其中二级种培养及发酵工序所采用的生物反应器均为气升式发酵罐，该气升式发酵罐的结构为内循环式或外循环式。一级种培养工序中、将保藏的能代谢产生β-胡萝卜素的斜面菌种或砂土管保藏的菌种孢子接入PDA培养基上，在温度24-30℃条件下培养48-72小时，待大量长出孢子后用无菌生理盐水洗脱孢子成悬浮液，悬浮液中含孢子的量应为7-9×105个/毫升。PDA培养基是马铃薯、葡萄糖与琼脂培养基或马铃薯、葡萄糖培养基，培养孢子的器皿可以用玻璃三角烧瓶或茄子瓶及培养皿。产生β-胡萝卜素的菌种是一种丝状真菌，Blakeslea frispora，分“+”、“-”两种菌株，保藏于江苏省微生物研究所菌种保藏处，菌号为9203(正株)，9204(负株)。在二级种培养工序中，新鲜孢子悬浮中的孢子在种子罐内萌发繁殖成大量菌丝体作为发酵用种子，孢子悬浮液中孢子的含量为7-9×105个/毫升。二级种培养和发酵工序采用气升式发酵罐，罐体的高径比为10∶1-20∶1，罐体与循环管的直径比为1∶0.3-1∶0.5，压缩空气从装置在培养液循环管中的喷嘴高速喷入培养液中呈气液混合状态，造成培养液重度降低，并获得高速气流的动力而沿循环管上升进入罐体，产生持续不断的循环。在二级种培养工序中，培养基为葡萄糖1-2％，淀粉2-4％，玉米浆3-7％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸镁0.01-0.05％，盐酸硫胺素0.001-0.003，PH6.0-6.5，培养温度24-30℃，通风量1∶0.8-1∶1.5，培养时间24-48小时。在发酵工艺中，培养基为淀粉2-4％；粕饼粉3-5％；植物油3-5％；玉米浆3-5％；磷酸氢二钾0.1-0.3％；硫酸镁0.01-0.05％；盐酸硫胺素0.001-0.003％，PH7.0-8.0，培养温度24-30℃，通风量1∶1.0-1∶20，罐压0.04-0.08MPa，培养时间90-120小时。
本发明的优点是1、由于利有气升式发酵罐，因而避免了原来使用普通发酵罐时，因搅拌叶造成较大的剪切力，使菌丝体受伤，生物量下降，从而降低β-胡萝卜素的产量的问题，具体实验结果如表一。
表一
2、普通发酵罐通过提高通风量来满足发酵过程耗氧量高的问题。因而能耗大，氧的利用率也低。而采用气升式发酵罐发酵就能解决这一问题。实验结果见表二。
表二
3、本发明用孢子悬浮液代替摇瓶种子作为一级种种子接种子罐的工艺，可以缩短罐种子培养时间，提高种子的活力，使β-胡萝卜素产量大大提高。实验数据见表三。
表三
实例11、一级种培养PDA培养基配制如下150克去皮马铃薯切成碎块，置于100毫升水中煮沸30分钟，经纱布过滤，滤液中加入20克葡萄糖，20克琼脂，加火定容至1000ml，PH自然，装入1000毫升的三角烧瓶中，每瓶装80毫升培养基，120℃灭菌20分钟。
将保藏于江苏省微生物研究所菌种保藏处，菌号为9203(正株)、9204(负株)的BLakeslea frispora“+”、“-”菌株砂土管孢子分别接种至4只三角瓶中，每个菌株各接两只。26℃培养48小时，待培养基表面生长大量黑色孢子后，每只三角瓶中加入无菌生理盐水200ml，将孢子洗脱成每毫升中含有7×105个孢子的孢子悬浮液。
2、二级种培养，种子培养基按以下配方制备淀粉2％；葡萄糖2％；玉米浆5％；硫酸镁0.01％；磷酸二氢钾0.1％；盐酸硫胺素0.001％，用氢氧化钠溶液调整至PH6.2。
种子罐为容积6立升的内循环气升式玻璃发酵罐2只，每只装种子培养基2升。培养基经120℃灭菌30分钟。分别接入培养基量1％的上述“+”、“-”菌珠的孢子悬浮液，26℃培养32小时，风量1∶1，罐压0.05MPa。
3、发酵发酵培养基的配方为淀粉4％；棉籽饼粉4％；玉米浆3％豆油3％；磷酸二氢钾0.1％；硫酸镁0.01％，盐酸硫胺素0.001％，用氢氧化钠溶液调PH至8.0。
发酵罐为容积30毫升的外循环气升式玻璃发酵罐，高径比15∶1，循环管与罐直径比为0.4∶1，装发酵培养基18立升，120℃灭菌40分钟，将培养好的“+”、“-”两菌株的种子全部接入发酵培养基中，接种量为20％，“+”、“-”菌株各10％，发酵温度27℃±1℃，通风量1∶2，罐压0.08MPa。发酵48小时流加入β-紫罗兰酮0.1％，发酵90小时，得β-胡萝卜素含量1751.24毫克/立升的发酵液。将发酵液离心收集菌体，烘干，粉碎得干菌粉606.2克，每克干菌粉含β-胡萝卜素52.0毫克。干菌粉用工业已烷提取，提取液经减压浓缩后，加无水乙醇低温结晶，结晶用少量无水乙醇洗涤，并真空干燥得β-胡萝卜素晶体19.3g，晶体纯度为95.6％。
实例21、一级种培养除不加琼脂外，PDA培养基和培养条件同实例1，3000毫升的三角瓶，每瓶装培养基150毫升。前述“+”、“-”两个菌株各接8瓶，每毫升中含有9×105个孢子。
2、二级种培养，种子培养基同实例1，种子罐采用300立升外循环气升式不锈钢罐两只。罐的高径比为20∶1，循环管与罐的直径比为0.36∶1，两只罐各装培养基240立升，灭菌后分别接入培养基量0.5％的“+”、“-”菌珠孢子悬浮液，27℃培养30小时、通风量1∶0.8。
3、发酵发酵培养基除3％豆油改成3％棉籽油，棉籽饼粉改为大豆饼粉外，其余同实例1，发酵罐为容积3000立升的外循环气升式不锈钢制发酵罐，罐体高径比为20∶1，循环管与罐的直径比为0.44∶1，罐内装培养基2000立升，120℃灭菌1小时，冷却后将培养好的“+”、“-”两菌株一起接入培养基内。发酵温度27°±1℃。通风量1∶1.4。罐压0.05MPa。发酵48小时，流加β-紫罗兰酮0.1％，发酵114小时结束，发酵液中β-胡萝卜素产量为1328毫克/立升。经提取后制得β-胡萝卜素含量8％的油状产品29.5公斤。
权利要求
1.一种发酵生产β-胡萝卜素的方法，包括a、一级种培养；b、二级种培养；c、发酵；其特征是二级种培养及发酵工序所采用的生物反应器均为气升式发酵罐，该气升式发酵罐的结构为内循环式或外循环式。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在一级种培养工序中，将保藏的能代谢产生β-胡萝卜素的斜面菌种或砂土管保藏的菌种孢子接入PDA培养基上，在温度24-30℃条件下培养48-72小时，待大量长出孢子后用无菌生理盐水洗脱孢子成悬浮液，悬浮液中含孢子的量应为7-9×105个/毫升。
3.根据权利要求1、2所述的方法，其特征是PDA培养基是马铃薯、葡萄糖与琼脂培养基或马铃薯、葡萄糖培养基，培养孢子的器皿可以用玻璃三角烧瓶或茄子瓶及培养皿。
4.根据权利要求1、2所述的方法，其特征是产生β-胡萝卜素的菌种是一种丝状真菌，Blakeslea frispora，分“+”、“-”两种菌株，保藏于江苏省微生物研究所菌种保藏处，菌号为9203(正株)、9204(负株)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是在二级种培养工序中，新鲜孢子悬浮液中的孢子在种子罐内萌发繁殖成大量菌丝体作为发酵用种子，孢子悬浮液中孢子的含量为7-9×105个毫升。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是二级种培养和发酵工序采用气升式发酵罐，罐体的高径比为10∶1-20∶1，罐体与循环管的直径比为1∶0.3-1∶0.5，压缩空气从装置在培养液循环管中的喷嘴高速喷入培养液中呈气液混合状态，造成培养液重度降低，并获得高速气流的动力而沿循环管上升进入罐体，产生持续不断的循环。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是在二级种培养工序中，培养基为葡萄糖1-2％，淀粉2-4％，玉米浆3-7％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸镁0.01-0.05％，盐酸硫胺素0.001-0.003，PH6.0-6.5.培养温度24-30℃，通风量1∶0.8-1∶1.5，培养时间24-48小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是在发酵工艺中，培养基为淀粉2-4％；粕饼粉3-5％；植物油3-5％；玉米浆3-5％；磷酸氢二钾0.1-0.3％；硫酸镁0.01-0.05％；盐酸硫胺素0.001-0.003％，PH7.0-8.0，培养温度24-30℃，通风量1∶1.0-1∶20，罐压0.04-0.0 8MPa，培养时间90-120小时。
全文摘要
本发明属于一种用孢子接种在气升式发酵罐中培养丝状真菌发酵制备β－胡萝卜素的工艺。该工艺包括一级种培养、二级种培养及发酵等工序,其特点是将能代谢产生β－胡萝卜素的微生物菌种在一定条件下培养形成大量孢子,以气升式发酵罐作为培养种子和发酵的生物反应器,在该种类型的罐中,孢子培养繁殖成大量菌丝,并作为种子接入发酵培养基中,发酵产生β－胡萝卜素。
文档编号C12P23/00GK1193048SQ98111199
公开日1998年9月16日 申请日期1998年3月23日 优先权日1998年3月23日
发明者姜文候, 单志萍, 孟妤, 孙冬梅, 陈涛, 陈宗胜, 马国华, 朱湘民, 童骁, 宋冬林 申请人:江苏省微生物研究所, 中国科学院武汉病毒研究所