有利于纳豆芽孢杆菌菌落形成和高通量 筛选。该斜面豆芽汁黄瓜汁固体培养基的配方有利于纳豆芽孢杆菌保藏。
[0044] 本发明中，采用基因组重排技术选育纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-405时，选育平 板中添加一定比例的发酵培养基组分（黄瓜汁），而发酵培养基中添加一定比例的选育平 板组分（豆芽汁），使得选育与发酵两环节之间形成关联，促使选育环节表现出高产表型的 菌株在发酵时依然表现出高产表型，此即为本发明的底物诱导适应性策略。
[0045] 步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：① 制备2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量为10-15mg/ L)，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板（平板D)，为平板D;②将诱变后的干酪乳 杆菌（LactobacilluscaseiShirota)涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个 平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落 而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营 养缺陷型干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Mef，保藏于斜面MRS固体培养基中。
[0046] 所述的平板MRS固体培养基和斜面MRS固体培养基以1L计，由以下量的组分组 成：
[0047] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS固体培养基的pH值保持在6.2?6.4。
[0048] 该MRS固体培养基有利于干酪乳杆菌菌落形成和甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆 菌的筛选。
[0049] 本发明中，采用随机诱变技术获得甲硫氨酸营养缺陷（Me〇的干酪乳杆 菌（LactobacilluscaseiShirota-Meif，LcS-Met〇。LcS-Meif在生长速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-405,但前者对后者营养依赖，两者之间形成稳定共生关系，通过构建共生关 系的策略实现纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌的共发酵，获得富含NK和PQQ的发酵黄瓜。
[0050] 步骤3)中，在共发酵之前，将BN-NKPQQ-RWX-405和LcS-Met_*别进行活化培 养，BN-NKPQQ-RWX-405在豆芽汁黄瓜汁液体培养基中进行活化培养，培养温度为34? 36°C(优选35°C)，LcS-Met_在MRS液体培养基中进行活化培养，培养温度为36?38°C(优 选 37。。）。
[0051] 所述的豆芽汁黄瓜汁液体培养基以1L计，由以下量的组分组成：
[0052]黄瓜汁 100 ?150mL;
[0053]鹿糖 4. 0?6. 0g;
[0054] 豆芽汁 余量。
[0055] 所述的豆芽汁黄瓜汁液体培养基以1L计，优选的，由以下量的组分组成：
[0056]黄瓜汁 100 ?150mL;
[0057]鹿糖 5.0g;
[0058] 豆芽汁 余量。
[0059] 该豆芽汁黄瓜汁液体培养基的配方有利于纳豆芽孢杆菌增殖培养。豆芽汁制备： 刚出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸浓缩至1000mL后过滤，得到豆芽汁。
[0060] 所述的MRS液体培养基以1L计，由以下量的组分组成：
[0061] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 吐温 80 LOmL； 水 余量； 该MRS液体培养基的pH值保持在6.2?6.4。
[0062] 该MRS液体培养基有利于干酪乳杆菌增殖培养。
[0063] 将BN-NKPQQ-RWX-405和LcS-Met_共发酵含黄瓜的发酵培养基，具体包括：将活化 后的BN-NKPQQ-RWX-405和LcS-Met_混合，形成混合菌液，将混合菌液接种至含黄瓜的发酵 培养基，纱布封口培养后得到富含NK和PQQ的发酵黄瓜。
[0064] 所述的含黄瓜的发酵培养基以1L计，由以下量的组分组成：
[0065] 鹿糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g;
[0066] V芽丨十 lOOmL； 黄瓜 余量。
[0067] 在容器中加入蔗糖、酪氨酸、谷氨酸、麦芽糖和豆芽汁之后，用黄瓜填满至1L即 可。
[0068] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-405和LcS-Mef的混合密度比为1:2?1:5。
[0069] 所述的混合菌液接种至含黄瓜的发酵培养基的接种量为1%?5%。
[0070] 所述的纱布封口培养的条件为：37°C?42°C六层纱布封口培养24h?36h。
[0071] 黄瓜汁的制备是直接将黄瓜榨汁后得到。
[0072] 共发酵时，在含黄瓜的发酵培养基中，添加酪氨酸和谷氨酸对BN-NKPQQ-RWX-405 进行代谢调控，促进PQQ合成，添加麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-405进行代谢调控，促进NK生 成，添加豆芽汁促进BN-NKPQQ-RWX-405在黄瓜发酵过程中的增殖。本发明中，纳豆芽孢杆 菌与干酪乳杆菌选育及其共发酵制备的发酵黄瓜富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌，具有发酵黄 瓜固有的滋味和发酵后特有的风味。
[0073] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0074] -、本发明使用的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌均属于食品级安全微生物。
[0075] 二、首次采用基因组重排技术优化NK和PQQ合成途径，对纳豆芽孢杆菌所有可能 与NK和PQQ合成有关的主流及旁支途径统筹优化，实现多位点协同突变，进而通过高通量 筛选使多位点协同突变的表型从突变库中凸显。同时，在基因组重排技术基础上进一步采 用底物诱导适应性策略，保障了选育环节表现出高产表型的菌株在发酵时依然表现出高产 表型，获得能够在黄瓜发酵中高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-405。
[0076] 三、首次采用构建共生关系的策略实现纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌的共发酵。通 过随机诱变获得甲硫氨酸营养缺陷（Met_)干酪乳杆菌LcS_Met_。LcS_Met_在生长速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-405,但前者对后者营养依赖，两者之间形成稳定共生关系，保障了共发 酵顺利完成，从而获得富含NK和PQQ的发酵黄瓜。
[0077] 四、从结构上看，PQQ通过酪氨酸和谷氨酸之间形成肽键连接环化而成。本发明通 过在含黄瓜的发酵培养基中添加酪氨酸和谷氨酸对BN-NKPQQ-RWX-405进行代谢调控，促 进PQQ合成。通过在含黄瓜的发酵培养基中添加麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-405进行代谢调 控，促进NK生成。通过在含黄瓜的发酵培养基中添加豆芽汁促进BN-NKPQQ-RWX-405在黄瓜 发酵过程中的增殖，从而得到富含NK和PQQ的发酵黄瓜，PQQ含量达到93-150ng/mL，高于 天然食品中含量最高的纳豆（55-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力达到491-1080U/ mL。所获得的发酵黄瓜富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌，具有发酵黄瓜固有的滋味和气味。
【具体实施方式】
[0078] 在实施例中，有关培养基配制如下，
[0079] (a)所述的豆芽汁黄瓜汁液体培养基配制完成后，121°C灭菌15min，以1L计，由以 下量的组分组成：
[0080]黄瓜汁 130mL;
[0081]鹿糖 5.0g;
[0082] 豆芽汁 余量；
[0083] 该豆芽汁黄瓜汁液体培养基的配方有利于纳豆芽孢杆菌增殖培养。豆芽汁制备： 刚出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸浓缩至1000mL后过滤，得到豆芽汁。
[0084] (b)所述的豆芽汁黄瓜汁固体培养基（平板）配制完成后，121°C灭菌15min，以1L 计，由以下量的组分组成：
[0085] 黄瓜汁 130mL; 鹿糖 5.0g; 琼脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0086] 该豆芽汁黄瓜汁固体培养基（平板）的配方有利于纳豆芽孢杆菌菌落形成和高通 量筛选。
[0087] (c)所述的豆芽汁黄瓜汁固体培养基（斜面）配制完成后，121°C灭菌15min，以1L 计，由以下量的组分组成：
[0088] 黄瓜汁 130mL; 蔗糖 5.0g; 琼脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0089] 倒试管斜面
[0090] 该豆芽汁黄瓜汁固体培养基（斜面）的配方有利于纳豆芽孢杆菌的保藏。
[0091] ⑷所述的MRS液体培养基配制完成后，121°C灭菌15min，以1L计，由以下量的组 分组成：
[0092] 蛋白胨 10.0g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 〇.58g; 硫酸锰 0.25g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； pH6.2 ?6.4
[0093] 该MRS液体培养基有