专利名称：包含吡咯并氮杂类化合物的间歇性跛行治疗药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及间歇性跛行治疗药物，其中含有吡咯并氮杂作为活性组分。更具体地说，本发明涉及间歇性跛行治疗药物，其中含有活性组分吡咯并[3,2-c]氮杂衍生物或其可药用盐，所述药物还可用来预防和改善慢性动脉阻塞疾病，闭塞性动脉硬化和血栓脉管炎。
背景技术：
慢性动脉阻塞疾病是指特征为外周血流紊乱的疾病，而以闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎为代表。关于血流紊乱症状，可用Fontaine分类法确定疾病的严重程度及其治疗方法。按照此分类法，这些疾病可以分为阶段Ⅰ腿寒冷或麻木，阶段Ⅱ间歇性跛行，阶段Ⅲ静止疼痛，和阶段Ⅳ溃疡。目前，许多病人主诉间歇性跛行，并且患者数目在逐年增加。
间歇性跛行是慢性动脉阻塞疾病的一个常见症状，尤其是对于闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎疾病更是如此，所有这些疾病都主要和腿部大动脉慢性阻塞有关，这意味着肌肉在工作状态时发生腿肌肉局部缺血，及其由此形成的钝痛、麻木等，使长时间行走困难，但是稍作休息又可恢复行走。据认为造成其的主要原因是由腿部大动脉硬化而导致的内膜肥大，并在肥大部分形成血栓并从内膜排出、内膜出血、溃疡或类似刺激，从而造成血流阻碍和大动脉周围缺血[Itoh,M.，等人，Geriatric Medicine,33,857-880(1995)]。
对于间歇性跛行的患者，其血管内皮细胞已被动脉硬化损害，或者常被其它疾病损害，如高血压、高血脂症或糖尿病。血小板粘结和聚集能力在损害部位被加强，血小板聚集导致各种含血清素类的血管收缩剂释放，而进一步加强血管收缩。所以，非常需要能够同时抑制血小板聚集和血管收缩、并能特异性作用于损伤部位的药物，尤其是具有特别适于改善间歇性跛行的效力的药物。
近些年来，已经公开了一些作为间歇性跛行有效治疗药物的化合物。但是这些化合物在药效、有效期、毒性和副反应或上述药效特征方面都不近如意。
如上所述，目前的情况是在实际中没有任何能够治疗或改善间歇性跛行的药物，这样需要开发高效的相应药物[William,R.H.,Vascular Medicine,2,257-262(1997)]。
所以，本发明的目的是提供一种治疗或改善间歇性跛行的药物，其在药效、有效期、毒性和副作用以及药效特征方面令人满意。本发明的另一个目的是提供用来预防或治疗慢性动脉阻塞疾病、闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎的药物。
本发明公开考虑到上述原因，本发明者们进行了大量研究，以寻找具有强效和长效、长时间稳定作用、低毒性和副反应、以及拥有最适于治疗和改善间歇性跛行的药效特征的药物。作为通过在各种体内评估模型中进行的药效和毒性评估、以及副反应评估的结果，本发明基于下述发现而得以完成强的血清素(5-HT2)受体强阻断作用和弱的肾上腺素能(α1)受体阻断作用-下式(Ⅰ)所代表的吡咯并氮杂衍生物 其中虚线表示存在或不存在化学键；当虚线所示的键存在时，X不存在，当虚线所示的键不存在时，X代表氢原子、羟基或OR1基团，其中R1代表取代或未取代烷基；Y代表直链或支链、取代或未取代烷基；Z1和Z2可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基或卤素原子；W表示氢原子或甲基-令人惊奇地提供了抗血小板聚集和损伤特异性血管收缩的具有良好平衡的抑制作用，并且具有最适于作为期待已久的间歇性跛行治疗药物的药效特征。
所以，本发明提供了间歇性跛行治疗药物，其中含有式(Ⅰ)所示吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐作为活性组分，由此提供了用于预防或治疗慢性动脉阻塞疾病的药物，预防或治疗闭塞性动脉硬化的药物和预防或治疗血栓闭塞性脉管炎的药物，所有这些药物都含有式(Ⅰ)所示吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐作为活性组分。药物中的活性组分有以下优点极强作用、长效和易于口服吸收，尤其特异抑制受伤部位的血管收缩。由此这些预防或治疗药物具有下述显著特征，即不仅促进外周血流而且还促进近端部位血流，同时没有引起由于非特异性血管扩张而发生的低血压或头痛。另外关于作用于血管自身方面，它们主要在发生受伤和受伤发展部位作用于主动脉和静脉，从而抑制了血小板聚集。
本发明还提供了治疗或改善间歇性跛行的方法，包括对间歇性跛行患者施用式(Ⅰ)吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐；和式(Ⅰ)吡咯并氮杂衍生物及其可药用盐在制备间歇性跛行治疗药物中的应用。
实施本发明的最佳方式用作本发明间歇性跛行治疗药物的活性组分的吡咯并氮杂衍生物(Ⅰ)是已知化合物，或者是可按已知方法制得的化合物。
具体来说，这些吡咯并氮杂衍生物已经在本申请人递交的第WO97/20845号PCT国际出版文件中公开过，并且可以按照该PCT国际出版文件的描述制得。
作为吡咯并氮杂衍生物(Ⅰ)中的X基团的优选实例，当虚线所示的键存在时，基团X不存在；而当虚线所示的键不存在时，基团X可以是羟基、氢原子或OR1。在这些吡咯并氮杂衍生物当中，其中虚线所示的可选双键不存在、W基团为氢原子且X基团为羟基的化合物是特别优选的。
OR1基团中的R1的优选实例包括，含有1-4个碳原子的直链或支链烷基，优选为例如甲基和乙基。这些基团中的一个或多个氢原子可以被卤素原子例如氟、氯或溴取代，或者被含1-4个碳原子的烷氧基例如甲氧基或乙氧基取代。R1的特别优选实例是甲基。
键连在吡咯环氮原子上的Y基团的优选实例可包括具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，优选为例如甲基、乙基、正丙基和异丙基。这些基团中的一个或多个氢原子可以被卤素原例如氟、氯或溴取代，或者被含1-4个碳原子的烷氧基例如甲氧基或乙氧基取代。R1的特别优选实例是甲基。
苯环上的Z1、Z2基团可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基，或卤素原子例如氟、氯或溴。Z1为氢原子且Z2为氢原子、羟基或卤素原子为优选组合，而其中又以Z1为氢原子且Z2为氢原子、羟基或氟原子的组合为特别优选。在这些组合中，Z1为氢原子且Z2为链连在对位上的氟原子为最最优选的。此外，W代表氢原子或甲基，其中氢原子是特别优选的。
在这些式(Ⅰ)吡咯并氮杂衍生物当中，最优选的化合物是(±)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4-酮或者(-)-(S)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4-酮。
在本发明中，除式(Ⅰ)吡咯并氮杂衍生物以外，也可以使用它们的可药用盐。例如，用于转化成其可药用盐的酸有无机酸例如是盐酸、硝酸、硫酸、磷酸和氢溴酸；和有机酸例如马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对-苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸和鞣酸。此外，本发明中的吡咯并氮杂衍生物(Ⅰ)和其可药用盐可以以溶剂化物形式提供。
在本发明中，为了用式(Ⅰ)吡咯并氮杂衍生物来治疗或改善间歇性跛行，虽然可以按其有效量将其自身直接给药，但是通常利用已知技术将其制成所需剂型而作为药物制剂给药。
本发明药物给药途径的实例可包括使用片剂、粉剂、颗剂剂、胶囊剂或糖浆剂的口服给药，和使用注射剂或栓剂的非胃肠道给药。出于给药方便性的考虑，以口服给药方式为优选，事实上，口服给药已经可以提供足够的药效。
在上述药物制剂的配制中，可使用水或油液体或固体形式的稀释剂或载体。这些稀释剂或载体的实例包括聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、环糊精、黄芪胶、硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、聚乙烯醇、二氧化硅、乳糖、晶状纤维素、蔗糖、淀粉、磷酸钙、植物油、羧甲基纤维素、十二烷基硫酸钠、纯净水、乙醇、甘油和甘露醇。
含有活性组分式(Ⅰ)吡咯并氮杂的间歇性跛行治疗药物，可以给予主诉或可能发展成间歇性跛行的患者。主诉间歇性跛行患者是指外循环紊乱患者和有慢性动脉阻碍类疾病的患者，例如，患有闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎的患者。间歇性跛行药物可用于预防和治疗此类疾病。
根据给药方式和欲给药个体的年龄、体重、身体状况等的不同，本发明间歇性跛行治疗药物的用量也不同。对于口服给药，式(Ⅰ)的吡咯并氮杂衍生物的日剂量一般为1mg-1,000mg。
以下制备实施例和测试用来详细说明本发明。然而，需要指出的是，本发明决不仅仅限于以下实施例。制备实施例1合成1-甲基-3-吡咯甲酸乙酯(化合物1)将N-甲酰基肌氨酸(117.1g,1mole)、丙炔酸乙酯(98.1g,1mole)和乙酸酐(638ml)的混合物于130℃油浴加热下搅拌22小时后，把该反应混合物减压浓缩。
向残余物中加入甲苯(100ml)，随后减压浓缩。重复这些步骤，将所得棕色油状物减压蒸馏。在4mmHg压力下收集103-104℃的组份，由此得到本标题化合物(109.19g,产率71.3％)。制备实施例2合成1-甲基-3-吡咯甲酸(化合物2)将在制备实施例1得到的化合物1(7.66g,50mmole)和2N氢氧化钠水溶液(37.5ml,75mmole)的混合物加热回流2小时。把该反应混合物冷却至0℃，在搅拌下加入6N盐酸以进行酸化。然后加入氯化钠(15g)，之后在冰-丙酮浴中搅拌1小时。收集沉淀出的晶体，用冷水洗涤晶体，随后减压干燥，由此得到本标题化合物(5.77g,产率92.2％)。制备实施例3合成3-(1-甲基-3-吡咯甲酰氨基)丙酸苄酯(化合物3)在冰浴冷却和搅拌下，向化合物2(5.01g,40mmole)和β-丙氨酸苄酯对甲苯磺酸酯(β-alanine benzyl esterp-toluenesulfonate)(16.87g,48mmole)的N,N-二甲基甲酰氨(下文中称为DMF)溶液(200ml)中滴加氰基磷酸二乙酯(7.83g,48mmole)的DMF(50ml)溶液。然后滴加三乙胺(9.71g,96mmole)的DMF(50ml)溶液，将该反应混合物在室温下搅拌67小时。
将该反应物减压浓缩，随后向残余物中加入乙酸乙酯-苯(3∶1v/v)。随后依次用半饱和碳酸钾水溶液、水、10％的柠檬酸水溶液、水和饱和氯化钠水溶液(下文中简称为“饱和盐水”)洗涤所得混合物，用无水硫酸钠干燥、减压浓缩。将残余物用己烷洗涤，再用乙酸乙酯-己烷重结晶，由此得到本标题化合物(9.44g，产率82％)。制备实施例4合成3-(1-甲基-3-吡咯甲酰氨基)丙酸(化合物4)向化合物3(7.16g,25mmole)的四氢呋喃(下文中称为THF)溶液(300ml)中加入5％钯/炭(716mg)，然后在氢气流下搅拌72小时。过滤该反应混合物，用甲醇洗涤固体。合并滤液和洗涤液，减压浓缩。用乙晴将残余物重结晶，由此得到本标题化合物(4.14g,产率84％)。制备实施例5合成1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(化合物5)将化合物4(348mg,1.5mmole)和多磷酸(80％,17.5g)的混合物在100℃搅拌1小时。向该反应混合物中加入水(150ml)，随后加入碳酸钾，以将pH调至5。将所得混合物用氯化钠饱和，再用THF萃取(3次)。将有机层合并，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。残余物用硅胶色谱柱分离和纯化(洗脱液3％-甲醇/氯仿)，由此得到化合物5(161mg，产率50％)。制备实施例6合成5-(3-氯丙基)-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(化合物6)在冰浴和搅拌下，向叔丁醇钾(1.68g,15mmole)的THF溶液(40ml)中加入化合物5(1.34g,7.5mmole)。将该反应混合物在0℃搅拌1小时后，在相同温度下，滴加1-溴-3-氯丙烷(5.90g,37.5mmole)的THF(40ml)溶液。将所得混合物室温搅拌93小时。
把柠檬酸一水合物(1.58g)的水溶液加到该反应混合物中，随后减压浓缩。向残余物中加入水，再用氯仿将混合物萃取两次。合并有机层，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将残余物用硅胶色谱柱分离和纯化(洗脱液乙酸乙酯∶己烷=2∶1)，由此得到本标题化合物(628mg，产率33％)。制备实施例7合成5-(3-氯丙基)-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(化合物6)(可供选择的方法)(ⅰ)合成3-[1-甲基-3-[N-(3-氯丙基)]吡咯甲酰氨基丙酸乙酯(化合物7)将化合物2(50.05g,400mmole)的THF(180ml)悬浮液冷却至-5℃，在搅拌下，用大约5分钟时间加入草酰氯(50.77g,400mmole)的THF(20ml)溶液，接着加入DMF(200μl)。将该反应混合物于室温搅拌1.5小时后，依次加入THF(200ml)和3-(3-氯丙基)氨基丙酸乙酯盐酸盐(101.3g,400mmole)。将该反应混合物冷却至-5℃，在搅拌下以维持内部温度不超过10℃的速率滴加三乙胺(161.9g,1.60mole)的THF(200ml)溶液。将所得混合物在冰浴下搅拌10分钟，然后在室温搅拌1.5小时。
向该反应混合物加入乙酸乙酯。将有机层依次用1/3饱和盐水、2N盐酸、1/3饱和盐水、饱和碳酸氢钠水溶液-饱和盐水(2∶1 v/v)、和饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩，由此得到粗产物(120.22g)。
虽然该粗产物已经基本上纯了，但是还是对其一部分进行硅胶色谱柱纯化(洗脱液2％-甲醇/氯仿)，并测定其物理性质，结果证明是本标题化合物。(ⅱ)合成3-[1-甲基-3-[N-(3-氯丙基)]-吡咯甲酰氨基]丙酸(化合物8)在冰浴冷却和搅拌下，以不要使内温超过5℃的速度向在合成(ⅰ)中获得的粗产物(118.81g)的THF(47.4ml)溶液中滴加已经预先冷却的2N氢氧化钠水溶液(237ml,474mmol)。将该反应混合物在室温搅拌30分钟。
将该反应混合物用冰冷却，然后用甲苯洗涤。在冰浴冷却和搅拌下，以不要使内温超过5℃的速度向水层中加入6N盐酸(79ml)，将所得混合物用二氯甲烷萃取两次。合并二氯甲烷萃取层，用水和饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩，由此得到粗产物(108.05g)。
虽然该粗产物已基本上纯了，但是还是对其一部分进行硅胶色谱柱纯化(洗脱液10％-甲醇/氯仿)，并测定其物理性质，结果证明是本标题化合物。(ⅲ)合成3-[1-甲基-3-[N-(3-氯丙基)]-吡咯甲酰氨基]丙酸二环己胺盐(化合物9)在冰浴冷却和搅拌下，向在合成(ⅱ)中获得的粗产物(106.68g)的乙酸乙酯(390ml)溶液中滴加二环己胺(70.71g,390mmole)。将该反应混合物在冰浴下搅拌30分钟后，再在室温搅拌16小时，经过滤收集沉淀出的晶体，并减压干燥，由此得到本标题化合物(136.17g，基于1-甲基-3-吡咯甲酸的总产率是77％)。(ⅳ)合成5-(3-氯丙基)1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(化合物6)将五氧化二磷(494mg,3.48mmole)和甲磺酸(3.00g,31.2mmole)的混合物在90℃搅拌直至变均匀，然后冰冷却。在搅拌下向所得混合物中加入化合物9(1.36g,3mmole)，然后在90℃下加热搅拌30分钟。将反应混合物冰冷却。随后加入冰水(16g)，将所得混合物用氯仿萃取三次。合并氯仿层，用水和饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱柱分离纯化(洗脱液1％-甲醇/氯仿)，得到化合物6(635mg，产率83％)。
将该反应混合物减压浓缩，随后向残余物中加入半饱和碳酸钾水溶液。将所得混合物用氯仿萃取两次。合并有机层，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱柱纯化(洗脱液10％-甲醇/乙酸乙酯)，得到本标题化合物(1.02g，产率99％)。制备实施例9合成(±)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4-酮(化合物11)在冰浴和搅拌下，向化合物10(797mg,2mmole)的乙醇(30ml)溶液中分批加入硼氢化钠(757mg,20mmole)。将该反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌16小时。
向该反应混合物中加入水，将所得混合物在室温搅拌1小时，然后减压浓缩。向残余物中加水，用氯仿萃取。将有机层用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱柱分离纯化(洗脱液20％-甲醇/乙酸乙酯)，由此得到本标题化合物(710mg，产率89％)。IR(KBr/cm-1)3258,2820,1595,1509,1482,1432,1378,1287,1220,1162,1027,952,926,832,742,674。NMR(在CDCl3中测量，以TMS为内标，400MHz,δppm)1.82(2H,quint,J=7.3Hz),2.15-2.32(3H,m),2.44(2H,t,J=7.3Hz),2.60(4H,m),3.11(4H,m),3.34(1H,m),3.52(1H,m),3.59-3.70(2H,m),3.72(3H,s),4.91(1H,br.s),6.61(1H,d,J=2.9Hz),6.70(1H,d,J=2.9Hz),6.87(2H,m),6.95(2H,m)。制备实施例10通过手性酸来旋光拆分(±)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4-酮(化合物11)(合成化合物11的(-)-(S)异构体)在加热条件下，将化合物11(20.0g,50mmole)溶于甲醇(160ml)。冷却后，加入L-(+)-酒石酸(7.50g,50mmole)。向该反应混合物中加入晶种，然后在室温搅拌24小时。通过过滤收集沉淀出的晶体。得到了无色晶体(11.8g)。在加热条件下将这些晶体溶于DMF(59ml)中。冷却后，加入乙醇(59ml)。向该混合物中加入晶种，然后在室温搅拌21小时。收集沉淀出的晶体，得到了无色晶体(8.49g)。在搅拌下，把以上晶体加到冷却的1N氢氧化钠水溶液中，然后搅拌。用氯仿萃取反应混合物(两次)。合并有机层，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。
将由此得到的无色晶体在2-丙醇中重结晶两次，藉此获得了无色晶体(4.75g，产率24％)。熔点168.5-170.0℃比旋光度[α]D20-7.27(c=3.00,MeOH)用HPLC[色谱柱“CHIRALPAC AD 4.6φ×250mm”(商标，DaicelChemical工业有限公司产品)，柱温40℃，流动相己烷/乙醇/甲醇/二乙胺=70/10/20/0.1，流速0.4ml/min，检测波长240nm]对这些晶体进行分析，发现它们的旋光纯度达到99％e.e.或更高。进一步对这个化合物的L-(+)-酒石酸盐进行X-射线晶体结构分析，结果证实了它是(-)-(S)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4-酮[化合物11的(-)-(S)-异构体]。制备实施例11合成1,3-二甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(化合物12)向叔丁醇钾(1.62g,14.4mmole)和18-冠-6(317mg,1.2mmole)在THF(20ml)内的悬浮液中依次滴加3-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(2.12g,12mmole)的THF(20ml)悬浮液和碘甲烷(2.55g,18mmole)的THF(5ml)溶液，将该反应混合物在室温搅拌。24小时后，加入叔丁醇钾(0.81g,7.2mmole)和碘甲烷(1.28g,9.0mmole)的DMF(5ml)溶液，24小时后，再次加入叔丁醇钾(0.81g,7.2mmole)和碘甲烷(1.28g,9.0mmole)在DMF(5ml)中的溶液。随后将该反应混合物在室温搅拌3小时。
将该反应混合物减压浓缩，然后向残余物中加入饱和盐水。将所得混合物用乙酸乙酯萃取三次。将有机层合并，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱柱分离纯化(洗脱剂15％-丙酮/二氯甲烷)，然后用乙酸乙酯-己烷重结晶，由此得到本标题化合物(0.98g，产率43％)。制备实施例12合成5-(3-氯丙基)-1,3-二甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(化合物13)使用化合物12(0.96g,5mmole)、叔丁醇钾(1.12g,10mmole)、1-溴-3-氯丙烷(3.46g,22mmole)和THF(50ml)，按照制备实施例6的相似方式制得了本标题化合物(676mg，产率50％)。制备实施例13合成5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-1,3-二甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4,8-二酮(化合物14)采用化合物13(557mg,2mmole)、1-(4-氟苯基)哌嗪(541mg,3mmole)、碳酸钾(415mg,3mmole)、碘化钠(600mg,4mmole)和乙腈(30ml)，按照制备实施例8的相似方式制得了本标题化合物(662mg，产率80％)。制备实施例14合成5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1,3-二甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4-酮(化合物15)采用化合物14(600mg,1.45mmole)、硼氢化钠(600mg,15.9mmole)和乙醇(20ml)，按照制备实施例9的相似方式制得了本标题化合物(368mg，产率61％)。
在给药60分钟后，将每一只大鼠用乌拉坦(0.4mg/kg，腹膜内给药，Sigma化学公司产品)和α-氯醛糖(0.08mg/kg，腹膜内给药，NACALAI TESQUE公司产品)麻醉。为了将胶原给药到动脉中，经左颈动脉插入导管[“SP-31(商品名)，由Natsume Seisakusho有限公司生产]，使其末端位于髂动脉支点的近侧。这以后将鼠置于俯卧状，把其右后腿剥皮以便暴露出腹胫骨-趾骨-跖肌肉(gastrocnemius-plantaris-sole)(GPS肌肉)。将跟腱包扎，然后剪断，并连接在等轴张力测量仪〔“CBE-1 10kg”(商品名)，MINEBEA有限公司制造〕上，以大约100g的静息张力保持其位置。把坐股神经暴露，进一步通过双极电极〔“M2-0550”(商品名)，M.T Giken有限公司制造〕按矩形脉冲刺激〔10V,0.5Ms,1Hz；“电子刺激器SEN-3201”(商品名)，Nihon Kohden公司制造〕。记录由电子刺激所产生的收缩力〔放大器“AP-620G”(商品名)，Nihon Kohden公司制造，记录仪“WT-645G”(商品名)，Nihon Kohden公司制造〕。
给药测试化合物90分钟后，也就是当开始电子刺激坐股神经后的5分钟，通过在20分钟内向腹主动脉不断注射(0.333ml/20min)胶原溶液〔20g/kg/min,“Collagenreagent Form”商品名，Moriya Sangyo公司制造〕来诱导收缩力下降(疲乏)。在收缩力的测量过程中保持鼠温，以及用生理盐水进行保护避免暴露肌肉和坐股神经干燥。关于测试化合物的效果，是在胶原注射20分钟后，根据所测量的收缩力而评价的。结果列于表1。
表1
以上结果显示出，本发明化合物通过口服给药，可以强烈抑制由肌肉局部缺血所引起的疲劳，而这种缺血是在活动时，是因为大动脉阻塞和血小板聚集所诱发；结果表明，具有血小板聚集抑制作用和血管收缩抑制作用的该化合物表现出作为间歇性跛行治疗剂的良好药效。
将每一个采集的血样在190g转速下室温离心7分钟，收集富含血小板的上层血浆(PRP)。余下的血样再在1,500g转速下离心10分钟，然后收集缺少血小板的上层血浆(PPP)。采用胶原〔终浓度0.03至5μg/ml,“Collagenreagent Form”(商品名)，Moriya Sangyo有限公司产品〕和5-羟色胺〔最终浓度1μM,5-羟色胺盐酸盐，SigmaChemical公司产品〕作为血小板预凝聚剂(proaggre cant)，采用Born比浊法测定血小板聚集能力。以PPP作为对照，在37℃下，向PRP中加入氯化钙(NACALAI TESQUE公司产品)溶液直至最终浓度为1mM。两分钟后加入预凝聚剂。用血小板聚集测量仪〔“PAM-8C”(商品名)，MEBANCS公司制造〕测量在随后的十分钟发生的透过率变化，以记录的最大值为血小板聚集的比率(％)。关于胶原浓度的设定，使用给药测试化合物前的PRPs，并且对每只狗设定当单独加入胶原时不能引起血小板聚集、但是当同时加入胶原和5-羟色胺时会造成50％或更高的血小板聚集的最小浓度。有关聚集抑制比率是，试验化合物给药后的聚集比率相对于给药前聚集比率的百分比。结果列于表2。
表2
从以上结果可见，本发明化合物在口服给药时，可长时间维持其血小板聚集抑制作用。
向PRP中加入等量的缓冲液A(25mM Tris-HCl,130mM NaCl,1.5mMEDTA,pH 7.4)，将该混合物在4℃下以1,500g(3,000rpm)转速离心10分钟。将由此所得血小板沉积物在缓冲液A中重悬，然后在4℃下以1,500g(3,000rpm)离心5分钟。将所得血小板沉积物在缓冲液B(25mM Tris-HCl,130mM NaCl,0.3mM EDTA,pH 7.4)中再次重悬，随即按同样条件离心。最后将所得血小板沉淀物悬浮于缓冲液C(25mMTris-HCl,130mM NaCl,0.1％葡萄糖，0.1％BSA,pH 7.4)(按1ml缓冲液C4ml PRP的比例)中，由此得到了冲洗过的血小板悬浮液。
向所得被冲洗过的血小板悬浮液中加入1mM CaCl2(NACALAITESQUE公司产品)和0.2U/ml凝血酶(Mochida制药有限公司产品)。将所得混合物在37℃振摇5分钟，由此引起血小板聚集。将该混合物在4℃下以1,500g(3,000rpm)转速离心10分钟，使聚集物沉积下来。上清液用作实验中的聚集血小板上清液。
另一个方面，从已采集过血的兔子切割各种血管(冠状动脉、基底动脉、肠系膜动脉、肾动脉和股动脉)。在立体视显微镜下制备螺旋条带制备物(长大约20mm，宽1至2mm)。在填充有已经用95％O2+5％CO2混合气体饱和并在37℃加热的Tyrode溶液(5.4mM KCl,136.9mM NaCl,2.7mM CaCl2·2H2O,0.5mM Mgcl2·6H2O,11.9mM NaHCo3,0.45mM NaH2PO4·2H2O,5.5mM葡萄糖)的Magnus圆筒中(7ml)中，在0.5g负载下将血管条带制备物悬挂，将其上末端通过丝线分别连接在等长传感器〔“UL-10GR”(商品名)，MINEBEA有限公司制造，或者“TB-612T”(商品名)，Nihon Kohden公司制造〕上。
当血管条带制备物放置大约1小时、并且它们的静息张力确认已经稳定后，用等长传感器测量血管条带制备物的张力。关于每一个血管条带制备物，在加入30mM KCl(NACALAI TESQUE公司产品)确认了收缩反应之后，将血管条带制备物用Tyrode溶液冲洗，以使其张力恢复到先前水平。将血管条带制备物放置30分钟或更长时间、并且使其稳定后，加入聚集过的血小板上清液(1/100倍稀释液)。证实了张力收缩后，以1到1,000nM浓度向Magnus圆筒中加入(-)-(S)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3,2-c]氮杂-4-酮(测试化合物a)，研究其对抗收缩反应的松弛作用。假设在加化合物前的收缩比是100％，那在达到50％放松度时，测定其有效浓度(EC50)。结果列于表3。
表3
从以上结果可见，本发明化合物可以抑制由于聚集过的血小板上清液所引起的血管收缩。
工业实用性间歇性跛行治疗药物，其中含有式(Ⅰ)吡咯并氮杂或其可药用盐作为活性组分，这种药物可以对以下患者给药，即主诉间歇性跛行或可能患有间歇性跛行的患者。间歇性跛行患者的实例是有外周循环紊乱和慢性动脉阻塞疾病的患者，例如，闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎患者。本发明的间歇性跛行治疗药物可用于预防或治疗这类疾病。
权利要求
1．间歇性跛行治疗药物，其中含有选自吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐的化合物作为活性组分，所述吡咯并氮杂衍生物由下式(Ⅰ)表示 其中虚线表示存在或不存在化学键；当虚线所示的键存在时，X不存在，而当虚线所示的键不存在时，X代表氢原子、羟基或OR1基团，其中R1代表取代或未取代烷基；Y代表直链或支链、取代或未取代烷基；Z1和Z2可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基或卤素原子；W表示氢原子或甲基。
2．权利要求1的治疗药物，其中含有吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐作为活性组分，所述吡咯并氮杂衍生物由式(Ⅰ)表示，其中虚线所示键不存在，W是氢原子，且X是羟基。
3．权利要求1或2的治疗药物，其中含有吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐作为活性组分，所述吡咯并氮杂衍生物由式(Ⅰ)表示，其中虚线所示键不存在，W是氢原子，X是羟基，Z1是氢原子，且Z2是卤素原子。
4．权利要求1-3任一项的治疗药物，其中含有(±)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3，2-c]氮杂-4-酮或其可药用盐作为活性组分。
5．权利要求1-3任一项的治疗药物，其中含有(-)-(S)-5-[3-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]丙基]-8-羟基-1-甲基-1,4,5,6,7,8-六氢吡咯并[3，2-c]氮杂-4-酮或其可药用盐作为活性组分。
6．权利要求1-5任一项的治疗药物，用于治疗或改善由外周循环紊乱引起的间歇性跛行。
7．权利要求1-5任一项的治疗药物，用于治疗或改善由慢性动脉阻塞疾病引起的间歇性跛行。
8．权利要求1-5任一项的治疗药物，用于治疗或改善由闭塞性动脉硬化引起的间歇性跛行。
9．权利要求1-5中任一项的治疗药物，用于治疗或改善由血栓闭塞性脉管炎引起的间歇性跛行。
10．权利要求1-9中任一项的治疗药物，所述药物是口服给药制剂。
11．治疗或改善间歇性跛行的方法，包括对间歇性跛行患者给药吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐，所述吡咯并氮杂衍生物由下式(Ⅰ)表示 其中虚线表示存在或不存在化学键；当虚线所示的键存在时，X不存在，而当虚线所示的键不存在时，X代表氢原子、羟基或OR1基团，其中R1代表取代或未取代烷基；Y代表直链或支链、取代或未取代烷基；Z1和Z2可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基或卤素原子；W表示氢原子或甲基。
12．权利要求11的方法，其中所述吡咯并氮杂衍生物(Ⅰ)或其可药用盐是通过口服给药的。
13．吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐在制备间歇性跛行治疗药物中的应用，所述吡咯并氮杂衍生物由下式(Ⅰ)表示 其中虚线表示存在或不存在化学键；当虚线所示的键存在时，X不存在，而当虚线所示的键不存在时，X代表氢原子、羟基或OR1基团，其中R1代表取代或未取代烷基；Y代表直链或支链、取代或未取代烷基；Z1和Z2可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基或卤素原子；W表示氢原子或甲基。
14．权利要求13的应用，其中所述应用是在制备间歇性跛行口服治疗药物中的应用。
15．慢性循环紊乱预防或治疗药物，其中含有选自吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐的化合物作为活性组分，所述吡咯并氮杂衍生物由下式(Ⅰ)表示 其中虚线表示存在或不存在化学键；当虚线所示的键存在时，X不存在，而当虚线所示的键不存在时，X代表氢原子、羟基或OR1基团，其中R1代表取代或未取代烷基；Y代表直链或支链、取代或未取代烷基；Z1和Z2可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基或卤素原子；W表示氢原子或甲基。
16．闭塞性动脉硬化预防或治疗药物，其中含有选自吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐的化合物作为活性组分，所述吡咯并氮杂衍生物由下式(Ⅰ)表示 其中虚线表示存在或不存在化学键；当虚线所示的键存在时，X不存在，而当虚线所示的键不存在时，X代表氢原子、羟基或OR1基团，其中R1代表取代或未取代烷基；Y代表直链或支链、取代或未取代烷基；Z1和Z2可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基或卤素原子；W表示氢原子或甲基。
17．血栓闭塞性脉管炎预防或治疗药物，其中含有选自吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐的化合物作为活性组分，所述吡咯并氮杂衍生物由下式(Ⅰ)表示 其中虚线表示存在或不存在化学键；当虚线所示的键存在时，X不存在，而当虚线所示的键不存在时，X代表氢原子、羟基或OR1基团，其中R1代表取代或未取代烷基；Y代表直链或支链、取代或未取代烷基；Z1和Z2可相同或不同，并分别独立地代表氢原子、羟基或卤素原子；W表示氢原子或甲基。
全文摘要
用于治疗间歇性跛行、慢性动脉阻塞疾病、闭塞性动脉硬化和血栓闭塞性脉管炎的药物,其中含有吡咯并氮杂衍生物或其可药用盐作为活性组分。这些吡咯并氮杂衍生物由下式(Ⅰ)表示,其中虚线表示存在或不存在化学健;当虚线所示的健存在时,X不存在,而当虚线所示的键不存在时,X代表氢原子、羟基或OR
文档编号A61K31/55GK1297351SQ00800364
公开日2001年5月30日 申请日期2000年2月17日 优先权日1999年2月17日
发明者绪方淳人, 猪俣则夫, 水野章 申请人:三得利株式会社