专利名称：全反式维甲酸在制备治疗心肌肥大和血管壁增生药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,atRA)的用途，具体涉及在制药领域中的应用。
心肌肥大与重构是心脏对血流动力超负荷的一种适应性反应。在压力超负荷及其它一系列病理因素的刺激下，心肌组织通过启动肥大反应来适应增加了的做功需求，结果导致心肌组织重构。重构的心肌在大体解剖上表现为心室壁增厚，伴有间质细胞增生及胶原蛋白的沉积，心脏顺应性减小，泵血功能减弱。研究表明，心肌肥大与重构是心血管疾病的独立危险因子。虽然心肌肥大与重构最初是代偿性的，但最终会发展至失代偿而导致心功能障碍及心力衰竭，是心脏病发病率及心脏病人死亡率升高的重要危险因素之一，阻断重构进程能延缓或防止心功能不全继续恶化，提高存活率。
关于心肌肥大病因学的大量研究揭示，血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,ANGⅡ)是参与心肌肥大与重构的发生与发展的重要因子之一，从某种意义上说，ANGⅡ诱导的心肌细胞的肥大及重构过程是从终末分化的“成年心肌表型”向“胚胎心肌表型”转化的一个“去分化”过程。
本发明的目的在于提供atRA的新用途，即在制药中的新应用。实际上本发明涉及atRA在制备治疗或预防心肌肥大和小血管壁增生的药物中的应用。
全反式维甲酸的已知功能是用于治疗恶性肿瘤，主要是早幼粒细胞性白血病，近年来报道对肝癌、肺癌等实体肿瘤也有效。但至今未见对高血压引起的心肌肥大和血管壁增生有作用的报导。全反式维甲酸的结构式 化学名(全-E型)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基-1-环已-1-烯基)-2,4,6,8-壬四烯酸为了更好地理解本发明的实质，下面将用atRA在实验动物模型的试验及结果，说明其在制药领域中的新用途。应用培养的新生大鼠心脏成纤维细胞及心肌细胞，观察ANGⅡ或atRA处理对成纤维细胞的增殖、心肌细胞的蛋白含量、收缩蛋白MHC亚型的表达、细胞超微结构和胞内游离钙含量等的影响，和全反式维甲酸对ANGⅡ诱导的心肌肥大反应的效应。并在高血压动物模型中研究了atRA对于心肌肥厚和血管壁增生的作用。
1、实验材料(1)实验动物分别0-2天龄和250-300gWistar大鼠，雌雄不拘，由上海医科大学实验动物部提供。
(2)药品及试剂培养基DMEM及F12干粉，GIBCO产品。培养基DMEM及F12各一袋(1升装),N-2-羟乙基哌嗪-N｀-2-乙磺酸(N-2-Hydroxy-ethylpiperazin-N｀-2 etharesuifonic acid,HEPES,AMRESCO)3g，加新鲜三蒸水至2000ml,pH值调至7.2-7.3，用金属滤器抽滤除菌，-20℃储存备用。
D-hanks液(g/l):KCl 0.4,KH2PO40.06,NaCl 8.0,NaHCO30.35,Na2HPO4·12H2O 0.008,Glucose 5.0，用新鲜三蒸水配制，pH值调至7.2-7.3，用金属滤器抽滤除菌，4℃储存备用。
消化液胰蛋白酶(1∶250,Sigma进口分装)用D-hanks液配成0.1％溶液，抽滤除菌后，-20℃储存备用。
5-溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine,BrdU),AMRESCO进口分装，用新鲜三蒸水配成10mmol/L贮存液，Φ35mm醋酸纤维滤膜滤过除菌，-20℃贮存备用。
特级小牛血清中国科学院上海细胞生物学研究所产品，56℃灭活30分钟，分装后-20℃贮存备用。
无血清培液MDEM/F12(1/1)，牛血清白蛋白2g/L，胰岛素10μg/ml，转铁蛋白10ug/ml，维生素C100μmol/L，维生素B12,1.5μmol/L,L-谷氨酰胺1g/L，青霉素100U/L，链霉素100μg/l,HEPES15mmol/L。
含血清培液临用前在无血清培液中加入10％特级小牛血清。
FLUO3/AM:CALBIOCHEM公司产品PLURIONIC F-127:CALBIOCHEM公司产品其它试剂均为市售分析纯产品。
将ANGⅡ(市售)溶于三蒸水配成10-4mol/L储存液，抽滤、分装后保存于-80℃。临用前融解加入培养液中至所需浓度。由于心脏成纤维细胞及心肌细胞中都存在内源性的血管紧张素酶，因此每12小时重新加入相应剂量的ANGⅡ。
避光称量atRA，溶于DMSO中，配制成10-2mol/L储存液，分装后保存于-80℃。临用时加入培养液中至所需浓度，每48小时换为含有新鲜药物的培养液继续培养。对照组加入相同剂量的atRA助溶剂DMSO。注意避免在日光灯下操作。(3)实验仪器二氧化碳恒温培养箱(Heraeus BB6220 Germany)超净工作台(Heraeus HS12 Germany)倒置相差显微镜(XD-101型倒置生物显微镜，南京江南光电(集团))恒温磁力搅拌器(90-1型恒温磁力搅拌器，上海沪西分析仪器厂)微量移液器(epμendorf Reference,10,100,100μl)-80℃深低温冰箱(Heraeus HFU 486 PLUS-V14)-20℃冰箱 (上菱BCD-234WB，上海上菱冰箱厂)电泳仪(DY-A电泳仪，上海康达电子仪器厂)低速离心机(80-2离心沉淀器，上海手术器械厂)
高速离心机 (Heraeus Megafuge 2.0R)2、实验方法(1)心肌细胞的原代培养A、心肌组织消化取0-1天的Wistar大鼠15-20只，经麻醉及皮肤消毒后放入超净台。剪开胸廓，迅速将心脏近心端的2/3剪下放入冷d-Hanks液中。洗净残血后，用眼科剪将心肌组织剪成1-2mm3的碎块。用约10ml0.1％胰蛋白酶在37℃水浴中预消化10分钟后弃上清，重复2次。
B、细胞的解离和培养加10-15ml0.1％胰蛋白酶溶液于预消化后的心肌组织中，37℃消化解离15分钟。小心地将上清吸出，收集于离心管中，每管加入1/20体积(0.3ml左右)的特级小牛血清以终止胰酶消化，于1500rpm离心3分钟。小心倾去上清，加入2ml含10％特级小牛血清的DMEM/F12(1/1,V/V)培养基，吹打混匀。重复上述细胞解离步骤至心肌组织块基本消化完全。收集全部解离细胞并吹散均匀后，将细胞悬液接种于100ml培养瓶中，每瓶10ml。放入5％CO2、37℃培养箱中培养。
图1A显示经胰蛋白酶解离后的细胞，主要包括心肌细胞和心脏成纤维细胞，均呈圆形或椭圆形。
C、心肌细胞的分离和培养由于心肌细胞在100ml培养瓶中培养1小时后较心脏成纤维细胞不易贴壁，因此，利用二者贴壁时间差可得到高纯度的心肌细胞。将上述步骤中所得解离细胞贴壁培养1小时后，小心吸出未贴壁细胞，收集于一无菌锥形瓶中。用0.4％苔盼蓝染色计数后将细胞悬液的浓度调整至5×105个/ml，将细胞悬液接种于六孔板中，每孔2ml，于5％CO2、37℃培养箱中培养，即得纯度为90-95％的心肌细胞。在培养液中加入BrdU贮存液(0.1mM)以抑制成纤维细胞的增殖。培养24小时后换液一次，再培养24小时后换为无血清培液，24-36小时后进行相应实验。图1B为培养的心肌细胞。
D、心脏成纤维细胞的纯化和培养将已贴壁的细胞(大多数为成纤维细胞)用5ml含10％特级小牛血清的培养液吹打重悬，在5％CO2、37℃培养箱中使细胞贴壁30分钟。弃上清，重复1次，再加入含10％特级小牛血清的培养液，放入5％CO2、37℃培养箱中培养。每三天换液一次，至80-90％汇合时按1∶3传代，到第三代时即得纯净的心脏成纤维细胞。取第4代的心脏成纤维细胞，无血清处理24小时后进行相应实验。
(2)培养新生大鼠心脏成纤维细胞的生长曲线培养的心脏成纤维细胞在近汇合状态时，经0.125％的胰蛋白酶消化后，用2ml含10％小牛血清的DMEM/F12培养液吹打重悬。细胞计数后以4,000个细胞/孔接种于96孔板中，在含10％小牛血清的培养液中培养12小时。弃去培养液，用无血清培液小心冲洗两次后换为无血清培养液继续培养24小时。然后加入相应浓度的ANGⅡ和/或atRA处理24小时。处理结束时，弃去培液并小心地用PBS洗两次后用4％甲醛固定1小时，PBS洗两次后用0.5％的结晶紫室温染色2小时。用蒸馏水洗净残余染料后，用36％乙酸溶解细胞。96孔板用酶标仪于650nm波长处扫描得各孔吸光值，该吸光值与细胞数呈正比。结果以均数±标准误表示(n=6)。
(3)培养新生大鼠心肌细胞的总蛋白含量测定心肌细胞的原代培养同前。心肌细胞悬液经0.4％苔盼蓝染色后用血细胞计数器计数3-5次，取平均值。将细胞浓度调整至5×105个/ml，充分混匀后用微量移液器将细胞接种于六孔板中，每孔2ml，再分别轻轻吹打使分散均匀。无血清培养24-36小时后，按实验要求分别或同时向培液中加入ANGⅡ或atRA贮存液，各贮存液均按1∶1000稀释，使终浓度分别为ANGⅡ10-6M,atRA10-7M、10-6M或10-5M。将六孔板取出，弃去培液后立即置于冰上，每孔用2ml冷PBS轻柔地洗两次，弃去洗液并吸净残余的液体。每孔加入100ul2％SDS裂解细胞，用细胞刮将粘稠的细胞裂解物收集于一个微量离心管中。用23号针头将样品吹打数次。将样品置于沸水浴中加热10分钟，得澄清的细胞总蛋白液。用改良Lowry法进行蛋白定量。(4)心肌细胞超微结构观察A取材用细胞刮将贴壁培养的心肌细胞刮下，离心收集B固定2.5％戊二醛(磷酸缓冲液配制)固定 2小时
0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分钟×3次1％锇酸固定液固定 2-3小时0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分钟×3次C脱水 50％乙醇 15-20分钟70％乙醇(含有3％醋酸铀) 过夜90％乙醇 15-20分钟90％乙醇/90％丙酮(11)15-20分钟90％丙酮 15-20分钟以上各步骤皆在4℃冰箱内进行100％丙酮室温 15-20分钟×3次D浸透 纯丙酮+包埋液(2∶1)室温3-4小时纯丙酮+包埋液(1∶2)室温 过夜纯包埋液37℃ 2-3小时E固化 37℃烘箱内过夜45℃烘箱内 12小时60℃烘箱内 24小时F切片 LKB-1 型超薄切片机切片 50-60nmG枸橼酸铅染色H JEM-1200EX透射电镜观察、拍照。(5)培养新生大鼠心肌细胞胞内游离钙含量测定A、配制标记贮存液用DMSO溶解FLUO3/AM配成1mM的贮存液，保存于-20℃备用。以无血清DMEM/F12培养液配制20mg/ml的牛血清白蛋白10ml,-20℃保存备用。实验前配制标记贮存液10份1mMFLUO3/AM贮存液+15份10％Pluronic F-12溶液+975份20mg/ml的牛血清白蛋白。将配好的标记贮存液放入培养箱中温育至37℃。
B、标记游离Ca2+将心肌细胞接种于盖玻片上制成细胞爬片，用无血清培液培养24小时后，取出盖玻片，放入无菌的35mm表面皿中，加入一定量的DMEM/F12无血清培养液。将预热至37℃的标记贮存液按1∶3(V/V)与表面皿内的培养液混匀，放入37℃培养箱中孵育30分钟。吸出表面皿内的培养液弃去，加入2ml无血清DMEM/F12培养液，放入37℃培养箱中孵育5-10分钟。重复漂洗步骤两次。
C、荧光显微镜观察在载玻片上滴一滴培养液，将长有细胞的盖玻片盖于载玻片上，再封上一片盖玻片，用荧光显微镜于506nm左右处观察并拍照后经Leica图像分析系统处理。结果以图像的荧光积分光密度来表示，背景本底由未经FLUO3/AM标记的心肌细胞的荧光强度确定并从结果中剔除。(6)atRA在整体动物模型中对心肌肥厚和血管增生的作用两肾一夹(2K1C)肾性高血压大鼠模型，取250克左右的雄性Wistar大鼠，用3％水合氯醛(1ml/100g，腹腔注射)麻醉，在左侧肾动脉起始部位安置银夹(内径约0.25mm)，右肾保存完好。
术后定期测量尾动脉血压，选术后第6周时收缩压升高超过25mmHg的大鼠分入各实验组。
入选的高血压大鼠随机分入以下各实验组对照组以1ml/kg体重/天的剂量给以植物油atRA组以30ml/kg体重/天的剂量给以atRAatRA混悬于植物油中，浓度为30mg/ml；给药方式为经口灌胃，为期8周，然后通过颈动脉插管记录大鼠的清醒状态下的血压、心率。记录结束后取心、脑、肾、肝、脾、肠系膜上动脉作组织学检查。3、实验结果(1)atRA抑制ANGⅡ诱导的心脏成纤维细胞的增殖应用不同浓度的ANGⅡ从10-10M到10-7M处理经无血清培养24小时的心脏成纤维细胞。结果显示，ANGⅡ处理24小时可以使培养的心脏成纤维细胞数目显著增加。这种效应呈剂量依赖性，在10-8M时ANGⅡ的作用达到最大。
用10-8M ANGⅡ处理24小时可使处理组的成纤维细胞数目增加至对照组的1.64倍(P＜0.05)。用atRA(10-7M、10-6和10-5M)与ANGⅡ共同处理，则细胞数分别为对照组的1.47倍、1.22倍和1.05倍(P＜0.05)，提示atRA可剂量依赖性地抑制ANGⅡ诱导的成纤维细胞增殖。
用不同浓度的atRA分别处理无血清培养的心脏成纤维细胞，24小时后各处理组细胞数目与对照组相比都没有显著性差异(P＞0.05)。
以上结果说明，atRA本身对成纤维细胞的增殖没有明显影响，但它可以显著抑制ANGⅡ促进的心脏成纤维细胞细胞增殖。
(2)atRA抑制ANGⅡ诱导的心肌细胞总蛋白含量的增加在无血清培液中，用10-6M ANGⅡ处理心肌细胞5天，可使心肌细胞的总蛋白含量比对照组增加30％(n=15,P＜0.05)。若同时给予10-6M atRA处理，则可显著抑制ANGⅡ诱导的心肌细胞总蛋白含量的增加(n=15,P＜0.05)；而10-6M atRA本身对于培养的心肌细胞的蛋白含量没有明显的影响(n=15,P＞0.05)。细胞计数结果显示，对照组与各处理组之间细胞数目没有明显差别(n=4,P＞0.05)。
实验中还发现，大剂量atRA(10-5M)可使ANGⅡ处理组以及对照组的蛋白含量都显著降低。提示大剂量的atRA(10-5M)不但可以抑制ANGⅡ的诱导心肌细胞总蛋白质含量增加的作用，而且可以减低心肌细胞的基础蛋白含量。
(3)atRA在高血压动物模型中可减轻心肌肥厚和小血管壁增生的程度。
从以上结果，可以得出本发明的优点在于1、本发明对已知atRA发掘了新的医用用途，开拓了一个新的应用领域。
2、本发明的物质atRA可以显著抑制ANGⅡ促进心脏成纤维细胞的增殖。
3、本发明物质atRA可以抑制ANGⅡ诱导的心肌细胞总蛋白含量增加的作用，还具有可以减低心肌细胞的基础蛋白含量的功能。
4、atRA可对抗ANGⅡ对培养的大鼠心肌细胞超微结构的影响，可以抑制ANGⅡ诱导的心肌细胞内肌丝及高尔基体的增多，对肌小节结构的改变没有什么明显的影响。
5、atRA影响ANGⅡ诱导的培养大鼠心肌细胞胞内游离钙水平的变化，可以部分抑制ANGⅡ所引起的心肌细胞胞内游离钙的增加。
6、本发明atRA配制成的药物具有抑制高血压引起的心肌肥厚和小血管壁增生的功能。
权利要求
1.全反式维甲酸在制备治疗高血压引起的心肌肥厚药物中的应用。
2.全反式维甲酸在制备治疗小血管壁增生药物中的应用。
3.全反式维甲酸在制备治疗心脏成纤维细胞增生药物中的应用。
4.全反式维甲酸在制备治疗心肌细胞肥大药物中的应用。
5.全反式维甲酸在制备作用于心脏的钙拮抗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及全反式维甲酸的用途，具体涉及在制药领域中的应用。本发明的物质atRA可以显著抑制引起心肌肥厚和小血管壁增生等诸多病理因素，如抑制心脏成纤维细胞的增殖；抑制心肌细胞总蛋白含量增加；还可抑制ANGⅡ所引起的心肌细胞胞内游离钙的增加。为治疗高血压引起的心肌肥厚和小血管壁增生提供了新用途。
文档编号A61P43/00GK1317311SQ01105248
公开日2001年10月17日 申请日期2001年1月18日 优先权日2001年1月18日
发明者朱依纯, 姚泰, 王浩杰, 吕雷, 丁滢泂 申请人:复旦大学