专利名称：一种环菠萝蜜烷三萜皂甙新化合物及其在免疫抑制和肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从铁破锣全草或根茎中提取分离的一种新化合物及其衍生物，其骨架属于环菠萝蜜烷型三萜皂甙；本发明还涉及该化合物在制备药物方面的用途，特别是在制备器官移植方面的免疫抑制剂、血管生成抑制药物以及抗肿瘤药物等领域。
背景技术：
铁破锣[Beesia calthaefolia(Maxim.)Ulbr.]系毛茛科铁破锣属(Beesia)植物；是一种民间常用草药，也是我国特有的药用植物。其根茎或全草药用，具有清热解毒，凉血，活血，消肿，镇痛，散风寒的功效；民间用来治疗风寒感冒，风湿关节痛，红白痢疾，咽喉肿疼，头痛，牙痛等病，外敷治疗疮疖和毒蛇咬伤。
发明内容
本实验室利用现代分离技术和结构测定手段对铁破锣进行化学成分研究过程中，从中分离得到一系列结构新颖的单体化合物，通过活性筛选，发现这些单体化合物具有很强的药理活性。本发明的目的之一是提供一种通式(1)的新化合物及其衍生物。许多医学家认为，临床上器官移植的成功很大程度上归功于一种天然产物—环孢菌素，环孢菌素和其它10余种非肽类药物已经有效地进入临床或临床前开发阶段，天然产物因此成为器官移植方面免疫抑制剂的重要源泉。其中R1为β-D-xylopyranosyl，R2为COCH3的式(1)化合物(简称化合物I)，该化合物在小鼠体内试验可明显抑制由ConA诱导的T细胞增殖，具有免疫抑制作用，是一种免疫抑制剂。另外通过深入的药理活性筛选发现该化合物I还具有抑制微血管生成方面的活性(20μg/ml)和抑制成骨细胞增殖的活性(IC50＝32.78μg/ml)。
本发明所涉及的式(1)化合物，迄今为止，尚未发现有相关专利或文献报道。本发明的目的之二是提供一种通式(1)的新化合物及其衍生物在制备药物方面的用途；特别是在制备器官移植方面的免疫抑制剂、血管生成抑制药物、以及抗肿瘤药物等领域。
本发明的技术方案依此包含如下步骤以铁破锣[Beesia calthaefolia(Maxim.)Ulbr.]根茎(3.5Kg)为原料，经用95％乙醇回流提取两次，每次两小时；药渣再用50％乙醇回流两次，每次两小时，合并两次提取液后，回收溶剂，得浸膏。将浸膏用水溶解，依次用氯仿、正丁醇萃取，得氯仿萃取物292g。氯仿萃取物用硅胶柱H低压柱层析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱(9∶1∶0-8∶2∶0-7∶2.5∶0.5-6∶3∶1)，每份2000ml，共收集16份，其中8-11份(70g)，再次用硅胶柱H低压柱层析，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱(10∶0-8∶2)，每份2000ml，共收集7份，其中1-2份合并，经制备薄层层析(石油醚-乙酸乙酯-甲醇5∶4∶0.4展开7次)得到-白色无定形粉末，TLC检查为单一斑点，得到R1为β-D-xylopyranosyl，R2为COCH3的式(1)化合物(即化合物I，1.25g)。
化合物I，白色无定型粉末，mp.196-200℃(CHCl3-MeOH)，[α]D20-11.3°(CHCl3∶MeOH 1∶1，c，0.12)，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性，薄层水解检识有木糖。FAB-MS(见图1)显示m/z 685[M+Na]+，高分辨质谱(HR FAB-MS)给出m/z663.408993[M+H]+，[Calcd 663.410824]，确定其分子式为C37H58O10，不饱和度为9。
IR谱(见图2)在3600-3100及1040，1090cm-1出现强吸收峰，示甙类化合物；在1735，1240cm-1显示强吸收带，表明分子结构中含乙酰基。1H NMR(见图3)和13C NMR谱(见图4)表明该化合物是一个9，19-环菠萝蜜烷型三萜木糖甙，且含有一个乙酰基和一个缩酮碳(表1)。
1H NMR谱高场区显示一对AB系统质子的信号[δ0.25(1H，d，J＝4.0Hz，19-H)，0.43(1H，d，J＝4.0Hz，19-H)]，七个叔甲基质子的单峰信号[δ1.06，1.08，1.39，1.47，1.58，1.64]和一个乙酰基质子信号[δ2.09]。糖的端基氢信号出现在δ4.86(1H，d，J＝7.5Hz)说明甙键为β构型。低场区除了木糖质子信号外，还显示一对ABX系统信号[δ1.82(1H，d，J＝7.0Hz，H-17)；4.47(1H，dd，J＝7.0，2.0Hz，H-16)；5.67(1H，d，J＝2.0Hz，H-15)]，1H-1H COSY谱中(见图5)，H-16与H-15，H-17两质子相关；HMQC谱中(见图6)，H-15，H-16和H-17三质子信号分别与碳谱中δ86.23(C-15)，79.86(C-16)和51.19(C-17)相关。
13CNMR谱显示37个碳信号，糖的端基碳出现在δ107.64，低场区除了木糖碳和C-3信号外，还显示3个连氧碳信号[δ72.03，82.44和110.70]；与beesioside II，IV比较，δ72.03可归属为C-25。根据化合物的不饱和度，扣除9，19环菠萝蜜烷型四环三萜母核、一个糖环和一个乙酰基，分子结构中还应有2个环系。分子结构中连氧季碳[δ82.44]，缩酮碳[δ110.70]和连氧叔碳[δ79.86(C-16)]提示分子结构中存在16β，24和20，24双环氧结构，因此该化合物的平面结构得以确定，同beesioside IV比较，差别在于12位无羟基取代；结合1H-1H COSY，13C-1H COSY和与beesioside IV比较，所有的碳氢信号都得以归属(表1)。 化合物I分子模型显示，若C-20为R构型，C-24也应为R；若C-20为S构型，C-24也应为S。Sakurai N等通过将观察到的1H-1H偶合常数(J1516，J16，17)与根据Karplus公式计算值比较确定了化合物beesiosideIV中C-15，20和24的立体化学。如果C-20和24为R构型，那么H-16和H-17之间的偶合常数应为4.3Hz(船式)或7.2Hz(椅式)；如果C-20和24为S构型，那么H-16和H-17之间的偶合常数应为7.5Hz(船式)或7.0Hz(椅式)。在20R，24R情况下，如果H-15是α构型，那么H-15和H-16之间的偶合常数应为7.2Hz(船式)或4.7Hz(椅式)；如果H-15是β构型，那么H-15和H-16之间的偶合常数应为0.4Hz(船式)或7.2Hz(椅式)。在20S，24S情况下，如果H-15是α构型，那么H-15和H-16之间的偶合常数应为5.4Hz(船式)或8.2Hz(椅式)；如果H-15是β构型，那么H-15和H-16之间的偶合常数应为7.5Hz(船式)或1.7Hz(椅式)。化合物gbc-18中，J15，16＝2.0，J16，17＝7.0Hz，因此确定C-15，20和24的立体化学为20S，24S和15α-OAc。
1HNMR谱中3位氢出现在δ3.50(1H，dd，J＝11.5，3.5Hz)，根据其裂分方式和偶合常数大小可判断3位氢为α构型。与beesioside IV之甙元比较其13CNMR谱中C-3位甙化位移值(低场位移10.59ppm)，确定木糖连在C-3位。
综合上述光谱分析，测定化合物I的结构为(20S，24S)-15α-acetoxy-16β，24；20，24-diepoxy-9，19-cyclolanostane-3β，25-diol-3-O-β-D-xylopyranoside。
化合物I结构测定的实验数据IR(KBr)cm-13700-3100，2965，2930，2870，1735，1460，1380，1360，1240，1090，1040，965。FAB-MS m/z685(M+Na)+，665(M+H)+，535，453，115(100)，59，43。1H NMR和13C NMR数据见表1。
表1化合物I的1H NMR和13C NMR数据positi δ1H(J in Hz) δ13C posit δ1H(J in Hz) δ13Con ion1 1.22m；1.58m 32.40 19 0.25d(4.0) 30.110.43d(4.0)2 1.93m；2.35m 30.11 20 82.443 3.50dd(11.5，88.46 21 1.33s 25.753.5)441.33 22 2.00m；1.65m40.075 1.31m47.50 23 2.60m；1.98m28.576 0.67q(12.5) 20.96 24 110.707 1.02m；1.30m 26.02* 25 72.038 1.76dd(12.8，47.77 26 1.64s 25.475.0)919.65 27 1.47s 25.2110 26.42 28 1.39s 24.6411 2.10m；1.05m 26.08* 29 1.06s 15.3612 1.66m；1.05m 33.13 30 1.08s 13.6613 46.54 COCH32.09s 21.4714 48.95 COCH3107.2815 5.67d(2.0) 86.23 1’ 4.86d(7.5) 107.6416 4.47dd(7.0，2.0) 79.86 2’ 4.03t(8.5) 75.5317 1.82d(7.0) 51.19 3’ 4.16t(8.5) 78.6318 1.58s21.55 4’ 4.23td(8.5，5.0)71.2119 0.25d(4.0) 30.11 5’ 3.73t(9.5) 67.130.43d(4.0)4.36dd(11.0，5.0)
经药理学研究，化合物I体内试验具有较强的免疫抑制活性，体外试验具有较强的抑制血管生成活性和抑制成骨细胞增殖活性。
药效学试验方法一、免疫学实验1.实验材料与仪器小鼠Balb/c小鼠，雄性，18-20g体重；MTT四氮唑，购于Sigma公司；刀豆蛋白A购于Sigma公司；c-RPMI-1640细胞培养液每1000ml双蒸水中，含RPMI-1640干粉10.4克，NaHCO32克，L-谷氨酰胺0.3克，青霉素G100U/ml，链霉素100ug/ml，10％小牛血清，无菌过滤；细胞工作液0.01M pH7.2的Hank’s液；SRBC取脱纤维SRBC，用生理盐水洗至不溶血，最后取压积SRBC配成5％、10％的SRBC悬液；样品液准确称取样品化合物，用蒸馏水溶解(DMSO助溶)配成1mg/ml溶液，再以生理盐水稀释成10μg/ml后无菌过滤。实验时配制成不同浓度的待测药液。
Model 550酶标仪Microplate Reader Instruction ManualCatalog Number 170-6750CO2培养箱NAPCO Model 54102.实验方法取样品液给小鼠体内腹腔注射，同时设置对照组，连续给药七天后，分别无菌取脾，制备脾细胞悬液，作MTT法淋巴细胞转化实验，记录OD值。
2.1 小鼠脾细胞悬液的制备将小鼠拉颈处死，用75％乙醇浸泡1-2分钟，在超净台内无菌取脾，置盛有Hank’s液的平皿中于钢网上剪碎用针芯轻轻研磨，即成单细胞悬液。离心10分钟(1000rpm)，弃上清液后洗两次，进行细胞记数，细胞沉淀用c-RPMI1640培养液调至1×107/ml浓度。
2.2 MTT法淋巴细胞增殖反应实验新鲜分离的1×107/ml小鼠脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每空加入100μl，再根据实验设计加入刺激剂(ConA)100μl/孔，每个样品设三个平行孔并设对照孔(仅加c-1640)，每孔总体积200μl，然后将培养板置于37℃的5％CO2培养箱中培养48小时。取出培养板，每孔吸弃上清夜100μl，各孔加5mg/ml MTT 10μl，继续培养4小时。取出培养板，各孔加10％ SDS裂解液100μl，放培养箱中过夜，于570nm处酶标仪比色测定OD值，并计算转化值OD值。
3.实验结果MTT法淋巴细胞增殖反应实验结果见表2。
表2化合物I对ConA诱导的小鼠脾细胞淋巴细胞增殖的影响(OD值±SD)给药量 转化值OD± ΔOD组别(ng) SD空 0 0.617 -白对照化10 0.285±0.00 -0.368合物I 8化50 0.323±0.03 -0.294合物I 3T淋巴细胞在体外受到非特异性有丝分裂原(ConA)刺激后，能转化为体积较大、代谢旺盛并能进行分裂的淋巴细胞，在这一过程中，加入淡黄色的MTT可被还原成蓝紫色的MTT甲，产生的甲量与代谢水平呈正比。所以通过对溶解甲后蓝紫色液体透光度的比色，根据OD值即可判定淋巴细胞的增殖程度。
4.实验结论体内实验表明，单体化合物I在小鼠体内给药时可明显抑制由ConA诱导的T细胞增殖，具有免疫抑制作用，是一种免疫抑制剂。
二、鸡胚尿囊膜(CAM)试验1.实验目的观察单体化合物I对新生血管生成的影响2.实验材料及实验方法a.样品来源从铁破锣中分离得到的单体化合物I。
b.种蛋来源购自中国国防大学。
c.药品制备及对照0.5mg单体化合物I溶于75％乙醇37.5μl，再加生理盐水至总体积100μl，即得5mg/ml药液，等体积混合溶媒做阴性对照，1∶3氢考肝素混合液做阳性对照。
d.鸡蛋孵化将种蛋置恒温、恒湿(37℃，60％)孵化箱中孵化，72小时后打破蛋壳入100mm平皿中继续孵化72小时之后加药(见下)。
e.加药将上述5mg/ml浓度药液稀释至20μg/ml，溶媒对照做同样稀释后加在自制约2mm玻璃纤维滤纸片上，每片加药液3μl(药片)，将药片分别放在鸡胚尿囊膜血管分枝处，24小时后解剖显微镜下观察该处血管变化。
3.实验结果本实验结果加化合物I的药片处，血管发生自溶现象，无新生血管形成；溶媒对照药片处血管无变化；氢考-肝素药片处血管出现空白，无新生血管形成。
4.实验结论肿瘤细胞分裂增生迅速，肿瘤的生长伴随着微循环方面的血管增生，其营养成分是靠毛细血管运输的；鸡胚尿囊膜(CAM)试验旨在检验药品对微循环方面的影响，从这一角度评价和筛选抗肿瘤药物。本实验结果表明，单体化合物I有抑制微血管生成方面的活性。三、成骨细胞体外试验和对碱性磷酸酶的影响1.实验目的单体化合物I对Wistar大鼠头盖骨成骨细胞增殖的影响和对碱性磷酸酶的影响。
2.成骨细胞体外试验方法及步骤无菌条件下取新出生的Wistar大鼠头盖骨，分离出顶骨和额骨，在D-HankS液中剥离纤维性骨膜后，切碎，经0.25％胰蛋白酶消化15min，每3分钟振荡一次，弃去消化液，以0.1％I型胶原酶10ml在37℃，消化2次，每次60min，收集消化液，1000rpm离心5min，去上清，将细胞接种于含20％小牛血清F12培养液的培养瓶中，37℃5％CO2培养箱中培养，24h换液，2-3天待细胞铺满培养瓶时，传代培养，所用实验细胞均为第3-5代细胞，实验时用细胞浓度为3万细胞/ml。
步骤a.96孔平底中加入0.1ml细胞，37℃5％CO2培养24h。
b.每孔加入不同浓度含受试药液、溶剂或空白20μl，每孔加入F12完全培基80μl，整个反应体系为200μl，37℃培养72h。
c.换无血清培养液，每孔0.1ml。
d.加入20μl，5mg/ml MTT容液e.37℃孵育4h，f.吸出120μl，(倒掉)g.加入200μl二甲基亚砜，摇匀h.于570nm于酶标仪上测定各孔的吸光度值。
3.成骨细胞体外实验结果见表3及图7。
4.试验结论本实验结果表明，单体化合物I对成骨细胞具有抑制作用，抑制率IC50＝32.78μg/ml，另外对碱性磷酸酶活性实验还发现单体化合物I对碱性磷酸酶具有显著的抑制作用，抑制程度为“+”
图1化合物I的FAB-MS谱；图2化合物I的IR光谱；图3化合物I的1H-NMR谱；图4化合物I的13C-NMR谱；
图5化合物I的1H-1H COSY谱；图6化合物I的HMQC光谱；图7化合物I的成骨细胞抑制率。
表3化合物I的成骨细胞抑制实验结果
权利要求
1.一种环菠萝蜜烷三萜皂甙新化合物及其衍生物，其化学结构通式为 式中R1为H时，R2为H或-COCH3；R1为OH时，R2为H。
2.根据权利要求1的化合物及其衍生物，其中通式中R1为H，R2为-COCH3。
3.一种制备权利要求1或2的化合物及其衍生物的方法。
4.权利要求1或2所述化合物及其衍生物在制备治疗药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中的药物为免疫抑制剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其中的药物为血管生成抑制剂及抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明涉及从铁破锣全草或根茎中提取分离的一种新化合物及其衍生物,它具有式(1)化学结构通式和免疫抑制活性、抑制血管生成活性和抑制成骨细胞增殖活性,本发明还涉及该化合物及其衍生物在制备药物方面的用途,特别是在制备器官移植方面的免疫抑制剂,抑制血管生成方面的药物,以及抗肿瘤药物等领域。
文档编号A61P37/00GK1342656SQ01123448
公开日2002年4月3日 申请日期2001年7月25日 优先权日2001年7月25日
发明者杨峻山, 鞠建华 申请人:中国医学科学院药用植物研究所