专利名称：椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心血管疾病药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心血管疾病药物的应用，尤其涉及椒苯酮胺及其盐用作制备治疗心肌缺血、缺血再灌注损伤或心力衰竭药物的应用。
背景技术：
心力衰竭是心血管病的终末阶段，死亡率高。心肌梗死和心肌再灌注损伤是导致心力衰竭的重要原因。国内外的实验研究表示钙拮抗剂与自由基清除剂有治疗心肌梗死和对抗再灌注损伤的作用。然而，大多数钙拮抗剂抑制心肌收缩力，降低心脏功能，临床应用受到限制。自由基清除剂对心脏功能没有直接的影响，其临床效果尚未被确认。
心力衰竭的治疗原则是强心、扩血管和利尿。强心药通过增强心肌收缩力，提高心排出量，保持心、脑、肾等重要器官的供血；扩血管药和利尿剂通过降低心脏负荷，保护心脏功能。然而，强心甙、儿茶酚胺、磷酸二酯酶抑制剂(PDEI)等各类型强心药的毒副反应较大，因为它们主要通过增加细胞内钙离子浓度，达到增强心肌收缩力的效应，这就易导致细胞内钙超载，存在致心律失常的危险性。利尿剂常作为首选药用于心力衰竭，但是易引起电解质紊乱等副作用。近代的研究表示血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)有治疗充血性心力衰竭，对抗心肌缺血和再灌注损伤的作用，但其远期效果尚待观察。
总之，发展有效的，毒副反应小的，化学结构新型的，能治疗心血管病的新药是目前临床的迫切需要，并能有助于对心血管病的病理生理机制加深认识。
发明内容
本发明的目的在于提供椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心血管疾病药物的应用，所述盐酸椒苯酮胺或其药学上可接受的盐用作制备治疗心血管疾病药物的应用疗效明显、毒副反应小，在同类化合物或衍生物中具有突出的效果。
实际上本发明涉及椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心肌缺血药物的应用。
本发明还涉及椒苯酮胺或其盐用作制备治疗缺血再灌注损伤药物的应用。
本发明另外涉及椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心功能不全药物的应用。
其中所述的椒苯酮胺盐为药学上可接受的椒苯酮胺盐，包括椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺硫酸盐、椒苯酮胺磷酸盐、椒苯酮胺碳酸盐、或椒苯酮胺有机盐之一，以下列通式表示
优选具有下述结构的椒苯酮胺盐酸盐(也称为盐酸椒苯酮胺)
C21H24O4NCl＝389.5
以本发明优选的盐酸椒苯酮胺为例，合成方法为以胡椒乙胺为起始原料，经和苯甲醛缩合后，再与硫酸二甲酯反应形成N-甲基胡椒乙胺，加入HCl/EtOH溶液即得N-甲基胡椒乙胺盐酸盐。将N-甲基胡椒乙胺盐酸盐和对-羟基苄叉丙酮(对羟基苯甲醛在碱性条件下和丙酮经Claisen-Schmidt缩合反应即得对-羟基苄叉丙酮)、多聚甲醛在无水乙醇中，在酸性条件下经Mannich反应即可得到椒苯酮胺盐酸盐，用95％乙醇重结晶得盐酸椒苯酮胺纯品。具体过程表示如下
对羟基苄叉丙酮的合成
N-甲基胡椒乙胺盐酸盐的合成
盐酸椒苯酮胺的合成
使用时，本发明的椒苯酮胺或其药学上可接受的盐可以制成水剂、粉针、片剂或胶囊等，分别采用静脉注射、肌肉注射或口服的方法。用量为0.1-1.0mg/kg。
本发明通过药理研究发现，在一系列椒苯酮胺的类似物或衍生物中，椒苯酮胺及其药学上可接受的盐用作制备治疗心血管疾病药物应用时，具有明显的强心扩血管作用，对于实验性心力衰竭，心肌缺血与心肌再灌注损伤均有良好的防治作用。椒苯酮胺能增强心肌收缩力，改善心脏功能，却不增加心肌细胞内[Ca2+]，甚至还能对抗缺O2-复O2或再灌注损伤所致的心肌细胞内钙超载。对于心肌梗死或缺血-再灌注损伤的心脏，椒苯酮胺增加心肌供血，降低心肌氧消耗，增强抗氧化能力，改善心肌能量代谢，保持心脏功能。
本发明的研究从心脏生理功能、心肌生化及病理形态学等方面表明椒苯酮胺及其药学上可接受的盐是种既能对抗心肌缺血，保护心肌缺血-再灌注损伤，又能改善心脏功能的新型强心扩血管剂，它增加心肌收缩蛋白对钙的敏感性，却不增加心肌细胞内[Ca2+]，它不易导致心律失常，有利于多种心血管病的治疗。同时它又是治疗效果好、毒副反应较低的新化合物，其作用机制不同于已知的心血管病药物，且疗效优于已知的心血管病药物。
另外椒苯酮胺药学上可接受的溶于水，而其衍生物难溶于水，有利于药物吸收，因此在在一系列椒苯酮胺的类似物或衍生物中，椒苯酮胺及其药学上可接受的盐有可能发展成为治疗心力衰竭、对抗心肌缺血和再灌注损伤的新药。
此外，本发明的椒苯酮胺或其药学上可接受的盐的合成路线设计合理，合成工艺操作简便，原料易得，各步反应条件稳定，收率较稳定且无严重的三废污染。反应废液多为酸、碱溶液经简单处理即可排放，完全适合工业化生产的要求。
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明
图1. 盐酸椒苯酮胺对抗KCl致狗冠状动脉收缩量-效曲线；
图2. 盐酸椒苯酮胺对抗5-HT致狗基底动脉收缩量-效曲线；
图3. 椒苯酮胺对抗CaCl2致狗肠系膜动脉收缩量-效曲线；
图4. 椒苯酮胺(PKA)与米力农(Mil)对心肌收缩蛋白钙敏感性的影响，与对照组比较**P＜0.01 ***P＜0.001；
图5.椒苯酮胺(PKA)与MCI-154对心肌去膜肌原纤维Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影响，与无药对照组比较***P＜0.001；
附图6是本发明的方法合成的盐酸椒苯酮胺的高压液相色谱附图7是本发明比较例方法合成的盐酸椒苯酮胺的高压液相色谱图。
具体实施例方式
以下为本发明的具体实施，所述的实验例用于描述本发明，而不是限制本发明。
实验例1
本实施例涉及盐酸椒苯酮胺的强心扩血管作用的实验。1.对离体心肌生理特性的影响
采用大鼠离体心脏制备筛选化合物药理活性的实验发现盐酸椒苯酮胺及其药学上可接受的盐具有增强心肌收缩力，扩张冠脉和减慢心率的作用。为了解它对心肌生理活性的影响，采用豚鼠离体乳头肌和心房肌标本，测定心肌张力与动作电位，观察椒苯酮胺对心肌收缩性、自律性、不应性及动作电位的影响。具体如下A.收缩性
本研究的豚鼠右室乳头肌和左房肌给药前的收缩力分别为54.4±16.8mg和372±186mg。加入盐酸椒苯酮胺后1min内即产生正性肌力作用，给药后15min达到峰值，作用持续30min以上，随着药物浓度的增加，达峰时间缩短，持续时间延长。当浓度为1μmol/L～100μmol/L范围内，盐酸椒苯酮胺剂量依赖性地增加乳头肌和左房肌的收缩力，其ED50分别为18.4μmol/L和9.2μmo1/L。
盐酸椒苯酮胺的正性肌力作用强度与PDEI类强心药米力农(Milrinone)近似，后者增加乳头肌和左房收缩力的ED50分别为6.2μmol/L和4.6μmol/L。然而，当二者达到相近的正性肌力作用强度时，盐酸椒苯酮胺使收缩时程从给药前的195±11ms延长到211±10ms，(增加8.5±4.7％，P＜0.001)；米力农则使收缩时程减少14±8％(P＜0.01)，两组间的差别非常明显(P＜0.001)。B.自律性
盐酸椒苯酮胺剂量依赖性地减慢右房自发频率，米力农则增加频率，当药物浓度为100μmol/L时，前者使右房频率降低25±11％(P＜0.001)，后者则使之增加33±8％(P＜0.001)。
用肾上腺素诱发豚鼠乳头肌自律性的实验显示盐酸椒苯酮胺剂量依赖性地增加肾上腺素诱发自律性的阈浓度，当药物浓度为10μmol/L时，盐酸椒苯酮胺使肾上腺素的阈浓度从给药前的39±27μmol/L增加到204±96μmol/L(P＜0.001)；米力农则使之从给药前的48±21μmol/L降低到8.2±8.5μmol/L(P＜0.001)。表明椒苯酮胺降低心肌自律性，米力农则使之提高，结果参见表1。
表1.盐酸椒苯酮胺与米力农对豚鼠乳头肌自律性的影响
药物浓度肾上腺素阈浓度μmol/L
μmol/L 样本数 给药前 给药后
盐酸椒苯酮胺
3 4 38.3±25.9 54.0±20.8
6 4 40.5±22.6 180.0±72.0***
10 6 39.0±26.5 204.0±95.7***
米力农
10 3 48.0±20.8 8.2±8.5***
与给药前比较 ***P＜0.001C.兴奋性
用时间-强度曲线法测定心肌兴奋性的结果显示盐酸椒苯酮胺不影响心肌兴奋性。D.不应性
采用连续双刺激法测左房不应期的研究表示椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐剂量依赖性地延长功能不应期，米力农则使之缩短。当药物浓度为10μmol/L时，前者使功能不应期延长6.3±2.9％(P＜0.001)，后者则使之缩短9.8±2.6％(P＜0.001)，结果参见表2。
表2.椒苯酮胺与米力农对豚鼠心肌不应性的影响
药物浓度 功能不应期ms给药后变化
μmol/L 样本数 给药前给药后 ％
盐酸椒苯酮胺
10 8 196.3±11.9 208.8±12.26.3±2.9***
50 8 203.8±9.5227.5±15.1* 11.8±3.4***
1009 197.2±11.5 238.9±12.7*** 21.3±6.8***
椒苯酮胺
10 8 195.1±11.7 206.8±13.26.0±3.2***
椒苯酮胺氢溴酸盐
50 8 201.8±9.4217.6±13.5* 7.8±1.4*
椒苯酮胺琥珀酸盐
50 8 210.6±8.5219.3±14.6* 4.0±2.4
椒苯酮胺马来酸盐
50 8 209.5±10.5 215.8±12.2* 3.0±1.4
米力农
10 4 198.8±13.1 178.8±11.1* -9.8±2.6***
与给药前比较 *P＜0.05，***P＜0.001
与给药前比较 *P＜0.05，***P＜0.001E.动作电位
测定乳头肌动作电位的实验表示灌流液中加入盐酸椒苯酮胺达10μmol/L与100μmol/L时，动作电位时程APD90分别比给药前延长13±12％(P＜0.01)与21±16％(P＜0.001).APD50亦轻度延长。盐酸椒苯酮胺不影响动作电位振幅(APA)，高浓度时使最大除极速度(Vmax)比给药前降低17±21％(P＜0.05)。米力农则明显减低APD50，APD90和APA，对Vmax无影响。显示盐酸椒苯酮胺对动作电位的影响不同于PDEI类米力农，结果参见表3。
表3.椒苯酮胺与米力农对豚鼠右室乳头肌动作电位的影响
药物浓度
参数给药前10μmol/L 100μmol/L
测定值 变化％测定值 变化％椒苯酮胺(N＝12)APA mv 103±10109±11 6±9 101±12 -1±7Vmax v/s144±38138±56 -2±33121±34 -17±21*APD50 ms 188±26203±27 7±7**204±29 8±12APD90 ms 222±28249±29*13±12** 267±37*** 21±16***盐酸椒苯酮胺(N＝12)APA mv101±10 110±11 8±7 105±10 -2±6Vmax v/s 142±36 139±53 -3±30119±32 -15±19*APD50 ms185±24 206±25 9±7**202±27 7±10APD90 ms219±27 253±26*15±10** 259±35*** 20±14***椒苯酮胺琥珀酸盐(N＝12)APA mv107±12 109±11 5±8 103±11 -1±5Vmax v/s 140±28 136±56 -3±28119±33 -15±18*APD50 ms184±22 201±23 6±9* 201±25 7±14APD90 ms218±25 254±27*14±8*247±35** 15±14**米力农(N＝6)APA mv103±10 92±12 -11±7** 93±15 -10±8*Vmax v/s 139±44 162±48 20±33153±45 12±22APD50 ms223±39 186±41 -17±10** 176±43 -22±11***APD90 ms256±40 221±38 -14±6*** 212±40 -18±7***
APA动作电位振幅，Vmax最大除极速度，
APD50动作电位复极50％的时程，APD90动作电位复极90％的时程
与给药前比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012.对离体血管张力的影响
采用狗的离体冠状动脉，基底动脉和肠系膜动脉制备，用氯化钾(KCl)，氯化钙(CaCl2)和5-羟色胺(5-HT)致血管张力增加，制得量-效曲线，用以观察药物的拮抗作用。结果表示椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐1μmol/L～50μmol/L非竞争性地对抗上述激动剂致冠状动脉，基底动脉和肠系膜动脉的收缩，使激动剂的量-效曲线右移，最大反应降低。它对抗KCl致狗冠状动脉收缩的作用强度与磷酸二酯酶抑制剂(PDEI)类强心扩血管药米力农相近，pD2’分别为4.32与4.37μmol/L；对抗5-HT致狗肠系膜动脉收缩的作用强度与罂粟碱接近，pD2’分别为5.36与4.98μmol/L。从对抗CaCl2致狗基底动脉收缩的反应显示盐酸椒苯酮胺的扩血管作用弱于钙拮抗剂维拉帕米，其pD2’分别为5.28与6.15μmol/L。表明盐酸椒苯酮胺具有中等强度的松弛血管平滑肌作用。参见图1～3。
从以上的离体实验可显示出椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐非竞争性地对抗KCl，5-HT，CaCl2等激动剂致狗冠状动脉，基底动脉和肠系膜动脉的收缩，表明它具有中等强度的松弛血管平滑肌作用。
椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐增加心肌收缩力，延长收缩时程，减慢右房自发频率，减低心肌自律性，延长功能不应期和动作电位时程，对心肌的兴奋性无明显影响。其正性肌力作用强度与PDEI类强心药米力农相近。然而，与之相反，米力农缩短收缩时程，增加心肌自发频率和自律性；缩短功能不应期和动作电位时程。
作用机理的研究表明椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐的正性肌力作用主要是通过增加心肌收缩蛋白对钙的敏感性，它不增加心肌细胞内[Ca2+]，甚至还能对抗缺氧-复氧所致的细胞内钙超载。显示它是一种新型的正性肌力药，也为它不易导致心律失常和毒副反应较低提供实验依据。
实验例2
本实施例涉及椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐对整体动物心脏血流动力学与心肌氧代谢的影响的实验。
为了解椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐对整体动物的强心扩血管作用，观察它对麻醉狗心脏血流动力学，冠脉循环及心肌氧代谢的影响。结果表示静注椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐0.5mg/kg～4mg/kg引起以下各项参数剂量依赖性地变化心率(HR)轻度减慢，血压(平均压MAP，收缩压SP，舒张压DP)明显降低，心脏指数(CI)与每搏指数(SI)轻度增加，每搏作功(SW)与左室作功(LVW)明显降低，冠脉流量(CBF)增加，冠脉阻力(CVR)与总外周血管阻力(SVR)降低。椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐明显降低心肌氧耗参数(张力时间指数TTI＝HR×MAP)，直接测定冠状窦血氧含量的结果表示它能明显降低心肌氧摄取率与氧消耗量。这些变化表明椒苯酮胺能够增加心肌供血，降低心脏负荷，减少心肌氧消耗，有利于改善心肌氧的供求平衡，这是治疗心肌缺血，保护心肌损伤的重要实验依据。以盐酸椒苯酮胺为例，具体结果见表4，5
表4.椒苯酮胺对麻醉狗心率与血压的影响
盐酸椒苯酮胺mg/kg
0.51 2 4
N＝4 N＝7N＝6 N＝6 心率HR给药前bpm 157±31 187±21 172±35 175±31给药后变化％ -2±3 -2±4-6±3* -11±7** 平均动脉压MAP给药前mmHg107±15 109±18 96±10 98±15给药后变化％ -3±5 -10±19 -16±9** -28±12*** 收缩压SP给药前mmHg129±20 141±20 123±17 137±22给药后变化％ -2±4 -12±21 -18±13* -25±13** 舒张压DP给药前mmHg94±1392±12 86±12 83±15给药后变化％ -1±3 -8±19 -18±10**-29±9** 张力时间指数TTI给药前bpm.mmHg/1001715±486 2113±5661667±4641752±492给药后变化％ -2±6 -11±17 -19±6***-33±8***
与给药前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
表5.椒苯酮胺对麻醉狗心脏泵功能，冠脉流量与心肌氧代谢的影响
椒苯酮胺mg/kg
0.5 1 2 4
N＝4 N＝6 N＝5 N＝6
心脏指数CI给药前1/min/m2 1.3±0.5 1.6±0.3 1.3±0.5 1.3±0.2给药后变化％9±3* 6±8 12±10* 16±6***
每搏指数SI给药前ml/beat/m2 8.9±2.7 8.7±1.7 5.5±3.3 7.8±1.2给药后变化％13±1*** 5±4* 5±13 12±10*
每搏作功SW给药前g.m/beat 92±2988±27 68±2068±14给药后变化％13±7*-12±21-21±1 3* -25±20*
左室作功LVW给药前kg.m/min 14±6 17±6 12±5 12±3给药后变化％15±4** -15±23-28±15** -32±16**
总外周血管阻力SVR给药前mmHg/l/min/kg 6.9±0.8 7.3±2.4 8.3±4.7 8.1±2.7给药后变化％ -11±4* -13±11* -10±7* -25±8***
冠脉流量CBF给药前ml/min/100g 67±34 64±18 59±1753±9给药后变化％ 17±7* 13±13* 46±29** 21±10**
冠脉阻力CVR给药前mmHg/ml/min/100g 1.9±0.71.8±0.41.7±0.3 1.9±0.5给药后变化％ -7±3** -16±10** -28±9*** -22±9***
心肌氧摄取率给药前％ 40±13 57±17 59±1266±12给药后变化％ -26±32 -31±9*** -9±7** -6±4**
心肌氧消耗量给药前ml/min/100g 3.9±0.35.5±2.65.3±1.9 4.7±1.6给药后变化％ -28±30 -33±12*** -31±19** -41±10***
与给药前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
在体心脏血流动力学的研究显示麻醉狗静注盐酸椒苯酮胺后心率轻度减慢，血压与血管阻力明显降低，心输出量与冠脉流量增加，心脏作功减低。它明显扩张冠状动脉，降低心肌氧摄取率与氧消耗量。表明盐酸椒苯酮胺能够增加心肌供血，降低心脏负荷，有利于改善心肌氧的供求平衡，这是治疗心肌缺血，保护心肌损伤的重要实验依据。
实验例3
本实施例涉及椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐对心力衰竭的治疗作用实验。
为了解强心扩血管新药椒苯酮胺对心力衰竭的治疗作用，形成戊巴比妥钠致豚鼠，猫与狗心力衰竭的病理模型，从心脏血流动力学方面作观察，并与各类已知药比较。
1.心衰豚鼠
心衰形成时，动物的心率、血压、左室收缩压(LVSP)及压力变化速度(±dP/dt max)均比心衰前降低一半以上，静注椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐3mg/kg或6mg/kg，则使各项参数明显增加，并随药物剂量增加而加强。以最大有效量/致心律失常量作为治疗指数的比较表示椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐的作用与PDEI类强心药米力农接近，然而米力农易出现室性心律失常，椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐则不引起快速性室性心律失常，表明它更有利于心力衰竭的治疗。以盐酸椒苯酮胺为例，具体结果见表6。
表6.盐酸椒苯酮胺与米力农对戊巴比妥钠致心衰豚鼠心率，血压与左室压的影响
对照椒苯酮胺 米力农
3mg/kg 6mg/kg 50μg/kg
N＝6 N＝6 N＝7 N＝6心率HR
给药前bpm 132±61172±40162±49151±31
给药后变化％-4±7 -20±10***## -20±18*# 12±21平均动脉压MAP
给药前mmHg 15±6 17±9 14±4 15±3
给药后变化％-10±1022±14**# 52±29***##59±35**##左室收缩压LVSP
给药前mmHg 18±9 18±9 17±3 20±7
给药后变化％-8±15 52±47*73±56**# 82±60*#左室压力上升速度+dP/dt max
给药前mmHg/s138±79195±109125±30 167±28
给药后变化％-20±2*** 63±45**# 168±132*#365±251**##左室压力下降速度-dP/dt max
给药前mmHg/s80±50 110±71 73±1473±15
给药后变化％-19±6** 93±72*#148±118*#412±396*#
与心衰前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
与对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.0012.心衰猫
对麻醉开胸猫连续观察4h的结果表示心衰1h时，HR，MAP，LVSP分别比心衰前降低59％，71％与67％，±dP/dt max与心肌收缩力(CF)下降85％，85％与58％，颈总动脉血流量(CCBF)下降71％。随时间的延续，以上变化进一步加重。静注椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐1mg/kg～8mg/kg剂量依赖性地明显增加心衰动物MAP、CF、收缩力变化速度(±dT/dt max)，LVSP，±dP/dtmax和CCBF，以盐酸椒苯酮胺为例，具体结果见表7。
各类已知强心药在本实验性心衰模型均显示其改善心脏功能的效应。在达到相近的强心作用效果时，椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐使心衰猫降低的血压上升，强心甙去乙酰毛花甙丙(Deslanoside)和儿茶酚胺类异丙基肾上腺素(Isoproterenol，简称异丙肾)不影响血压，PDEI类强心药米力农及钙增敏剂MCI-154使血压继续降低。异丙肾，米力农与MCI-154引起HR持续增加，并易导致心律失常，不利于治疗，椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐则对HR的影响较小，而且不致心律失常。
表7.椒苯酮胺对戊巴比妥钠致心衰猫心脏血流动力学的影响
10％丙二醇 椒苯酮胺mg/kg
2ml/kg 1 2 4 8
N＝10 N＝6 N＝9N＝9 N＝6
心率HR给药前bpm57±19 62±2068±23 65±1661±11给药后变化％ -3±4 -9±4 -6±10 13±10**### 29±27*##
平均动脉压MAP给药前mmHg 30±7 53±2234±9 32±7 25±7给药后变化％ -1±6 6±5*#25±22**## 34±18***### 53±38**###
左室收缩压LVSP给药前mmHg 41±8 49±9 47±7 44±7 42±9给药后变化％ 6±9 14±4***# 33±21***## 45±28***### 80±39***###
左室压力上升速度+dP/dt max给药前mmHg/s 700±283 908±427 855±179 928±248 775±135给药后变化％ 2±10**30±25*# 83±66**## 98±71***## 185±128**###
左室压力下降速度-dP/dt max给药前mmHg/s 345±142 470±262 400±127433±149 392±127给药后变化％ 3±21 27±21*# 65±59**## 82±52***### 159±80***###
心肌收缩力给药前g 25±14 43±32 31±20 31±25 51±27给药后变化％ 2±10 32±26*## 97±94**## 95±53***### 108±77*##
心肌最大收缩速度+dT/dt max给药前g/s109±46154±58128±50 128±63 186±148给药后变化％ 6±13 19±7*** 87±66**## 121±86**## 136±94**##
心肌最大舒张速度-dT/dt max给药前g/s77±44 124±5581±33 150±158 140±88给药后变化％ 5±43 -21±12** 75±61**# 122±135#177±152**#
颈总动脉流量CCBF给药前ml/min 5±4 8±4 7±47±4 6±2给药后变化％ 1±13 13±9* 31±13***## 54±27***## 61±35***###
颈总动脉血管阻力CCVR给药前mmHg/ml/min
9±4 6.8±1.7 6.4±4.46.2±3.4 4.9±2.2给药后变化％ -6±7 -11±4*** -5±11 -25±13*** -18±11**
与心衰前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
与对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.0013.心衰狗
对麻醉开胸狗连续观察的结果表示心衰形成后，影响心脏功能的主要参数均降低一半以上，这些变化持续3h以上。静注椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐1mg/kg～6mg/kg剂量依赖性地明显增加心衰动物血压，LVSP，±dP/dt max，心肌收缩力，收缩力变化速度(±dT/dt max)，心脏指数(CI)，每搏指数(SI)，每搏作功(SW)和左室作功(LVW)。椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐明显增加冠脉和股动脉流量，不影响冠脉阻力(CVR)和总外周血管阻力(SVR)。此研究进一步支持椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐改善心脏功能的效应，并显示出它对血管作用的有组织选择性。
盐酸椒苯酮胺3mg/kg增加心衰狗心输出量(CI，SI)，左室压力上升速度(+dP/dt max)和心肌最大收缩速度(+dT/dt max)的程度与米力农30μg/kg接近，但是后者对心脏舒张功能(-dP/dt max与-dT/dt max)的影响较小，椒苯酮胺则使之明显改善。米力农轻度增加HR，进一步降低心衰狗的MAP和SVR，与之相反，椒苯酮胺减慢HR，增加MAP，不影响SVR。表示出椒苯酮胺对心衰的治疗更为有利，参见表8、9显示的结果。
表8.盐酸椒苯酮胺对戊巴比妥钠致心衰狗心率，血压与左室压的影响
溶剂 椒苯酮胺mg/kg 米力农
0.6ml/kg 1 3 6 30μg/kg
N＝6 N＝8 N＝7 N＝4N＝5
心率HR给药前bpm69±16 98±1785±15 79±14 63±14给药后变化％ 2±3 -12±5***### -13±9 -12±7*#9±5**##
平均动脉压MAP给药前mmHg 58±15 52±2054±17 55±12 65±19给药后变化％ 6±5*11±9** 34±17***# 46±19**### -6±9#
左室收缩压LVSP给药前mmHg 71±13 65±1967±17 65±14 82±18给药后变化％ 2±7 6±7* 43±33**# 64±39*## 16±14*
左室压力上升速度+dP/dt max给药前mmHg/s 100±252 137±377 1100±351 1025±179 1017±517给药后变化％ 1±109±15 53±37**## 125±88*## 64±17***###
左室压力下降速度-dP/dt max给药前mmHg/s 983±177 837±500 786±365813±741070±240给药后变化％ 4±8 35±40* 28±16***## 117±83*# 2±15
与心衰前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
与对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001表9.盐酸椒苯酮胺对戊巴比妥钠致心衰狗心脏泵功能，血流量与血管阻力的影响
溶剂 椒苯酮胺mg/kg米力农
0.6ml/kg 1 3 6 30μg/kg
N＝6 N＝8 N＝7 N＝4 N＝5
心肌收缩力给药前g52±26 42±22 41±3246±2658±27给药后变化％ 3±1024±18**# 94±63**##58±24**##26±26
心肌最大收缩速度+dT/dt max给药前g/s 63±25 107±57 40±8 37±9 51±7给药后变化％ 1±9 -3±11 77±21**### 170±67*##62±14***###
心肌最大舒张速度-dT/dt max给药前g/s 95±56 108±48 110±53 70±2396±49给药后变化％ 2±1013±22 31±21# 42±24*# 12±1***##
心脏指数CI给药前1/min/m21.2±0.5 1.5±0.31.5±0.6 1.3±0.5 1.4±0.4给药后变化％ 3±4 9±7*# 18±11*# 46±31*## 21±7***###
每搏指数SI给药前ml/beat/m2 17±715±5 21±8 18±8 24±9给药后变化％ 2±6 23±6***### 19±11*# 34±5315±9**#
每搏作功SW给药前g.m 7.0±4.0 6.2±1.59.1±3.2 7.3±3.7 10.4±5.3给药后变化％ 8±9 27±17**# 69±23**### 73±40*## 15±20
左室作功LVW给药前kg.m/min 0.5±0.3 0.6±0.10.7±0.2 0.5±0.2 0.6±0.3给药后变化％ 10±7** 13±18 77±27**### 97±47**##21±19*
总外周血管阻力SVR给药前mmHg/l/min/kg 5.7±1.05.7±2.96.0±1.7 4.8±1.0 6.3±0.8给药后变化％26±94 -4±11 26±14* 22±17* -18±3***
冠脉流量CBF给药前ml/min/100g 27±9 28±7 26±5 26±3给药后变化％10±12 3±946±15***## 87±54*#
股动脉血流量FBF给药前ml/min9±49±17±3 10±2给药后变化％9±9* 3±11 49±12**##61±10***###
与心衰前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
与对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001
上述实验显示出盐酸椒苯酮胺对实验性心力衰竭的豚鼠，猫与狗均有良好的治疗作用，能明显增强心肌收缩力，减低心脏负荷，改善心脏功能。并表示出它优于各类已知强心药，有希望发展成为治疗心力衰竭的新型药物。
实验例4
本实施例涉及椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐抗心肌缺血的实验，具体如下
1.椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐对抗异丙肾上腺素致大鼠心肌坏死的治疗作用
为了解椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐对心肌缺血性损伤的治疗作用，形成异丙肾致大鼠心肌缺血坏死模型，从心肌生化指标及形态学方面评价药效。结果表示损伤时心脏增大，心肌肌酸磷酸激酶(CPK)活性降低，脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)含量增高，血清谷氨酸氨基转移酶(GOT)活性增高。病理形态显示心室肌有散在片状坏死，透壁，累及心内膜下1/2，环周1/2～2/3；心肌细胞溶解消失，炎性细胞浸润，肉芽组织增生。腹腔注射椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐1mg/kg～6mg/kg，明显减轻上述变化。表明椒苯酮胺及其药学上可接受的盐具有保护心肌损伤的效应，参见表10显示的以盐酸椒苯酮胺为例的结果。
表10.盐酸椒苯酮胺对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血坏死的影响组别 动物数 心脏系数 心肌 血清 病理形态
CPK MDA GOT 损伤级别
U/mg pro nmol/mg pro Kamen正常对照 112.86±0.17**4.4±0.8** 11.4±2.1*148±21** 0±0***异丙肾损伤损伤对照 123.81±0.40 3.1±0.6 15.2±4.6 219±603.3±0.7盐酸椒苯酮胺
2mg/kg6 3.40±0.78 2.8±1.2 11.1±3.7 166±42
4mg/kg103.69±0.25 3.4±0.9 13.1±2.4 155±10** 2.6±0.5
8mg/kg6 3.42±0.27* 3.8±0.8*9.2±3.4* 144±15** 2.3±0.5*普萘洛尔
4mg/kg113.99±0.38 3.4±0.8 12.1±4.1 70±33*2.3±1.0
与异丙肾损伤对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
2.椒苯酮胺及其药学上可以接受的盐对心肌梗死猫心脏功能的影响
制备阻断冠脉前降支致猫急性心肌梗死的病理模型，以心脏血流动力学为指标观察药物的效应。结果表示心肌梗死时心肌收缩力比梗死前降低47±25％，心输出量与心脏作功约降低30％～40％，血压与左室收缩压也中度降低，显示心脏功能明显受损。心梗后分别静注椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐1mg/kg～8mg/kg剂量依赖性地降低血压，血管阻力与张力时间指数(TTI)，它对心肌收缩力，心输出量与心脏作功的影响较小。表示椒苯酮胺通过降低心脏负荷和心肌氧耗，达到改善心脏功能和保护心肌缺血的作用，其中盐酸椒苯酮胺的效果最好。参见表11、12显示的以盐酸椒苯酮胺为例结果。
表11.盐酸椒苯酮胺对心肌梗死猫心率，血压与左室压的影响
溶剂对照 盐酸椒苯酮胺mg/kg
12 4 8
N＝10 N＝5 N＝6 N＝6N＝7
心率HR给药前bpm127±18 134±28 134±31 131±34 117±43给药后变化％ 0±4 -5±9 -1±7 -6±5*# -5±5*#
平均动脉压MAP给药前bpm106±29 108±25 103±24 96±24 91±33给药后变化％ 2±3 -12±7*### -13±6***###-14±3***###-23±10***###
张力时间指数TTI给药前mmHg.bpm/10
1396±540 1469±4921402±481 1310±539 1171±701给药后变化％ 2±5 -13±10*## -15±7***### -17±6***###-26±9***###
左室收缩压LVSP给药前mmHg 149±40 142±37 127±30130±38 126±44给药后变化％ 0±9 -8±9-3±11 4±4* 3±14
左室压力上升速度+dP/dt max给药前mmHg/s 4622±10856620±3024 6700±3603 6367±2812 5286±2931给药后变化％ 2±5 -5±2 7 -8±13 -11±8##12±54
左室压力下降速度-dP/dt max给药前mmHg/s 1756±440 2560±7712667±618 2608±1242 2521±1673给药后变化％ 6±18 0±26-18±15*# -3±16 -1±19
与心衰前比较*P＜0.05 **P＜0.01***P＜0.001
与溶剂对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01###P＜0.001
表12.盐酸椒苯酮胺对心肌梗死猫心脏收缩功能与血管阻力的影响
溶剂对照 盐酸椒苯酮胺mg/kg
1 2 4 8
N＝10 N＝4 N＝6 N＝6 N＝6
心肌收缩力给药前g65±17 34±1337±1444±2745±33给药后变化％ 6±10 10±1219±1 6* 28±22*# 22±17*
心脏指数CI给药前l/min/m2
0.89±0.41 1.07±0.341.04±0.341.10±0.381.15±0.44给药后变化％ 10±11 11±5** 15±8*** 30±14***## 27±16**#
每搏指数SI给药前ml/beat/m2
7.51±1.91 8.01±2.058.01±2.058.71±2.2610.26±4.65给药后变化％ 9±12* 11±2*** 2±6*** 31±14***## 39±28**#
每搏作功SW给药前g.m 26±14 30±9 28±1029±9 33±12给药后变化％ 11±13**1±8 6±16 14±12* 13±19
左室作功LVW给药前kg.m/min 3.5±2.23.4±1.9 3.7±1.3 3.8±1.7 4.1±2.3给药后变化％ 12±21 -12±20 0±10 6±13 8±26
颈总动脉流量CCBF给药前ml/min 21±11 9±4 9±3 9±4 9±4给药后变化％ 21±19* 8±13 15±11* 27±7*** 25±22*
颈总动脉血管阻力CCVR给药前mmHg/ml/min
8.8±5.316.6±10.712.3±3.211.2±3.3 11.3±2.9给药后变化％ -14±13*-17±10* -21±10**-33±6***# -34±10***#
总外周血管阻力SVR给药前mmHg/l/min/kg
159±34 129±27 115±29 106±27105±36给药后变化％ -6±10 -18±6*** -23±9***## -32±9***### -40±9***###
与心衰前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
与溶剂对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01
从心肌生化指标及形态学方面的研究表示椒苯酮胺对抗异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血坏死。
对于阻断冠脉前降支致急性心肌梗死的猫，椒苯酮胺及其药学上可接受的盐剂量依赖性地降低血压，血管阻力与张力时间指数(TTI)，它对心肌收缩力，心输出量与心脏作功的影响较小。表示该药通过降低心脏负荷和心肌氧耗，能达到保持心脏功能和保护心肌缺血的作用，其中盐酸椒苯酮胺的效果最好。
实验例5
本实施例涉及椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用实验
1.椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对离体心脏再灌注损伤的保护作用
①椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对冠脉阻断-再灌与缺氧-复氧的保护作用
采用离体鼠心制备，予以阻断冠脉前降支致局部心肌缺血-再灌注损伤或形成全心缺氧-复氧的病理模型，从心律失常发生率，心肌酶的释放和脂质过氧化方面观察椒苯酮胺及其药学上可接受的盐的药效。结果表示椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐1μmol/L和3μmol/L使缺血-再灌注时的心室纤颤发生率从对照的85％明显减少为12.5％与9.1％(P＜0.01)；它减少损伤所致的心肌CPK和LDH释放。对于缺血-再灌或缺氧-复氧所致的心肌MDA含量增加，椒苯酮胺及其药学上可接受的盐均有明显的对抗作用，甚至使它保持在正常水平，对於缺氧-复氧所致的心肌SOD活性降低，椒苯酮胺及其药学上可接受的盐也有一定的对抗作用，尤以盐酸椒苯酮胺效果最好。此研究表明椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对再灌注损伤有保护作用，参见表13显示的以盐酸椒苯酮胺为例的实验结果。
表13.盐酸椒苯酮胺对离体大鼠心脏缺氧-复氧或冠脉阻断-再灌损伤的影响
缺氧-复氧 冠脉阻断-再灌
药 物 MDASOD CPK LDH MDA (μmol/L) nmol/gU/mg pro U/g/min U/g/minnmol/100mg pro正常对照175±27***94±18***0.07±0.02** 2.3±0.3***61±14***损伤对照279±58 61±23 0.35±0.14 12.0±3.9 158±82损伤+盐酸椒苯酮胺
1 161±64*** 80±19 0.12±0.05** 7.6±2.3** 60±14**
3 0.07±0.02*** 6.8±3.4** 99±30*
10164±24*** 80±21
与损伤对照组比较***P＜0.001
②椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对心肌缺血停灌-再灌的保护作用
为进一步了解椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用，采用离体大鼠心脏制备，予以停灌40min-复灌30min，造成再灌注损伤模型，从心脏功能，心肌与线粒体生化及形态等方面观察椒苯酮胺、椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐1～10μmol/L的药效，并探讨其作用机制。结果表示复灌时心肌收缩力很弱，比停灌前降低79±26％，冠脉流量比停灌前减少43±15％，冠脉流出液的CPK活性从给药前的60±23U/L升高到317±195U/L。给予椒苯酮胺10μmol/L的心脏，复灌时的心肌收缩力与冠脉流量分别比停灌前降低16±82％与22±19％，CPK活性保持在停灌前水平(55±41U/L)，与损伤对照组比均有明显差别。
椒苯酮胺及其药学上可接受的盐1～10μmol/L明显增加心肌与线粒体的抗氧化能力，它对抗停灌-复灌所致的心肌超氧化物歧化酶(SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性降低，使线粒体丙二醛(MDA)，谷胱甘肽(GSH)与GSH-px保持在正常水平。(表17)
椒苯酮胺及其药学上可接受的盐的剂量依赖性地对抗损伤所致的心肌三磷酸腺苷(ATP)，磷酸肌酸(PCr)含量降低，并使之保持在正常水平。并对抗停灌-复灌损伤所致的线粒体钙超载，增加线粒体膜流动性与ATP酶活性，使线粒体结构保持得比较完整，参见表14、15显示的以盐酸椒苯酮胺为例的实验结果。。
表14.盐酸椒苯酮胺对停灌-复灌心肌与线粒体MDA，SOD，GSH，GSH-px的影响
心肌线粒体
组别SOD GSH-px MDAGSH GSH-px(μmol/L)nmol/mg pro.U/mg pro nmol/mg pro U/mg pro U/mg pro正常 44±8***35±7*** 17±2*** 19±1*** 16.8±2.9***停灌-复灌
对照 30±2 22±3 23±1 15±16.7±0.8盐酸椒苯酮胺
136±5** 28±5**22±1 16±17.4±1.1
339±5***28±6*** 21±1* 19±1*** 8.5±1.4*
10 42±6***29±5*** 18±1*** 19±1*** 22.6±7.6***
N＝6，与停灌-复灌对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
表15.盐酸椒苯酮胺对停灌-复灌大鼠心肌能量代谢，线粒体膜流动性与钙含量的影响
心肌 线粒体 药物 ATP PCrATP酶 膜流动性 钙μmol/L μmol/g μmol/g nmoi Pi/mg pro η nmol/mg pro 正常43±19*** 127±15*** 247±24*** 1.06±0.23** 6±2*** 停灌-复灌 对照17±5 59±27 171±10 1.57±0.29118±15 盐酸椒苯酮胺
1 26±9*95±59 177±17 1.29±0.18114±12
3 31±12* 95±14*187±11* 1.10±0.13** 51±19***
1051±18*** 176±80*** 261±37*** 1.05±0.31* 27±18***维拉帕米
3 27±3*** 117±23*** 198±16***1.23±0.19 36±8***
与停灌-复灌对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
本研究表示盐酸椒苯酮胺明显改善停灌-复灌心脏的生理功能，减轻损伤所致的心肌生化变化，保持线粒体结构的完整性，其作用机制与增强抗氧化能力有关。
2.椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对在体心脏再灌注损伤的保护作用
①椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对大鼠心脏再灌注损伤
采用在体大鼠心脏冠脉阻断10min，再灌注30min的病理模型，从心电图，心肌生化与超微结构变化等方面观察药物效应。结果显示缺血前或缺血时静注椒苯酮胺、椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐0.1mg/kg～1mg/kg明显减轻心律失常，减少心肌CPK和LDH释放，降低心肌MDA产生和血浆游离脂肪酸(FFA)含量，保护心肌超微结构。此结果表明椒苯酮胺对于在体心脏心肌缺血-再灌注损伤有明显的保护作用，表16列出了以盐酸椒苯酮胺为例的实验结果。
表16.盐酸椒苯酮胺对大鼠在体心脏心肌缺血-再灌注损伤的影响
心肌药物 室颤CPK LDH MDA 病理损伤mg/kg发生率％ U/mg proU/mg pro nmol/100mg pro 级别假手术 5** 9.8±0.8*** 7.4±1.8*** 70±9***0.17±0.24***缺血-再灌损伤对照 52 5.2±0.610.9±2.3136±10 1.55±0.91盐酸椒苯酮胺
0.125 6.5±0.8*** 8.2±0.6*100±15*** 1.25±0.51
0.50* 9.3±1.0*** 7.2±0.6** 74±6***0.65±0.45***
1.017 10.9±0.8***6.3±0.5*** 60±6***0.33±0.40***维拉帕米
1.022 9.2±1.5*** 7.2±2.0** 61±20***
与损伤对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
②椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对猫心脏再灌注损伤
为进一步确定椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对再灌注损伤的保护作用，形成在体猫心再灌注损伤的病理模型，予以阻断冠脉30min，再灌60min，从心脏血流动力学，血液生化与心肌能量代谢等方面作观察。结果表示静注椒苯酮胺椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐2mg/kg-8mg/kg剂量依赖性地明显减慢HR，降低MAP和心肌氧耗参数TTI；它对心输出量(CI)无影响，却轻度增加每搏指数(SI)；它降低心脏作功(SW与LVW)和外周血管阻力(SVR)。显示椒苯酮胺有降低受损心脏负荷，保护心脏功能的作用，表17列出了以盐酸椒苯酮胺为例的实验结果。
表17.椒苯酮胺对心肌缺血-再灌注猫心脏血流动力学的影响
给药后变化％
损伤对照 盐酸椒苯酮胺mg/kg 维拉帕米
2.0 4.2 8.4 1.3mg/kg
N＝8 N＝5N＝5 N＝8N＝3心率HR
缺血期 -3±4*-10±7*#-20±6***### -22±5***###-43±2***###
再灌期 -10±6*** -19±10** -26±10**# -30±9***###-35±5***###平均动脉压MAP
缺血期 -4±3*** -14±15 -41±19**### -32±10***### -40±6***###
再灌期 -11±10** -7±10 -28±7***### -26±12***##-20±4**##张力时间指数TTI
缺血期 -8±4*** -23±17*-50±19***###-43±11***### -65±4***###
再灌期 -17±5*** -23±17*-46±12***###-47±16***### -49±2***###心脏指数CI
缺血期 -9±9*-7±17 -16±11* -16±13** -29±9**##
再灌期 -16±12** -15±15 -6±91±22 12±6#每搏指数SI
缺血期 -2±11-3±27 7±5*# 7±16 43±4***###
再灌期 -10±13 18±28 26±18* 33±31*#66±9***###每搏作功SW
缺血期 -10±13* -9±27 -42±21**## -28±12***##-26±13*
再灌期 -18±14** -9±26 -17±5***7±25# -40±19*##左室作功LVW
缺血期 -9±14-19±22 -51±21***###-40±12***##-57±8***###
再灌期 -22±16 -22±19 -34±9***-29±21** 15±8总外周血管阻力SVR
缺血期 -9±14-5±17 -27±17*#-27±10***### -27±1***##
再灌期 -22±16 1±15 -20±12*#-17±15**## -25±12*#
以缺血前作为100％，计算各参数的变化百分值。
与缺血前比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
与损伤对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001
血清生化测定显示椒苯酮胺剂量依赖性地对抗缺血-再灌注所致的脂质过氧化终产物MDA含量增加，降低血清CPK与GOT活性，使之与缺血前比较无明显差别。能量代谢的研究表示椒苯酮胺明显对抗损伤所致的缺血区心肌ATP与PCr含量减少，使之保持在正常水平，显示椒苯酮胺明显改善心肌能量代谢障碍，这可能是它保护再灌注损伤的一个重要原因，表18列出了实验结果。
表18.盐酸椒苯酮胺对心肌缺血-再灌注猫血清MDA，CPK，GOT与心肌ATP，PCr的影响
损伤对照 盐酸椒苯酮胺mg/kg 维拉帕米
2.0 4.2 8.4 1.3mg/kg
N＝8 N＝5 N＝5 N＝6N＝3血清MDA nmol/L
缺血前78±2150±1061±17 77±39 54±5
缺血期99±3158±26# 58±18# 80±40 54±4#
再灌期120±28** 76±28# 68±13## 65±23## 75±9*#血清CPK U/L
缺血前128±79 136±21 146±60 151±42115±17
缺血期197±83 206±21** 174±62 200±71181±17**
再灌期263±88** 324±82** 250±84 216±63263±14***血清GOT U/L
缺血前57±2146±1073±24 71±33 76±15
缺血期96±7263±1259±28 75±27 76±19
再灌期122±73* 90±4481±21 100±2892±25心肌ATPμmol/g
非缺血区 41±8 36±5 47±11 55±10 36±2
缺血区16±6** 15±2*** 33±8*## 55±4### 33±1##心肌PCrμmol/g
非缺血区 48±8 43±8 57±17 69±12#50±8
缺血区31±5** 28±6*49±15# 69±8### 48±20
与缺血前或非缺血区比较*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001
与损伤对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01###P＜0.001
通过采用离体与在体心脏多种心肌缺血-再灌损伤病理模型，从心脏生理功能，心肌与线粒体生化变化，病理形态学观察等方面显示出椒苯酮胺对再灌注损伤有明显的保护作用。它保持心脏功能，增强心肌抗氧化能力，改善能量代谢，对抗细胞内钙超载，减轻超微结构的损伤。同时也表明其作用机制与增强细胞的抗氧化能力有关。
实验例6
本实施例涉及椒苯酮胺及其药学上可接受的盐对心肌正性肌力作用的实验1.与细胞内钙的关系
观察各种拮抗剂对心肌收缩性影响的研究表示椒苯酮胺及其药学上可接受的盐的正性肌力作用与α，β和H2受体无明显关系，也不通过激活cAMP的途径。生化测定表示它不增加心肌cAMP，也不抑制Na+，K+-ATP酶和磷酸二酯酶(cAMP-PDE，cGMP-PDE)。表明椒苯酮胺及其药学上可接受的盐的正性肌力作用机制不同于强心甙，儿茶酚胺与PDEI类强心药，提示它主要不是通过增加细胞内钙的途径。为此，分离成年豚鼠的心室肌细胞，采用荧光探针Fura-2测定心肌细胞内游离钙离子浓度，结果表示在正性肌力作用浓度范围内，椒苯酮胺不增加豚鼠心肌细胞内[Ca2+]，甚至还能对抗缺氧-复氧所致的细胞内钙超载，表19、20分别列出了以盐酸椒苯酮胺为例的实验结果。
表19.盐酸椒苯酮胺与哇巴因对豚鼠心室肌细胞内游离钙的影响
细胞内[Ca2+]nmol/L
对照 盐酸椒苯酮胺μmol/L 哇巴因nmol/L
1 1050给药前 112±14 116±15 125±15 102±12给药后 124±16 125±19 121±19 162±24**变化％ 9±7 8±9 -5±8## 59±15###
与给药前比较**P＜0.01。 与对照组比较##P＜0.01，###P＜0.001
表20.盐酸椒苯酮胺对缺氧-复氧损伤的豚鼠心肌细胞内游离钙的影响
细胞内[Ca2+] nmol/L
正常细胞 损伤对照 盐酸椒苯酮胺μmol/L
1 5 10
N＝10 N＝12 N＝7 N＝8 N＝10
100±9*** 246±26237±45 189±8*** 114±11***
与损伤对照比较***P＜0.0012.与心肌收缩蛋白对钙敏感性的关系
制备狗的心肌去膜肌原纤维，测定Ca2+，Mg2+-ATp酶活性，以酶活性与反应液中Ca2+浓度(-log mol/L)关系(pCa)评定收缩蛋白对钙的敏感性，结果表示在pCa 8.0～4.5范围内，去膜肌原纤维Ca2+，Mg2+-ATP酶活性随Ca2+浓度增加而升高，从关系曲线得到对照组的pCa50＝7.408。椒苯酮胺、椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐50μmol/L使曲线向左向上移动，pCa50＝7.879，与已知的钙增敏剂MCI-154 100μmol/L的作用相近(pCa50＝7.993)，与对照组比较均有明显差别，图4给出了以椒苯酮胺盐酸盐为例的实验结果。选择pCa＝7.0，药物浓度3～100μmol/L时的观察显示椒苯酮胺增加去膜肌原纤维Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的作用呈剂量依赖性，图5给出了以椒苯酮胺盐酸盐为例的实验结果。
本研究表明椒苯酮胺及其药学上可接受的盐明显增加心肌收缩蛋白对钙的敏感性，表示它是一种以增加心肌收缩蛋白对钙的敏感性为主的新型强心剂，为该药不易导致心律失常和毒付反应较低提出实验依据。
实施例1采用如下方法合成N-甲基胡椒乙胺盐酸盐
将1.09mol胡椒乙胺(东北制药厂的中间体)和1.96mol苯甲醛置于1000ml园底烧瓶中，混合均匀，放出大量的热，加入300ml无水乙醇混匀，加入沸石，用电热帽加热，回流反应18小时，减压浓缩除去乙醇，再用油泵减压浓缩除去未反应的苯甲醛，得红棕色油状物，冷却到室温后，再加入200ml甲苯和1.09mol硫酸二甲酯，外温保持在约120℃反应30分钟，室温静置冷却，待分层后再倾去上面的甲苯层，然后再加入300ml的75％乙醇，再回流反应30分钟，得暗棕红色不透明液体。加蒸馏水10ml，摇匀后在搅拌状态下，使用水泵减压蒸除乙醇、甲苯和水等溶剂，再用油泵减压浓缩除去苯甲醛，得暗棕红色不透明粘稠油状物，所得极粘稠状物中，加入基本饱和的HCl/无水乙醇溶液至PH＝3，逐渐析出大量N-甲基胡椒乙胺盐酸盐固体，过滤，固体用丙酮反复洗、再用无水乙醚洗，得近白色的固体89g，收率38％，mp186～188℃(dec.)。Rf＝0.23(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)。
通过对羟基苯甲醛在碱性条件下和丙酮经Claisen-Schmidt缩合反应得到对羟基苄叉丙酮。
将21.5g(0.1mol)N-甲基胡椒乙胺盐酸盐和30g(1mol)多聚甲醛置于500ml圆底瓶中，加入240ml无水乙醇和2ml浓盐酸，使溶液呈酸性，外温保持在90-100℃油浴中加热，搅拌至固体全部溶解后，再加热搅拌30分钟左右，稍冷，加入对羟基苄叉丙酮16.2g((0.1mol)，回流搅拌反应约8.0小时，反应过程中慢慢析出固体，直到反应瓶内全部固化。用TLC检测Rf＝0.38 (展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，反应基本完全。过滤，固体用冷却的无水乙醇反复洗，干燥。得淡黄色固体27.3g。该固体用95％乙醇加热搅拌，固体很快全部溶解呈浅黄色的澄清溶液，再用3g活性炭脱色，得浅黄色的澄清溶液，放冷后慢慢析出白色粉末状固体，然后再放冰箱冷却，过滤，得近白色的盐酸椒苯酮胺粉末状固体，用无水乙醇洗，真空干燥，重22g，收率69％。mp168～170℃。Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，元素分析接近理论值，高压液相色谱检测，纯度约为99.3％，参见图6。元素分析结果
质谱m/s 218，135。红外吸收光谱(IR)检测结果见表1
表20核磁共振氢谱(DMSO-d6，TMS)结果见表2结构式
表21盐酸椒苯酮胺1H-NMR谱解析表6.3.4 核磁共振碳谱及碳、氢化学位移相关谱见表3
表22.盐酸椒苯酮胺的13C-NMR谱解析表
实施例2
将17.2g(0.08mol)N-甲基胡椒乙胺盐酸盐和24g(0.8mol)多聚甲醛置于500ml圆底瓶中，加入200ml无水乙醇和1.5ml浓盐酸，使PH约为3-4，油浴温度100℃，加热搅拌至固体全部溶解后，再加热、搅拌20分钟左右，稍冷，加入对羟基苄叉丙酮16.2g((0.1mol)，回流搅拌反应约6.0小时，反应过程中慢慢析出固体，直到反应瓶内全部固化。用TLC检测Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，反应基本完全。过滤，固体用无水乙醇反复洗，干燥。得淡黄色固体。该固体用95％乙醇重结晶，得到淡黄色粉末状固体，然后冷却、过滤，用无水乙醇洗涤，得近白色的盐酸椒苯酮胺粉末状固体，真空干燥，重15.58g，收率60.1％。mp167～169℃。Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，元素分析接近理论值，高压液相色谱检测，纯度约为98.6％。
实施例3
将25.8g(0.12mol)N-甲基胡椒乙胺盐酸盐和36g(1.2mol)多聚甲醛置于500ml圆底瓶中，加入320ml无水乙醇和2.0mol浓盐酸，使PH约为4，油浴温度90℃，加热搅拌至固体全部溶解后，再加热、搅拌10分钟，稍冷，加入对羟基苄叉丙酮16.2g((0.1mol)，回流搅拌反应约9.5小时，反应过程中慢慢析出固体，直到反应瓶内全部固化。用TLC检测Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，反应基本完全。过滤，固体用无水乙醇反复洗、烘干，得淡黄色固体。该固体用乙醇重结晶，得到淡黄色盐酸椒苯酮胺粉末状固体，然后冷却、过滤，用无水乙醇洗涤，得近白色的粉末状固体，真空干燥，收率62％。mp167～169℃。Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，元素分析接近理论值，高压液相色谱检测，纯度约为98.8％。
实施例4
将43.0g(0.2mol)N-甲基胡椒乙胺盐酸盐和45g(1.5mol)多聚甲醛置于1000ml圆底瓶中，加入400ml无水乙醇和浓盐酸，使PH约为3-4，油浴温度95℃，加热搅拌至固体全部溶解后，再加热、搅拌25分钟，稍冷，加入对羟基苄叉丙酮24.3g((0.15mol)，回流搅拌反应约7小时，反应过程中慢慢析出固体，直到反应瓶内全部固化。用TLC检测Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，反应基本完全。过滤，固体用无水乙醇反复洗、干燥，得淡黄色固体。该固体用乙醇重结晶，得到淡黄色粉末状固体，然后冷却、过滤，用无水乙醇洗涤，得近白色的盐酸椒苯酮胺粉末状固体，真空干燥，收率56.4％。mp167～169℃。Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，元素分析接近理论值，高压液相色谱检测，纯度约为98.5％。
实施例5
将32.25g(0.15mol)N-甲基胡椒乙胺盐酸盐和45g(1.5mol)多聚甲醛置于1000ml圆底瓶中，加入350ml无水乙醇和浓盐酸，调整PH约为3-5，油浴温度100℃，加热搅拌至固体全部溶解后，加入对羟基苄叉丙酮16.2g((0.1mol)，回流搅拌反应约7.5小时，反应过程中慢慢析出固体，直到反应瓶内全部固化。用TLC检测Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，反应基本完全。过滤掉溶剂，固体用无水乙醇反复洗，干燥。得淡黄色固体。该固体用95％乙醇加热搅拌，固体很快全部溶解呈浅黄色的澄清溶液，再用3g活性炭脱色，得浅黄色的澄清溶液，放冷后慢慢析出白色粉末状固体，然后冷却、过滤，得近白色的粉末状固体，用无水乙醇洗，真空干燥，得到盐酸椒苯酮胺，收率58.9％。mp168～170℃。Rf＝0.38(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)，元素分析接近理论值，高压液相色谱检测纯度99.5％
实施例6
将1.5g盐酸椒苯酮胺、200ml饱和的碳酸氢钠溶液(pH＝9)和80乙酸乙酯混合，在室温搅拌三个小时，固体逐渐溶解得澄清溶液，TLC反应已完Rf＝0.49(展开剂CH2Cl2∶CH3OH＝10∶0.8)，分出上层乙酸乙酯溶液，用水洗到中性，用无水硫酸钠干燥，过滤，得近白色的粉末状固体，用无水乙醚洗，真空干燥， 得椒苯酮胺粉末状固体1.3g，收率95.6％。mp142～143℃。元素分析结果与理论值接近。
实施例7
按照摩尔比为1∶1.2的比例，将椒苯酮胺分别与氢溴酸、草酸、琥珀酸或马来酸等酸在乙酸乙酯中室温下反应成盐，TLC监测反应，至椒苯酮胺消失，用水洗到中性，用无水硫酸钠干燥，过滤，得近白色的粉末状固体，用无水乙醚洗，真空干燥。分别得到椒苯酮胺氢溴酸盐、椒苯酮胺草酸盐、椒苯酮胺琥珀酸盐、椒苯酮胺马来酸盐盐，元素分析结果与理论值接近。
实验例8
采用如下方法合成N-甲基胡椒乙胺盐酸盐
将0.8mol胡椒乙胺(东北制药厂的中间体)和1.0mol苯甲醛置于1000ml园底烧瓶中，混合均匀，放出大量的热，加入200ml无水甲醇混匀，加入沸石，用电热帽加热，回流反应21小时，减压浓缩除去甲醇，再用油泵减压浓缩除去未反应的苯甲醛，得红棕色油状物，冷却到室温后，再加入100ml苯和1.0mol硫酸二甲酯，外温保持在约80℃反应60分钟，室温静置冷却，待分层后再倾去上面的苯层，然后再加入200ml的75％乙醇，再回流反应40分钟，得暗棕红色不透明液体。加蒸馏水15ml，摇匀后在搅拌状态下，使用水泵减压蒸除乙醇、甲苯和水等溶剂，再用油泵减压浓缩除去苯甲醛，得暗棕红色不透明粘稠油状物，所得极粘稠状物中，加入基本饱和的HCl/无水乙醇溶液至PH＝4，逐渐析出大量固体，过滤，固体用丙酮反复洗、再用无水乙醚洗，得近白色的固体，收率35％，mp186～188℃(dec.)。Rf＝0.23(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)。
实验例9
将1.2mol胡椒乙胺(东北制药厂的中间体)和1.5mol苯甲醛置于1000ml园底烧瓶中，混合均匀，放出大量的热，加入400ml无水THF混匀，加入沸石，用电热帽加热，回流反应15小时，水泵减压浓缩除去THF，再用油泵减压浓缩除去未反应的苯甲醛，得红棕色油状物，冷却到室温后，再加入200ml甲苯和1.4mol硫酸二甲酯，外温保持在约130℃反应40分钟，室温静置冷却，待分层后再倾去上面的甲苯层，然后再加入400ml的75％乙醇，再回流反应50分钟，得暗棕红色不透明液体。加蒸馏水20ml，摇匀后在搅拌状态下，使用水泵减压蒸除乙醇、甲苯和水等溶剂，再用油泵减压浓缩除去苯甲醛，得暗棕红色不透明粘稠油状物，所得极粘稠状物中，加入基本饱和的HCl/无水甲醇溶液至pH＝1-3，逐渐析出大量固体，过滤，固体用丙酮反复洗、再用无水乙醚洗，得近白色的固体，收率40％，mp186～188℃(dec.)。Rf＝0.23(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)。
实验例10
将0.4mol胡椒乙胺(东北制药厂的中间体)和0.8mol苯甲醛置于1000ml园底烧瓶中，混合均匀，放出大量的热，加入150ml无水乙醇混匀，加入沸石，用电热帽加热，回流反应20小时，水泵减压浓缩除去乙醇，再用油泵减压浓缩除去未反应的苯甲醛，得红棕色油状物，冷却到室温后，再加入45ml环己烷和0.6mol硫酸二甲酯，外温保持在约100℃反应20分钟，室温静置冷却，待分层后再倾去上面的甲苯层，然后再加入200ml的75％乙醇，再回流反应50分钟，得暗棕红色不透明液体。加蒸馏水12ml，摇匀后在搅拌状态下，使用水泵减压蒸除乙醇、环己烷和水等溶剂，再用油泵减压浓缩除去苯甲醛，得暗棕红色不透明粘稠油状物，所得极粘稠状物中，加入基本饱和的HCl/无水甲醇溶液至PH＝3.5，逐渐析出大量固体，过滤，固体用丙酮反复洗、再用无水乙醚洗，得近白色的固体，收率380％，mp186～188℃(dec.)。Rf＝0.23(展开剂CH2Cl2∶CH3OH∶HCOOH＝10∶0.8∶0.08)。
实施例11
参照实施例9的方法，不同之处在于向最终得到的粘稠油状物中加入基本饱和的草酸/无水乙醇溶液至Ph＝2，逐渐析出大量固体，过滤，固体用丙酮反复洗、再用无水乙醚洗，得近白色的N-甲基胡椒乙胺草酸盐固体，再参照实施例2的方法合成椒苯酮胺草酸盐。
实施例12
参照实施例10的方法，不同之处在于向最终得到的粘稠油状物中加入基本饱和的琥珀酸/无水乙醇溶液至Ph＝3，逐渐析出大量固体，过滤，固体用丙酮反复洗、再用无水乙醚洗，得近白色的N-甲基胡椒乙胺琥珀酸盐固体，再参照实施例2的方法合成椒苯酮胺琥珀酸盐。
实施例13
参照实施例10的方法，不同之处在于向最终得到的粘稠油状物中加入基本饱和的马来酸/无水乙醇溶液至Ph＝4，逐渐析出大量固体，过滤，固体用丙酮反复洗、再用无水乙醚洗，得近白色的N-甲基胡椒乙胺马来酸盐固体。再参照实施例2的方法合成椒苯酮胺马来酸盐。
实施例14
参照实施例8的方法，不同之处在于加入基本饱和的、草酸、琥珀酸或马来酸等酸/无水乙醇溶液至Ph＝1-3。
比较例
在100ml乙醇中，0.018mol对羟基-苯基-1-丁烯-3-酮，与5ml 36％甲醛和0.018mol N-甲基胡椒乙胺盐酸盐在PH3-4下搅拌回流3小时，再补加5ml 36％甲醛及5ml盐酸，继续反应7小时，浓缩至有固体出现，放冷至室温，再放冰箱2小时，抽滤析出的固体，用乙醚洗涤两次，得3.4g白色固体，收率44％。用无水乙醚重结晶，得到盐酸椒苯酮胺，熔点157-9℃。产物的HPLC谱图见图7。
权利要求
1.椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心血管疾病药物的应用。
2.椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心肌缺血药物的应用。
3.椒苯酮胺或其盐用作制备治疗缺血再灌注损伤药物的应用。
4.椒苯酮胺或其盐用作制备治疗心功能不全药物的应用。
5.根据权利要求1-4任何一项所述应用，其特征在于所述的椒苯酮胺盐为药学上可接受的椒苯酮胺盐，包括椒苯酮胺盐酸盐、椒苯酮胺硫酸盐、椒苯酮胺磷酸盐、椒苯酮胺碳酸盐、或椒苯酮胺有机盐之一。
6.根据权利要求1-4任何一项所述的应用，其特征在于所述的椒苯酮胺盐为椒苯酮胺盐酸盐。
全文摘要
本发明公开了椒苯酮胺或其药学上可接受的盐用作制备治疗心血管疾病药物的应用，尤其涉及椒苯酮胺或其药学上可接受的盐用作制备治疗心肌缺血、缺血再灌注损伤或心功能不全药物的应用；本发明通过药理研究发现，盐酸椒苯酮胺用作制备治疗心血管疾病药物应用时，具有强心扩血管作用，对于实验性心力衰竭、心肌缺血与心肌再灌注损伤均有良好的治疗作用。本发明的研究从心脏生理功能、心肌生化及病理形态学等方面表明椒苯酮胺是一个治疗效果好、毒副反应较低的新化合物，其作用机制不同于已知的心血管病药物，且疗效优于已知的心血管病药物。有可能发展成为治疗心力衰竭、对抗心肌缺血和再灌注损伤的新药。
文档编号A61P9/00GK1395923SQ0212531
公开日2003年2月12日 申请日期2002年7月24日 优先权日2002年7月24日
发明者周力践, 衷小惠, 刘铁球 申请人:广州市众为生物技术有限公司