专利名称：一种用于治疗或者预防个体功能性维生素b的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗或者预防个体功能性维生素B12缺陷的方法以及在该方法中使用的药物组合物。这种功能性维生素B12缺陷最终可能表现为痴呆、其它神经精神性异常和/或血管疾病。
高半胱氨酸是一种来源于甲硫氨酸降解过程的中间氨基酸。在患有叶酸盐、维生素B12(钴胺素)和维生素B6缺陷以及这些化合物代谢过程中的酶遗传性缺失的个体中，高半胱氨酸的血清水平增高。术语高半胱氨酸过多症(hyperhomocysteinemia)是指血液中高半胱氨酸的浓度升高，该症状与心血管、外周血管和脑血管疾病有关。推测高半胱氨酸过多症在阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)的病因学中有潜在的作用。最近的一些调查支持了这种观点(1、2、3、4)。在这些调查中最引人注目的可能就是一项关于组织学上确诊为AD的病人和年龄匹配对照组之间的病案对比研究，研究表明血清高半胱氨酸大于14μmol/L的个体患上AD的风险要比血清高半胱氨酸小于11μomol/L的个体高4.6倍(2)。最近，在Framinhan研究中的一项有1092名老年受试者的预期观察研究也为血浆高半胱氨酸水平和痴呆之间的关联提供了有力的证据(4)。在这项研究中，同基线相比升高的血浆高半胱氨酸水平被作为临床痴呆发展的独立预测指标，大多数高半胱氨酸水平升高都是由于AD所造成的。过了八年随访期的中间时段，痴呆患者发展到111名受试者。那些血浆高半胱氨酸水平最高的人患上AD的风险几乎翻了一倍；血浆高半胱氨酸每增加5μmol，AD风险就会增加40％。上述调查表明高半胱氨酸同AD和血管性痴呆的认知分值(cognitive score)有关。而且，它还表现为健康老人的认知分值下降的一个独立预测指标(5)。
钴胺素的组织缺陷还会造成血清甲基丙二酸的升高。在患有代谢性钴胺素缺陷的AD病人血清中也已证明甲基丙二酸的水平升高(6)。血清高半胱氨酸和甲基丙二酸升高同神经病学的和精神病学的病征和症状(例如震动意识损伤、感觉异常、位置意识损伤、触摸或疼痛知觉损伤、“糖尿病性”神经病、共济失调、步态异常、反射和肌肉力量降低、虚弱、疲劳)以及多种神经病学的和精神病学的疾病有关，包括慢性疲劳综合征、抑郁症和多发性硬化症，表明钴胺素缺陷同这些疾病有着普遍的关联(7)。有趣的是，包括贫血和巨红细胞症在内的钴胺素缺陷一般的血液学病征在这些病人中都普遍缺乏。
以前，患有血管闭塞病或AD的病人都是用叶酸、叶酸盐或其衍生物以及可选的维生素12等治疗(U.S Patent No.6,127 370.Smith等)。然而，给患有高半胱氨酸过多症的病人服用这些化合物并不是总能够减缓这种同高半胱氨酸水平升高相关的症状。前面提出的证据清楚地显示了维生素12缺陷的代谢迹象，这种维生素12的缺陷同AD血管病、增龄相关的认知下降和多种神经精神疾病相关，虽然导致这种关联的精确机理目前还不清楚。
本发明人证实，在AD病人中，通过高半胱氨酸过多症反映出来的B12/叶酸盐缺乏的代谢迹象只是起因于营养状况(通过体重指标确定)而同可能发生B12或叶酸盐吸收障碍的血液学的异常没有关联。此外，这种缺陷同血红细胞叶酸盐的低水平没有关系，再次说明摄取/吸收正常，但是与半胱氨酸的血液水平升高有关，证明是高半胱氨酸转硫作用增加。这些证实由于二次甲基化(remethylation)产生高半胱氨酸过多症的生化过程缺少了经由转硫途径的补偿性流出增加。另外，关键的抗氧化剂谷胱甘肽的血液水平同病情的严重程度呈反相关。
综上所述，上述发现表明AD病人是“功能性”维生素B12缺陷，而不是由于维生素吸收降低(例如恶性贫血)造成的“典型”缺陷。最近的报道进一步显示了支持AD病人功能性维生素12缺陷的证据(8)。报道清楚地显示了氧化压力同AD病人血浆以及脑脊髓液中高半胱氨酸浓度升高之间的关系。血管内皮和神经组织对氧化压力特别敏感。这种压力作用于维生素B12的细胞内代谢而产生维生素B12的功能性缺陷。内皮细胞和神经元都缺乏完整的转硫途径从而削弱了它们合成抗氧化剂谷胱甘肽的能力。两种组织也都缺乏其它的方式通过甜菜碱，即甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶，来再甲基化高半胱氨酸(9)。当甲硫氨酸合 酶反应被氧化压力削弱时，高半胱氨酸的细胞输出增加就因此成为这些组织能够得到的唯一途径。
本发明人所认识到的这种由于B12代谢受到氧化压力的影响而产生“功能性”维生素B12缺陷，可以通过高半胱氨酸和/或甲基丙二酸的血清水平升高，和/或血清总B12的低水平和/或B12运载蛋白质钴胺素传递蛋白全酶(holo-transcobalamin)的低水平来反映。功能性的维生素B12缺陷通常不会发生任何可证明的维生素吸收障碍以及相关联的血液组织异常。对这种功能性障碍的认识，使本发明人发明了一种用于治疗和/或预防与之相关症状的方法和组合物。
本发明的目的就在于提供一种改进的方法来治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，这些个体可能最终会发生痴呆、其它神经精神性异常和/或血管疾病。这些症状都是由于生化途径中的氧化压力造成的。
本发明的进一步目的是提供一种改进了的药物组合物来用于治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，这些个体可能最终会发生痴呆、其它神经精神性异常和/或血管疾病。
因此，本发明的第一个方面提供了一种方法来治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，该方法包括给病人施用治疗有效量的药物组合物，该组合物能够直接或间接地提供钴胺素分子的上β-轴配体的钴-硫键，从而促进钴胺素分子的细胞内加工。
本发明的第二个方面提供了药物组合物来治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，该组合物包括化合物或者化合物的组合，直接或间接地为细胞内钴胺素分子的上β-轴配体提供钴-硫键从而促进钴胺素分子的细胞内加工。
钴胺素分子的上β-轴配体的钴-硫键可以通过施用治疗有效量的已经含有钴-硫键的巯基化钴胺素(thiolatocobalamin)直接提供，或者通过联合施用维生素B12(氰钴胺)或其带有含硫分子的衍生物，比如谷胱甘肽或其前体来间接提供。
该药物组合物能够促进承受氧化压力的组织，特别是神经组织和血管内皮的细胞内钴胺素加工。
任何适当的巯基化钴胺素都可能直接提供钴-硫键，包括优选的化合物谷胱甘肽钴胺素(CAS；129128-04-7)和相关的具有通式Coα-[α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)]-Coβ-配基(ligandyl))钴胺酰胺的含硫钴胺素，在这种含硫钴胺素中上β-轴配体基团通过一个硫钴键同钴胺酰胺配位，诸如(不限于)亚硫酸钴胺素(Sulphitocobalamin)(syn-亚硫酸钴胺素；CAS15671-27-9)、半胱氨酰钴胺素(CAS；60659-91-8)、环己基巯基化钴胺素(cyclohexylthiolatocobalamin)和五氟苯基巯基化钴胺素(pentafluorophenylthiolatocobalamin)等。
为此，本发明的第三个方面提供了一种方法用于治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，该方法包括给所述个体施用治疗有效量的巯基化钴胺素。
第四个方面提供了一种药物组合物用于治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，该药物组合物包括巯基化钴胺素。
本发明的第五个方面提供了一种方法用于治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，包括给所述个体施用治疗有效量的维生素B12或其衍生物，该衍生物选自羟钴胺素、甲基钴胺素和腺苷钴胺素结合治疗有效量的谷胱甘肽和/或谷胱甘肽化合物的前体，该前体选自N-乙酰半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸盐、L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟甲苯、γ-谷氨酰基半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸和乙酰肉碱等化合物用于促进细胞内钴胺素加工。
本发明的第六个方面提供了一种药物组合物用于治疗或预防个体的功能性维生素B12缺陷，该组合物包括维生素B12或其衍生物，该衍生物选自羟钴胺素、甲基钴胺素和腺苷钴胺素结合谷胱甘肽和/或谷胱甘肽化合物的前体，该前体选自N-乙酰半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸盐、L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酸乙酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟甲基、γ-谷氨酰基半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸和乙酰肉碱等化合物用于促进细胞内钴胺素加工。
根据本发明的这一方面，该药物组合物优选地包括维生素B12，或其衍生物，以及N-乙酰半胱氨酸或α-硫辛酸。
该药物组合物特别地适用于促进易受氧化压力影响的神经组织和血管内皮的钴胺素加工。
应当理解巯基化钴胺素、谷胱甘肽、谷胱甘肽前体和/或钴胺素的联合治疗也可以用于病人的治疗。
另外，该药物组合物可以同其它化合物共同使用来帮助针对神经精神性和/或血管疾病的治疗作用。例如，该组合物可以同其它一些参与高半胱氨酸代谢的因子共同使用，诸如叶酸盐和/或维生素B6。该组合物也可以同任何甲基供体共同使用，诸如，但不限于，叶酸、甲基叶酸盐、S-腺苷甲硫氨酸、甜菜碱、胆碱和肉碱。
任何合适的给药模式都可以使用，比如(但不限于)口服、舌下、静脉和肠胃外给药。
为了更好地理解本发明和更清楚地表明其是如何起作用的，用下面的实施例作为参考，其中实施例1研究了临床诊断为阿耳茨海默氏病(AD)病人中高半胱氨酸、血液学指标同痴呆持续时间之间的关系，实施例2研究了谷胱甘肽前体(N-乙酰半胱氨酸或α-硫辛酸)和羟钴胺素(维生素B12的一种衍生物)的联合用药对患有功能维生素B12缺陷和同时患有神经精神性异常病人的治疗效果，实施例3为DSM-IV标准的阿耳茨海默氏型初级退化性痴呆患者的功能性维生素B12缺陷提供了证据，同时还研究了它和认知分值之间的联系，参考如下附图，其中
图1甲硫氨酸合酶反应的主要活化循环图解；图2甲硫氨酸合酶还原酶再活化cob(II)-alamin图解；图3高半胱氨酸代谢为谷胱甘肽(GSH)的转硫途径图解；图4氧化压力对高半胱氨酸流出的影响以及对神经和血管内皮钴胺素代谢的影响图解；图5点图显示了ADAS-Cog分值同DSM-IV标准的阿耳茨海默氏型级退化性痴呆患者(实心圈)和对照(空心圈)血浆谷胱甘肽之间的联系；本发明涉及对高半胱氨酸过多症在与AD、血管疾病和老化共同的致病机理的意义的认识。特别是已经发现这种机制涉及对高半胱氨酸代谢中关键酶周围的氧化还原状态的影响。该机制的一个不可避免的影响就是通过β-配体转移酶和钴胺素还原酶的神经细胞内和内皮细胞内钴胺素加工的异常。由于缺乏关键的Co-S键而导致该特定的代谢阻断，目前所用的钴胺素药物制剂，比如羟钴胺素(CAS13422-51-0)、氰钴胺素(“维生素B12”CAS68-19-9)、甲基钴胺素(CAS13422-55-4)和腺苷钴胺素(“辅酶B12”CAS13870-90-1)，不能被神经细胞和血管内皮细胞利用。然而，使用谷胱甘肽钴胺素或任何相关的有着通式Coα-[α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)]-Coβ-配基)钴胺酰胺的含硫钴胺素，在这种含硫钴胺中上β-轴配体基团通过一个硫-钴键同钴胺酰胺配位(即巯基化钴胺素)，都能克服这种与氧化还原相关的代谢阻断。钴胺素分子上β-轴配体的钴-硫键的存在是钴胺素的细胞内加工所必须的先决条件。神经元和血管内皮在氧化压力条件下不能产生该键。因此，本发明所提供的方法和组合物保证了神经元和血管内皮中钴胺素上存在钴硫键，要么是通过施用巯基化钴胺素直接提供钴硫键，要么是通过共同施用目前所用形式的维生素B12加上含硫分子谷胱甘肽或它的一种前体，比如N-乙酰半胱氨酸(NAC)或α-硫辛酸，间接地提供钴硫键。
为了能够确定身体内高水平的高半胱氨酸的影响以及理解氧化压力对高半胱氨酸水平和钴胺素代谢的影响，了解这些物质在体内的作用是非常重要的。高半胱氨酸是甲硫氨酸代谢过程中一个关键的连接代谢物。高半胱氨酸可以通过甲硫氨酸合酶(MS)的方法被甲基化，或者通过胱硫醚β-合酶(CBS)转硫而形成胱硫醚。后者随后被转换成半胱氨酸，一种还原性谷胱甘肽(GSH)的前体。
针对纯化的哺乳动物MS和CBS的研究揭示，这些连接酶(junctionenzyme)对氧化敏感，这暗示这些途径的氧化还原调节可能具有重要的生理学意义(10)。大约人肝脏细胞中细胞内GSH池的一半来源于经由转硫途径的高半胱氨酸。这些途径的氧化还原敏感性可以被合理地认为是一种细胞应对氧化压力而增加GSH合成的自动校正应答。因此转硫途径对于保持细胞内GSH池十分重要，而且该途径的调节在氧化压力的条件下会发生改变。
已经有了相当多的证据暗示了AD中的氧化压力(11)。由于一些原因，大脑特别容易受到氧化压力的攻击。同其它组织相比大脑含有高浓度的催化态的铁和相对低水平的抗氧化酶。膜脂非常丰富，而且多不饱和脂肪酸与过氧化反应有关，并具有很高的能量需求，而这种需求几乎全都由氧化磷酸化满足的。虽然在大脑老化中普遍发现氧化反应的损害，但是在AD病人中损害更为严重。
而且，氧化压力最近也和健康老年人的认知下降联系起来。一项有1166名年龄在60至70岁的高认知功能受试者的研究证实氧化压力的增加或者抗氧化剂缺陷都是伴随年龄增长而发生认知下降的风险因素(12)。
氧化压力危及痴呆及血管疾病中钴胺素(维生素B12)代谢的途径有三个。第一，在正常的甲基化循环(如附图中图1所示)中高半胱氨酸的硫醇盐与结合MS的甲基钴胺素的甲基(CH3)基团反应产生甲硫氨酸和4配位的cob(I)alamin。组氨酸(MS的His759)形成低轴钴配体，替代位于甲硫氨酸合酶疏水口袋(*＝电子)中的二甲基苯并咪唑(DMB)。然后，Cob(I)alamin，高度反应性的钴胺素种类，与甲基THF的活化形式反应产生游离的THF，同时再生甲基钴胺素。
经由质子化作用和去质子化作用，甲基钴胺素在酶结合Cob(III)alamin和游离Cob(I)alamin状态之间循环，如图1所示。当Cob(I)alamin被异常地氧化为Cob(II)alamin时，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和一个电子源(*)再生MS的激活形式(见图2)。在其它人钴胺素依赖酶系统中，包括甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)，上轴碳-钴键异裂而不是均裂，而且钴原子保留在相对惰性形式的Cob(II)alamin中。氧化压力削弱MS的功能，同时相对保留变位酶的活性。因此，氧化压力的结果就是增加高半胱氨酸的水平。氧化性损害也与钴胺素类似物的形成有关，这些类似物已经在体内得到证明而且最近在AD中也被发现(14)。
第二，氧化压力刺激胱硫醚β-合酶(CBS)活性的一个结果就是增加高半胱氨酸经由转硫途径流出(见图3)。CBS的氧化还原敏感性或许代表了一种自我校正应答，其使细胞在受到氧化压力的攻击时增加细胞内谷胱甘肽(GSH)的水平(10)。然而，在神经元中由于缺少胱硫醚酶并因此谷胱甘肽水平低，造成神经元特别容易受到这种影响(图4，a)，就如在血管内皮细胞中CBS的低活性所造成的结果一样(图4，b)。
第三，在神经细胞和血管内皮细胞中，氧化压力对钴胺素代谢有着更为严重的影响。已经报道过，参与多种类型钴胺素加工的关键酶通过钴胺传递蛋白(TC)随着传输系统进入细胞(15)，见图4。结合到TC中的钴胺素不同β-配体形式被内化并且转化为甲基和腺苷基形式。假如钴胺素是通过适当的氧化还原形式(Cob(I)alamin或Cob(II)alamin)得到的话，甲基钴胺素作为甲基转移反应的中间产物在甲硫氨酸合酶的催化反应中形成。
谷胱甘肽钴胺素(GS-Cb1)，细胞内自然发生的一种钴胺素形式，是钴胺素酶生物合成中的近前体(15)。β-配体转移酶(β-LT)是一种利用FAD、NADPH和还原性谷胱甘肽(GSH)的胞质酶。虽然这项研究利用的是氰钴胺素，但是很有可能CN-Cb1β-配体转移酶催化新内化钴胺素与GS-Cb1(专性细胞内中间产物)的一般的β-配体消除反应。
也研究了Cob(III)alamin还原酶(CR)的作用(15)。该研究利用aq-Cb1、GS-Cb1和HSO3-Cb1为底物，但是优选地是后两者。当利用Me-Cb1、Ado-Cb1或CN-Cb1为底物时，很少或着没有还原酶活性能够观察到。反应产物Cob(II)alamin结合到胞质MS上(或者在线粒体中被进一步还原为Cob(I)alamin，之后再转换为甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅因子腺苷钴胺素)，见图4。
因此，钴胺素的细胞内加工需要还原性谷胱甘肽(GSH)来产生钴胺素的专性细胞内中间产物形式(GS-Cb1)，它有一个必要的钴-硫键。GSH是一种广泛存在的三肽，由甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸组成。谷胱甘肽参与许多重要的细胞功能，包括蛋白质合成、酶活性、代谢和针对氧化压力的保护作用。神经元和血管内皮细胞中GSH的合成依赖于其前体的存在。谷氨酸和甘氨酸是通过几个代谢途径合成的，因此它们对GSH合成的影响有限。然而神经元和内皮细胞GSH水平却受到半胱氨酸或其氧化形式胱氨酸的供应情况的强烈影响。半胱氨酸迅速地氧化为胱氨酸，胱氨酸主要存在于细胞外。胱氨酸通过胱氨酸/谷氨酸反向转运体吸收进神经胶质细胞，继而还原为半胱氨酸。神经元不能将胱氨酸还原成半胱氨酸，也不能将胱硫醚转换为半胱氨酸(见图4，a)，因此依赖神经胶质细胞的半胱氨酸来保持它们的GSH水平。半胱氨酸已经被证实是神经元GSH合成的限速前体。所以神经元中谷胱甘肽的量很低。类似地，血管内皮细胞也缺乏从高半胱氨酸合成内源性半胱氨酸的能力(见图4，b)。
在氧化压力条件下，神经元和血管内皮细胞通过转硫途径的方法不能增加还原性谷胱甘肽的水平，导致这些组织中还原性谷胱甘肽迅速耗净。既然这是专性细胞内钴胺素中间产物谷胱甘肽钴胺素(GS-Cb1)的必需前体，神经元和血管内皮细胞的钴胺素代谢就受到了威胁。高半胱氨酸水平因此将会增加，甚至在有害的“前馈”级联反应中。本发明人已经认识到只有当神经元和内皮细胞中存在钴-硫键，钴胺素才能克服这种障碍并且在这些组织中减少高半胱氨酸，同时也认识到这可以通过直接施用巯基化钴胺素，比如合成的谷胱甘肽钴胺素(生产方法在GB945772中有叙述)，或者间接地通过联合施用维生素B12和谷胱甘肽或其一种前体，比如N-乙酰基半胱氨酸(CAS616-91-1)、甘氨酸(CAS56-40-6)、L-谷氨酸(CAS56-85-9)、L-氨基乙磺酸(CAS107-35-7)、L-甲硫氨酸(CAS63-68-3)、α-硫辛酸(CAS62-46-4)、半胱氨酰甘氨酸(CAS19246-18-5)和S-腺苷甲硫氨酸(CAS2998-03-0)，来完成。
实施例1.
研究了临床确诊的AD病人中高半胱氨酸、血液学指标和痴呆持续期时间的相关性。这是一个假定，如果“典型的”维生素B12吸收障碍产生了维生素B12缺陷的代谢迹象，那么痴呆持续时间增加就应该与血液学异常的发展有关。
病人从Wrexham Maelor Psychogeriatric Assessment Service募集，病情特点同阿耳茨海默氏型初级退化性痴呆患者的DSM-IV标准一致。对照是健康的、认知完整、按年龄和性别相配的老年自愿者，来自位于主要是较底社会经济阶层的类似半农村地区的GeneralPractice人群。病人或者对照人员服用维生素B12或叶酸盐补充物，或服用已知对高半胱氨酸没有影响的药物。
记录病例组和对照组的认知分值(简易智能状态检查(MiniMental State Examination，MMSE)和阿耳茨海默氏病评定量表的认知次级量表(Alzheimer Disease Assessment Scale，ADAS-Cog))(16，17)。
在评价时，体重指数(BMI)通过测量身高和体重来确定。痴呆的持续时间(以月计)尽可能从记录中确定，或者从最近的亲属或护理人员处得知。
用非禁食的(non-fasting)血液标本进行全血记数、红细胞叶酸盐(RCF)、肌酸酐、B12、叶酸盐和高半胱氨酸检测。静脉穿刺后一小时内分离并冻存血液标本。
用自动细胞记数器来测量血红蛋白(Hb)浓度和MCV(CoulterGen-S，Beckman Coulter，High Wycombe，Bucks，UK)。通过在该仪器上红细胞体积柱形图上的频率计算得到红细胞分布宽度(RDW)。从宽范围的细胞体积的细胞可以得到一条宽的曲线，这条曲线产生隆起的RDW。按照制造商提供的方法，用一种自动生化分析仪分析肌酸酐(Synchron LX-20 analyser，Beckman Coulter，HighWycombe，Bucks，UK)，一种自动化学荧光分析仪计量叶酸盐、维生素B12和RCF(ACS180 SE，Bayer plc，Newbury，Berks UK)。高半胱氨酸用自动HPLC系统(Ds30 Hcy Analyser，Drew Scientific Groupplc，Barrow in Furness，Cumbria，UK)检测。高半胱氨酸的所有形式都进行检测，包括蛋白结合的、非蛋白结合的、游离的氧化态(二聚体和混合的二硫化物)和还原态的形式。因此，给出的数值通常是指“总”血浆水平。
用Mann-Whitney U检验来比较两组结果。(Statistic for Windowsv5.5，StatSoft，Inc.，Tulsa，OK)。中值(median value)是用四分位距得出。通过使用线性连接单位函数(linear link function)，用广义线性模型(generalized linear model)来评价变量之间的关系。回归系数的可信区间是95％。
这项研究募集了44个病人和55个对照受试者。关于年龄、性别、BMI和肌酸酐在这两组人群中都没有显著差异。在认知功能分值上病人的分值明显更低(p＜0.000 1)，见下表1。
表1
Hb、WBC、血小板、MCV、RDW、B12或RCF在两组之间没有显著差异。同对照组相比，病人组的血清高半胱氨酸水平更高(p＝0.0008)而血清叶酸水平更低(p＝0.02)，见下表2。
表2对照 病人Hb(g/dl) 13.4(12.5-14.4)12.8(12-14.0)WBC(×109/1) 6.9(6.1-8.0) 6.9(6.0-8.2)血小板(×109/1) 219(184-277) 219(181-271)MCV(fl) 90.6(87.8-94.0)90.0(87.7-93.5)RDW 13.4(12.9-14.0)13.6(12.9-14.4)B12(ng/l)324(291-445) 328(268-421)叶酸盐(μg/l) 11.1(8.2-14.5) 9.1(6.4-11.7)RCF(μg/l)332(272-429) 282(243-399)高半胱氨酸(μmol/l) 9.8(8.5-12.5) 12.2(9.4-15.7)广义线性模型用于确定病人组中血液学变量和疾病持续时间之间的关系。性别作为另一个变量包括在内。
痴呆持续时间的增加同血红蛋白(Hb＝13.67-0.023(-0.003到-0.04)X持续时间+0.02(-0.2到0.61)X性别；p＝0.02)和血小板数(血小板＝246.6-0.96(-1.79到-0.13)X持续时间-5.3(-22.2到11.7)X性别；p＝0.03)的轻微下降相关。
疾病持续时间同WBC、MCV或RDW之间没有联系。随着痴呆持续时间的增加，高半胱氨酸而不是维生素B下降(高半胱氨酸＝16.4-0.085(-0.17到-0.002)X持续时间+1.95(0.25到3.65)X性别；p＝0.048)。
这项研究证实了早先的观察，在临床诊断为AD的病人中血浆高半胱氨酸增高而血清叶酸盐水平降低(3、4)。随着痴呆持续时间的增加血红蛋白和血小板数轻微下降，而且血液学指标没有其它的变化；特别是巨红细胞症和RDW同疾病持续时间也没有关联，而且没有病人贫血。
因此AD病人表现出“功能性”维生素B12/叶酸盐缺陷而没有出现“典型的”血液学指标。AD中血清叶酸盐低而红细胞叶酸盐正常说明这些病人是叶酸盐负平衡，也就是分解代谢的叶酸盐比吸收的多。
Lindenbaum等(7)认为维生素B缺陷的神经精神病特征要先于血液学变化。然而，目前的资料清楚地显示在AD病人中的情况并非如此。这证明维生素B缺陷和AD之间的联系是由于与典型的营养不良或吸收障碍相关综合征以及它们相关血液学后遗症完全不同的致病机制所造成。在造血组织相对贫乏AD病人中存在“功能性”大脑B12/叶酸盐缺陷。
一般认为与AD相关的大脑氧化压力对维生素B12代谢的影响是这种“功能性”缺陷的原因。氧化压力增加甲硫氨酸合酶反应过程中产生的维生素B12中间产物形式的氧化，由此削弱了高半胱氨酸的代谢。而且，氧化压力危害了神经细胞内维生素B12还原为其代谢活性状态。由于这种压力局限在脑组织而造血甲硫氨酸合酶活性相对不受影响，这样就可以解释这些病人中没有贫血和巨红细胞症了。
现有的资料还显示AD和叶酸盐状态之间的关系反映出过度的叶酸盐代谢。甲硫氨酸合酶失活导致叶酸盐处于甲基四氢叶酸形态。多聚谷氨酸反应——细胞内留滞的前提——难以得到叶酸盐，同时又被释放到细胞外。既而分泌到尿液中，最后导致叶酸盐的耗尽。在这一过程中没有造血组织的参与，这就解释了红细胞叶酸盐值的正常和没有贫血的原因。
维生素B12(氰钴胺素)、腺苷钴胺素和甲基钴胺素在β-轴位置上有钴-硫键而羟钴胺素有一个钴-氧键。因此，由于细胞内谷胱甘肽供应的减少，而细胞内谷胱甘肽是将钴键转换为钴-硫键并因而成为代谢的活性形式的必须的，所以这些通常使用的药物衍生物不能被氧化压力条件下的神经组织利用。谷胱甘肽钴胺素或相关的巯基化钴胺素，在它们上面钴胺素分子的上β-轴配体已经有了一个硫-钴键，可以克服这种氧化还原相关的代谢阻断，而且因此减少氧化压力作用于神经组织带来的症状。联合施用维生素B12和谷胱甘肽或其前体也能够通过提供不可缺少的钴-硫键来克服这种代谢阻断。上β-轴配体硫-钴键的供应应该在治疗和/或预防与代谢或其它维生素B12缺陷相关的神经精神性和/或血管疾病中特别的应用，特别是那些上面实施例所证明的没有或没有明显贫血和巨红细胞症体征的疾病。由于骨髓不象神经组织，它能够代谢高半胱氨酸，这样就有充足的谷胱甘肽来抵抗氧化压力并且产生专性细胞内钴胺素中间产物——谷胱甘肽钴胺素——的硫-钴键，所以这种情况不会产生贫血。
实施例2本实例研究了通过联合施用羟钴胺素和谷胱甘肽前体(N-乙酰基半胱氨酸或α-硫辛酸)产生的钴-硫键对7个患有神经精神性异常病人的症状的影响。
病人1在1994年，一位78岁的老年妇女就诊了全科医生(GP)，几个月来感觉疲劳、嗜睡、颤抖、睡眠方式紊乱、抑郁和不适。在1991年内科医生已经对她的不适症状进行了评价，当时她还主诉有痛苦、悲伤、憋气等感觉，偶尔还有有团块在喉咙里的感觉。然而临床检查并没有发现明显的特征而且感觉她的问题与焦虑有关。病人的生化和血液学检查完全正常，于是让病人离开了。当时没有检查病人的维生素B12和叶酸盐的水平。
1994年的检查也没有明显的临床上的异常，只有轻微的口角干裂。考虑到这些年症状的持久性，进行了进一步的血常规检查。虽然没有贫血(Hb 11.9)也没有巨红细胞症(MCV 90.0)，但是发现她的血清维生素B12的水平极低(11ng/l)(实验范围＞190ng/l)。一个月后再次检查该指标，仍然很低只有29ng/l。其血清和红细胞叶酸盐的水平正常(分别为12μg/l和299μg/l)。安排了进一步的检查，发现病人有胃壁细胞抗体但是没有内因子抗体。其Schilling检验完全正常。开始进行每月的羟钴胺素注射后病人的感觉非常好。她还发现当她有时错过了注射后她的口腔疼痛就会复发。虽然仍保持轻微的焦虑，但是她的神经精神病症状开始很大改善。
然而，病人从1998年起开始缓慢产生记忆损伤同时又出现了悲伤的症状。她的记忆损伤有着短期记忆问题的特点，而且伴随有明显的渐进恶化。虽然没有严重的行为问题，但是病人在记起名字以及人和名字对号上出现困难。
在2000年3月的智力检查(mental examination)中，病人表现出亲切、合作、健谈和高兴等情绪。没有精神运动激动或迟缓的体征，而且也没有功能性精神病的特点。她没有过度地悲伤或悲观，而且在形式和内容上她的谈话都显得合理。然而关于认知功能却表现出明显的缺乏。虽然有定时能力，但是仍然可以证明她有短期记忆缺失。在简易智力状态检查(Mini-Mental State Examination，MMSE)中，她的分值是21/30(16)，同时还感觉她患有早期的痴呆，也许伴随有相关的抑郁特点。她开始接受抗抑郁剂治疗和社会支持。
在接受了6个月的抗抑郁剂治疗后，虽然她的抑郁症特点慢慢改善，但是认知减退却无情地继续着。在这整个时期她一直在接受每月定时的羟钴胺素注射。一年后，她的认知技能进一步减退。此时(2001年2月)她的MMSE分值为18/30，ADAS-Cog分值为28/70(17)。考虑到她的神经精神性异常的持久性，除了按时施用羟钴胺素外，为了确保神经细胞钴胺素分子上钴-硫键的存在并因此促进神经细胞钴胺素代谢，在病人知情同意的情况下，在她的治疗药物中每天加入了N-乙酰基半胱氨酸(600mg)。
在两周后的重新评估中，她丈夫报告了她记忆的一些显著的改善。她能够记住曾需努力回忆的名字和面孔。她的自我感觉也相当良好。重复的认知评估表明她的MMSE分值提高到了21/30，同时ADAS-Cog分值也改善了8个点达到20/70。ADAS-Cog分值发生7个点的变化就被认为有临床意义(18)。改善的主要方面在定向、记录，复制能力、单词回忆、命名(naming)和命令(commands)的分值。在病人的4周评估时这些明显得到改善的方面仍然保留下来，同时病人的ADAS-Cog分值又增加一分，这证明病人在构成性行为(constructional praxis)上有显著的改善。
因此该研究证明，联合给药维生素B12和其它能够保证神经细胞钴胺素分子上钴-硫键存在的化合物(即N-乙酰基半胱氨酸)可以帮助减轻与氧化压力相关的症状，比如认知减退。
病人21995年一位70岁的老年妇女向全科医生介绍了她短期记忆丢失的1年病史。她没有重大的以往病史。在她的初次评估中认知缺陷相对轻微；其简易智力状态检查分值为27/30。而且，一位看过她病的老年精神病医生感觉，此时她的认知缺失并不能断定为痴呆。然而，在之后的18个月里她的记忆问题恶化。在重新评估中她的智力状态检查分值为26/30，给人感觉她可能患有“增龄相关的记忆损害”。
18个月后再次复查她的认知功能。她丈夫报告说她的记忆似乎更加恶化了，她有时会答非所问。日常生活能力下降。简易智力状态分值下降到22/30，这可以得出结论她一直遭受着缓慢的增龄相关的认知减退。她开始接受乙酰胆碱酯酶抑制物试验，但遗憾的是由于副作用试验不得不中断，而且在第一个数周的治疗中没有明显的有益效果。
1999年病人接受了进一步的正式认知评估，MMSE分值为22/30，ADAS-Cog分值为19/70。她最明显的缺陷方面仍然是和短期记忆相关。几个月之前她开始服用叶酸补充剂，但是症状没有发生明显的改变。现在她的血清维生素B12(195ng/l)和血浆谷胱甘肽(2.1μmol/l)都已经达到临界低点。她因此开始进行每月注射羟钴胺素。她丈夫感觉这个治疗没有使她的病情发生明显的变化。6个月后，她的认知功能没有发生变化；MMSE分值为21/30。由于她谷胱甘肽水平低，在治疗方案中加入了口服N-乙酰基半胱氨酸(600mg)。一个月后，她丈夫报告说她似乎更有生气了、更高兴而且更健谈。事实上，她的实践护士注意到许多个月来她第一次可以同她进行合理的交谈，而且她的一般行为也有明显的改善。在正式的认知评估中她的MMSE分值引人注目地提高到了25/30——最显著的变化在于她重新获得了几分钟后能记住3个物体的能力。
这位妇女患有的是增龄相关的记忆损害而不是痴呆病。虽然每月肌肉注射羟钴胺素她的症状有了轻微的好转，但是在口服了N-乙酰基半胱氨酸后她的认知分值才得到显著的改善，特别是在她的短期记忆。本实施例证明保证钴-硫键不仅对阿耳茨海默氏病人而且对普通的年龄相关的认知缺陷的效力。
病人31994年一位77岁的老年妇女向她的全科医生介绍了几个月来不断严重的意识混乱和失意病史。该妇女患有早发阿耳茨海默氏病。在检查中她表现出时间定向障碍，但是在方向和人定向上没有问题。她有明显的短期记忆损伤。常规检查显示她的维生素B12缺乏(172ng/l(实验参考范围＞190ng/l))，但是血清叶酸盐(10.1μg/l)和RCF(321μg/l)都正常。特别是没有巨红细胞性贫血的迹象(Hb 13.4，MCV89.2)。
她开始接受每月羟钴胺素注射(1000mcg/mg)。然而在之后的2年里精神状况仍然持续恶化，同时她开始诉述有疲劳和虚弱等症状。后来发展到视觉幻觉，接着就是迫害妄想。当时(1996)的认知试验表明虽然她知道自己的地址，也有正常的工作记忆，但是时间定向力却很差。虽然她私人细节的逆行性(retrograde)记忆很好，但是顺行性记忆却很差。她的语言使用较好，但是对一些低频词有命名障碍，而且重复能力差。书写也受到影响。她表现出构造性运用障碍形式的顶叶(parietal lobe)功能障碍体征。额叶功能较好。感觉她可能患有阿耳茨海默氏型痴呆病。她被送到护理病房，但是她的一般状况继续在恶化。在1997年的进一步认知检查中MMSE分值只有13/30。
她开始接受乙酰胆碱酯酶抑制物的治疗，而且其家人感觉她的状态有了轻微的改善。在重复评估中她的MMSE分值为15/30；她仍然分不清时间，但是没有命名性言语困难(nominal dysphasia)，而且其注意力和集中能力也合理。结合按时服用羟钴胺素的药物治疗继续进行。
然而她的身体状况以及精神状况在持续恶化，而且在1998年发展到言语困难和体重下降。当时在一项简化的智力试验中她的分值只有3/10。她被允许住院并发现患有了3级食管炎。在接受了质子泵抑制物治疗后她的吞咽困难症状慢慢解除了。
然而她的一般身体状况和精神状况在持续恶化。2001年6月每日口服600mg的N-乙酰基半胱氨酸被加入到治疗中，虽然当时她正患有严重的痴呆。然而她的家人和护理人员注意到并认为通过治疗她的状况有了明显的改善。她变的比通常更加灵敏和聪明，而且似乎可以认出她的至亲家人；考虑到痴呆的严重程度和身体状况，没有让她接受正式认知评估。几周后她的身体状况恶化并死于支气管肺炎。
这个妇女很可能患有阿耳茨海默氏型痴呆病同时伴随有维生素B12缺陷。然而这种缺陷不太可能是由于营养不良(她的叶酸盐耗尽)或吸收障碍(没有巨红细胞贫血或血液学问题的迹象)。很可能的是她有“功能性”维生素B12缺陷，这种缺陷是与阿耳茨海默氏病相关的大脑氧化压力的结果。在试图用羟钴胺素校正该缺陷时不能阻止她的认知减退。然而即使在疾病后期，身体状况恶化，由于联合给药N-乙酰基半胱氨酸和羟钴胺素来提供了神经元钴胺素上轴配体的钴-硫键，她的精神状态仍然得到了改善。
病人41994年一位65岁的老年男性向他的全科医生介绍了他渐进性记忆损害的三年病史。他的妻子报告说他经常会忘记关门或锁车。他没有迷路病史(wandering history)或任何抑郁病的特征提示。他的食欲很好，也没有体重下降病史。他最近在洗澡和穿衣方面出现了困难。他没有重大的以往医疗史，也没有精神病或痴呆的家族病史。
体检没有发现明显的问题，也没有神经学方面的缺陷。在智力状态检查中他分得清地点和人，但分不清时间。他在复制图形(copyingfigures)上有困难，而且有中度到严重的近期和远期记忆损害。他不能正视自己的记忆丧失，还否认有任何特别的忧虑或问题。他的简易智力状态分值为17/30，CAMDEX分值54。
包括血细胞数、尿液和电解质、葡萄糖、肝和甲状腺功能测试在内的血常规检查都在正常范围内。他的血清维生素B12和叶酸盐水平也分别在274ng/l和3.9μg/l的正常范围内(正常范围＞190ng/l和＞2.2μg/l)。他的红细胞叶酸盐也正常，为396μg/l(正常范围＞170μg/l)。然而他被发现有明显升高的禁食血清高半胱氨酸23.7μmol/l)。脑部CT显示有中度的大脑萎缩但没有其它的异常。
几位老年精神病专家对他进行了检查，诊断为可能具有阿耳茨海默氏型痴呆。根据其高半胱氨酸异常的结果，他开始接受每月的羟钴胺素注射(1,000mg/ml)以及叶酸补充(每天5mg)。然而他的认知功能仍然继续缓慢地恶化。到了1997年他的妻子发现在家照顾他变的越来越困难。当时给人的感觉是由于严重的痴呆他不适合使用乙酰胆碱酯酶抑制物。他被送到专门的护理病房接受全天的护理。在这整个时期他一直在接受每月的B12注射和口服叶酸盐补充物治疗。
1999年对他的认知功能再次进行了正式的评估。当时他的简易智力状态检查分值只有5/30，ADAS-Cog评估分值只有70，确定了严重的痴呆。现在他的血清高半胱氨酸水平为5.7μmol/l，刚好在正常范围内，但是血浆谷胱甘肽的水平低，为2.5μmol/l(正常范围在3-5μmol/l)。因此作为口服谷胱甘肽前体，每天加入600mg的N-乙酰基半胱氨酸到他的B-维生素补充治疗中。虽然认知分值没有提高，但是他明显地减少了焦虑不安，更加听从对他的护于照顾，而且他的护理人员注意到他的查字能力也很有提高。他的一般行为有了显著的改善。在治疗中加入N-乙酰基半胱氨酸给他妻子留下了深刻的印象；许多年来他第一次尝试和妻子交流。现在当妻子来看望他时他一再地好象认识她，这让妻子非常震动。在他的治疗从N-乙酰基半胱氨酸变为50mg每天两次另一种谷胱甘肽前体α-硫辛酸后的一年中她的临床改善得到保持。
血清高半胱氨酸水平显著升高表明病人患有伴随功能性维生素B12缺陷的阿耳茨海默氏型痴呆。虽然每月的羟钴胺素注射和口服叶酸盐补充物治疗校正了血清高半胱氨酸的水平，但是却不能停住痴呆的进程。然而，在他的疾病后期，发现他谷胱甘肽的血浆水平低。因为这是维生素B12细胞内加工的必需前体，所以尝试通过联合给药N-乙酰基半胱氨酸来增加他的谷胱甘肽水平。这导致病人的一般健康状况和行为症状都有了明显的改善，而且当药物改为谷胱甘肽的另一个前体——α-硫辛酸——后这种临床上的改善依然能够保持。这证明即使在痴呆的发展阶段，保证维生素B12上轴配体上钴-硫键的供应仍然可以得到临床改善。
病人5一位46岁的老护士向慢性疲劳门诊的专家介绍了她许多年来极度疲劳的病史。这种疲劳开始于年青的时候，她描述这是一种“难以置信的疲劳”。
作为检查的一部分，分别在1994年的4月和9月这两个不同的时间进行了腰椎穿刺。两次她的CSF-高半胱氨酸水平都有升高，分别是0.42和1.00μmol/L(参考值＜0.25)。血清高半胱氨酸水平正常，为13.2μmol/L，血清MMA也正常，为0.10μmol/L(参考值＜0.37)。CSF中维生素B12水平相对较低，为8.8(正常值在10-15pmol/L)。
1994年5月她开始接受每周两次的甲基钴胺素形式的维生素B12皮下注射(Methycobal0.5mg/ml)。仅仅在第三次注射后她就感到有了明显的好转。她描述说这就好象“…我的头以前被袋子套住了而现在我被释放了”。而且她的颚右侧和舌部的麻木感觉也消失了。4个月后她报告说她的专心能力和记忆也有了提高，同时工作能力和一般健康状况也得到了改善。她的说话能力逐渐改善而且更加流畅，错误也减少(有些人称之为注意力)。
1994年9月其停止注射维生素B12。两周后她对光线和声音非常敏感，同时注意力集中困难，也无法进行日报上任何文章的阅读。发展到嘴唇、舌和咽有麻刺感，“…就象麻醉感觉消退时一样”。1994年10月她接受了神经心理学家的试验(STROOP检验)，结果显示她比治疗期间明显加重了。
在重新接受维生素B12注射后她的感觉再次变好了，直到1995年1月，当她开始清除另一颗牙的汞合金时。这次她感觉到“一种麻痹性的疲劳”而且面部麻痹的感觉又重新出现。虽然这种感觉在慢慢的好转，但她仍然需要频繁地注射维生素B12(每周3次)。这次对亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的不耐热变种进行了基因分型，结果显示正常(677C为纯合的)。
在以后的几年中她一直在缓慢地好转。到1998年12月，虽然她的感觉更好了，但她依然需要每晚睡10小时以上以便保证有良好的感觉。除了工作以外，她现在还能够更加积极地照顾家庭和两个孩子。她一直去慢性疲劳门诊看病。2001年4月她的维生素B12治疗方案中又加入了每天口服400mg的N-乙酰基半胱氨酸。仅仅一个月后她就感到“更有活力而且头疼也减少了”。她对这个补充治疗非常认可，尽管有胃肠方面的副作用，仍然肯定地要坚持使用。她在持续地好转，3个月后不再需要以前的那么多的睡眠了。最重要的是她现在已经能够将维生素B12的注射次数减少到每周一次了。她现在报告说头疼也几乎完全消失了。
该病人有慢性疲劳综合征的临床特点，而且还表现出中枢神经系统维生素B12代谢问题。这通过脑脊髓液中高半胱氨酸水平增高暗示了功能性维生素B12缺陷这点反应出来的。这几年来她的临床状态虽然稳定的非常缓慢但却是显著的。她可能对金属过度敏感，包括镍，牙汞合金的清除也可能对病情的改善起到了作用。然而她的明显好转与开始甲基钴胺素的注射相关；注射效果通过1994年停止注射后病情明显恶化得到证实。在维生素B12治疗中加入谷胱甘肽前体N-乙酰基半胱氨酸使她的临床状态得到进一步显著的好转，同时她注射次数也能够大大减少。
病人6
一位54岁的女内科医生在39岁时第一次急性发病。症状和体征表明脑干感染，同时被诊断多发性硬化。她表现出“大脑活动缓慢”、感觉疲劳和嗜睡。虽然在之后的3-4年有缓慢的好转，她仍然发展出一些新的症状包括腿部“沉重”感、步态轻微受损、从坐的地方站起困难、单眼视觉模糊、本体感受困难和时间以及空间定向力减弱。
44岁时接受了尿液高半胱氨酸检查。高半胱氨酸水平升高，因此她开始按时注射维生素B12。不久她就注意到症状有了明显的改善；她所有的视觉和本体感受问题以及定向力问题都有了好转。
然而她仍然保留了某些“脑损伤综合征”的体征。神经专家将这种病描述为一种情感无力综合(astheno-emotional syndrome)，包括右侧面部麻痹、发音困难和听觉失语等个别体征。听觉失语通过头挂听筒和一种使声音同步化更佳的电子装置来弥补。虽然进展缓慢，但是她的持久的慢性疲劳和无法忍受压力使和她不能回到内科医生的工作岗位。
在54岁时，她的治疗包括了每日口服1mg的钴胺素和5mg的叶酸。NAC也加入到了治疗方案中。4个月后她报告说由于胃肠的副作用她只能每天服用100mg。不过，她感觉到“明显的好转”。她发现头疼减少了。她的专心能力有了提高，这使她现在可以阅读和理解甚至复杂的材料。她的疲劳程度也减轻了，而且晚上也能睡更长的时间了。
推测这为内科医生为多发性硬化。通过尿液高半胱氨酸水平升高可以显示她有功能性维生素B12缺陷的迹象。虽然维生素B12补充改善了她的症状，但是联合服用N-乙酰基半胱氨酸来提供钴素子上轴配体的钴-硫键，使她的症状得到了进一步显著的改善。
病人71996年，一位81岁的老年男性因为5年来短期记忆的恶化引起了他的全科医生的注意。他没有非常相关的以往医疗史。家族病史中，他的兄弟姐妹中有两人有过帕金森病和脑血管意外。
检查发现他的脉跳轻微不规则、达到高血压的临界(150/90)而且还注意到有肢端寒冷，但是没有发现其它明显的异常。在几分钟后他不能记住3个词。常规检查没有发现异常；特别是没有贫血(Hb 14.7)、MCV正常、血清总B12(324ng/l)和叶酸盐(13.3μg/l)水平正常，而且甲状腺功能试验也正常。
感觉上他患有老年痴呆。他的状态逐渐恶化，但是大约在1997年的几周内显著恶化。当时他经常跌倒，而且意识错乱现象增加。引人注意的是他倾向于向右跌倒，他右侧虚弱，而且有不明确的跖反射。给人的感觉是他可能患有TIA，并允许住进了医院。CT检查显示出腔隙性梗塞。同时他还得了胸部感染。感染用抗生素治疗，他的意识错乱和移动性有了轻微的好转。他开始服用阿斯匹林并出院回家。
然而在之后的几个月里他的病情继续恶化，不时地有言辞攻击性，表现出说话重复，同时变的越来越激动。1998年的一个认知评估显示，他缺乏年代定向力，无法叫出首相或美国总统的名字，在几分钟后就想不起检查大夫的名字，在试验中他不能在一个钟面上正确地画出数字，这证明有视觉空间认识困难，也不能复制出三维立方图形。他没有抑郁的特点、没有妄想、没有交往方面的问题或睡眠障碍。引人注意的是他的步态不稳，而且大多数的日常活动都开始需要帮助。不过在后面的几周内他的状况有了一些改善，因此当时就撤除了老年精神病鉴定服务机构的护理。
1999年他发展到睡眠障碍和渐增的认知缺失。他的精神激动加重，但是能用甲硫达嗪控制。他跌倒的次数增加，为此在年末时要求住院治疗。他的一般状况全面恶化，而且他妻子发现在家里很难应付和照顾他。他有单词查找困难和经常闲谈、自我照顾能力下降、经常迷路、脚下不稳、缺乏自知力、发展到易怒、怨恨和多疑的情绪，和他病前开朗的性格有了很大的不同。
他接受了全天的护理，开始住在住宅房内，但是由于无法应付他不断增加的提要求的行为，不久就搬到了护理房间。
2001年，发现他的血浆高半胱氨酸水平高达19.8μmol/l(正常水平＜16μmol/l)，B12和叶酸盐水平比以前低(分别为297ng/l和4.7μg/l)，他的红细胞叶酸盐正常(204μg/l)，也没有巨红细胞贫血的迹象(Hb 13.4，MCV 91)。因此，他有功能性维生素B12缺陷的迹象，并开始接受每周注射羟钴胺素和口服叶酸盐添加物的治疗。然而他的认知功能没有明显的好转。这时他的ADAS-Cog评估分值为68，这显示痴呆到了显著的程度。通过在治疗方案中加入每天600mg的NAC来间接提供钴胺素上轴配体的钴-硫键。经过一个月的治疗，他的ADAS-Cog分值增加了6分。护理房间的工作人员评价说他的情绪激动减少了，而且更满足了。特别是她的妻子感觉到他好多了，更安定、也更灵敏了。
老人状态的“阶梯式”恶化、不规则分布的缺失、临界高血压、肢端寒冷、脑血管意外的家族病史、局灶神经学体征和症状以及与CT扫描出的腔隙性梗塞相关的症状学上的突然恶化，都有力地支持了病人血管性痴呆的诊断。而且他有功能性维生素B12缺陷的生化证据，没有贫血。这实施例证明患有血管性痴呆的病人，通过联合施用羟钴胺素和N-乙酰基半胱氨酸来间接产生钴胺素上轴配体的钴-硫键，病情有显著的临床改善。
实施例3.
在阿耳茨海默氏病中血浆高半胱氨酸水平升高，但是几乎不知道该病中其它的氨基硫醇(aminothiols)的水平。评估这些相关代谢产物的水平将有助于确定升高的高半胱氨酸的生化部位。因此，测定病人和对照组的总血浆高半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽和半胱氨酰甘氨酸水平，同时研究它们和认知分值之间的关系。
50名具有DSM-IV标准的阿耳茨海默氏型的初级退化性痴呆特征的病人，57名认知完整、并按年龄-性别相匹配的对照受试者，都接受MMSE和ADAS-Cog分值试验。用Drew Scientific DS30 Hcy Analyser来检查氨基硫醇。使用了高半胱氨酸破坏性药物包括维生素B12、叶酸和激素替代治疗的受试者不进入资料分析。记录病历组和对照组的MMSE和ADAS-Cog分值(16、17)。后者反映出几种认知域而且非常有效。它对伴随时间的认知变化非常敏感，这样就给进一步的研究提供了有用的原始资料(baseline)。
受试者们以前受过的教育也要确定(“无、初级、中间、中级和更高”)，因为这关系到正常的增龄性认知下降(19)。吸烟(“当前、没有(ex)和从不”)以及高血压状态有都要记录，这些关系到对高半胱氨酸的最恰当的评价(20)。为了统计学分析的目的，将受教育情况和吸烟作为顺序变量，将高血压状态作为分类变量。在评估时测量身高和体重来计算体重指数(BMI)。实验得到了伦理学上的许可，也获得了知情同意书。
非禁食的血液样品用于检验全血细胞数、红细胞叶酸盐(RCF)、肌酸酐、B12、叶酸盐和氨基硫醇。静脉穿刺后一小时内就要进行样品的分离和冻存，直到进行氨基硫醇的分析。
用自动细胞记数器来测量血红蛋白(Hb)浓度和平均细胞体积(MCV)(Coulter Gen-S，Beckman Coulter，High Wycombe，Bucks，UK)。按照制造商建议的方法，用自动生化分析仪分析肌酸酐(SynchronLX-20 analyser，Beckman Coulter，High Wycombe，Bucks，UK)，用自动化学荧光分析仪测量叶酸盐、维生素B12和RCF(ACS180SE，Bayerplc，Newbury，Berks UK)。用自动HPLC系统分析氨基硫醇(Ds30 HcyAnalyser，Drew Scientific Group plc，Barrow in Furness，Cumbria，UK)。对每种氨基硫醇，包括蛋白质结合的、非蛋白质结合的、游离的氧化态(二聚体和混合的二硫化物)和还原态的形式都进行测量。给出的数值通常是指“总”血浆水平。
两组比较(Wilcoxon-Mann-whitney检验)，中值(median)之间差异的可信区间为95％(Hodges-Lehmann estimates)，用精确的非参数的方法(StatXact 4 for Windows，Cytel Software Corporation，Cambridge，MA)来进行相关性(association)测定。使用常规技术来进行回归分析和广义线性模拟分析(Statistica for Windows v5.5，StatSoft，Inc.，Tulea，OK)。岭(ridge)回归——常规回归分析的延伸——用于校正自变量之间的可能关联。为了广义线性模拟分析，连续变量被指定作为因变量，使用线性连接单位函数(linear linkfunction)并将分类变量、顺序变量和连续变量合在一起作为自变量。模型参数的意义用χ2检验来评价。中值是用四分位距表示，单回归系数用95％(95％CI)的可信区间表示。
结果50名AD病人(17位男性和33位女性)和57名对照(23位男性和34位女性)。两组的年龄中值都是79岁(AD病人为75-83岁，对照为72-85岁)。AD病人发病时间中值为24(13-36)个月，而发病年龄中值为77岁。
在BMI、教育程度或吸烟状态上病历组和对照组没有差异。病人组收缩压中值比对照组低(病人130(120-140)mmHg，对照组145(130-160)mmHg，95％CI差异0-20，p＝0.01)，舒张压也比对照组低(病人80(70-82)mmHg，对照组85(79-95)mmHg，95％CI差异5-10，p＝0.0005)。
在检验氨基硫醇之前血浆样品储存时间的中值为12个月(范围在1-23个月)。回归分析用于评价储存时间对检验的影响。在总的资料中(病历组加对照组)，储存时间对高半胱氨酸和谷胱甘肽的水平没有影响。随着储存时间的延长半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸水平有小幅下降半胱氨酸＝142.3-2.33X储存月数(p＝0.0002，95％CI-0.52～-1.14)，半胱氨酰甘氨酸＝20.9-0.26X储存月数(p＝0.007，95％CI-0.43～-0.09)。作为附加分类自变量所增加的诊断表明在病历组和对照组之间储存时间的影响没有差异。
AD病人的叶酸盐显著降低，而血浆高半胱氨酸和半胱氨酸却显著升高。Hb、血小板、MCV、肌酸酐、B12、RCF、半胱氨酰甘氨酸和谷胱甘肽在两组之间都没有差异，见下表3。
表3对照病人P-值(95％CI的中值间的差异)BMI24.1(22.1-28.4) 24.6(22.5-27.4)MMSE 28(27-29)18(14-21) p＜0.0001(8-12)ADAS-Cog 9(7-12) 32(24-39) p＜0.0001(19-26)Hb，g/dl 13.4(12.5-14.4) 12.9(12.0-14.2)血小板，×109/1 218(184-277) 216(182-273)MCV，f190.4(87.8-94.0) 90.4(88.4-93.6)肌酸酐，μmol/l84(72-102) 87(72-115)B12，ng/l 324(276445) 334(268-421)叶酸盐，μg/l 10.5(8.1-14.5) 9.0(6.3-11.6) p＝0.018(0.4-3.8)RCF，μg/l 330(272-425) 282(243-399)高半胱氨酸，(μmol/l) 9.6(8.2-12.5)12.6(9.6-15.8)p＝0.0006(1.2-4.3)半胱氨酸，(μmol/l)107.2(94.7-129.4)120.1(102.0-142.4)p＝0.007(3.6-23.7)半胱氨酰甘氨酸，(μmol/l) 17.7(15.5-20.3) 17.5(15.4-21.1)谷胱甘肽，(μmol/l)2.5(2.2-2.9) 2.7(2.2-3.3)在病人中，MMSE分值的减少和血浆谷胱甘肽的减少相关MMSE＝8.27+3.56X谷胱甘肽(p＝0.002，95％CI0.29～6.82)。与之类似，ADAS-Cog分值的增加与血浆谷胱甘肽的下降有关ADAS-Cog＝54.9-8.39X谷胱甘肽(p＝0.002，95％CI-13.6～-3.22)，见图5。已知高半胱氨酸本身就可以影响认知功能(1)(3)，为了防止出现这些相关性是由它们之间的相互关联所造成的假象的可能性，将血浆高半胱氨酸、半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸作为附加自变量进行岭回归分析。分析证实，血浆谷胱甘肽是唯一可以作为MMSE和ADAS-Cog分值的有独立统计意义的预报指标的氨基硫醇。
在对照组中，MMSE同谷胱甘肽、高半胱氨酸、半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸之间没有相关性。随着血浆谷胱甘肽的减少ADAS-Cog分值增加ADAS-Cog＝29.6-0.61X谷胱甘肽(p＝0.04，95％CI-1.21～-0.002)，但是在岭回归模型中，这种关联在加入高半胱氨酸、半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸后消失。
另一个可能混淆的因子是年龄、吸烟状态、高血压情况和受教育年限，这些因素可能影响血浆谷胱甘肽和认知分值之间的关系。用广义线性模拟技术来评价这些因子加上血浆谷胱甘肽对ADAS-Cog和MMSE分值的影响。结果证实谷胱甘肽在本研究中是认知表现的独立预报指标，见下表4。
表4记分系统自变量 Log似然 χ2(1 d.f.) P-值ADAS-Cog年龄-72.33 0.35 0.55教育-76.55 8.78 0.003吸烟-72.42 0.52 0.47谷胱甘肽-75.15 5.98 0.014高血压 -76.83 9.34 0.002MMSE年龄-56.98 0.0001 0.99教育-58.26 2.56 0.11吸烟-57.33 0.69 0.40谷胱甘肽-60.57 7.18 0.007高血压 -58.59 3.22 0.07因此，谷胱甘肽是病人中认知分值的一个非常重要而又独立的预测指标(p＝0.002)；低血浆水平和更加严重的认知损害有关。血浆高半胱氨酸和半胱氨酸在阿耳茨海默氏病中升高，意味着病人的转硫作用完整并增加，但高半胱氨酸的再甲基化异常。这些发现反映出氧化压力对含硫氨基酸代谢的关键酶有不同的影响。
谷胱甘肽钴胺素和相关的巯基化钴胺素可以用来预防所有与细胞内谷胱甘肽偏低包括增龄相关的疾病和病症中功能性维生素B12缺陷。应当理解这些病人最后肯定将发展到维生素B12缺陷，但是在疾病的早期阶段，这种缺陷可能没有明显的代谢迹象。
哺乳动物细胞中还原性谷胱甘肽水平与广泛的病理生理学状态相关，包括肝细胞功能障碍、恶性肿瘤、HIV感染、肺病、帕金森病、相关的免疫学疾病和生理状态。下面列出目录只是用于举例目的而且也没有穷尽扑热息痛中毒、ADD、艾迪生氏病(Addison’s Disease)、老化、AIDS、斑秃(Alopecia Areata)、ALS、阿耳茨海默氏病、贫血(溶血)、强直性脊柱炎、血管硬化(动脉硬化)、关节炎(类风湿)、哮喘、孤独症、自身免疫疾病、贝切特氏病(Behcet’s Disease)、烧伤、恶病质、癌症、念珠菌感染、心肌病(原发性的)、慢性疲劳综合征、结肠炎、冠状动脉病、纤维囊泡症、糖尿病、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、湿疹、肺气肿、Epstein Barr Viral(EBV)综合征、纤维肌痛(fibromyalgia)、自由基过载、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯氏病(Grave’s Disease)、肝细胞功能障碍(肝病)、乙型肝炎、丙型肝炎、血胆固醇过多(高血胆固醇)、疱疹、感染(病毒性、细菌性和真菌性)、炎性肠病(IBD)、狼疮、黄斑变性(老年性和糖尿病性黄斑变性)、营养不良、梅尼尔氏病(Meniere’s disease)、多发性硬化、重症肌无力、神经变性病、营养性疾病、帕金森氏病、寻常型天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、早老症、牛皮癣、风湿热、结节病、硬皮病、带状疱疹、中风、毒物中毒、脉管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。
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权利要求
1.用于治疗和/或预防功能性维生素B12缺陷的药物组合物，该组合物包含化合物或化合物的组合，通过直接或间接地提供细胞内钴胺素分子的上β-轴配体的钴-硫键，从而促进钴胺素的细胞内加工。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述的化合物是巯基化钴胺素。
3.权利要求2的药物组合物，其中巯基化钴胺素是谷胱甘肽钴胺素。
4.权利要求1的药物组合物，其中该组合物是维生素B12或其衍生物组合含硫分子。
5.权利要求4的药物组合物，其中含硫分子是谷胱甘肽或其前体。
6.权利要求5的药物组合物，其中谷胱甘肽前体选自N-乙酰基半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸盐、L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟甲苯、γ-谷氨酰基半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸和乙酰基肉碱。
7.权利要求1～6任一项中的药物组合物，其中所述组合物有利于神经组织和血管内皮中钴胺素的加工。
8.权利要求1～7任一项中的药物组合物，该组合物用于治疗和/或预防神经精神性和/或血管性疾病。
9.权利要求8中的药物组合物，进一步地包含一种或多种的附加化合物，用以帮助治疗或预防神经精神性和/或血管性疾病。
10.权利要求9中的药物组合物，其中的一种或多种的附加化合物是参与高半胱氨酸代谢的因子。
11.权利要求10中的药物组合物，其中附加的因子是叶酸盐和/或其衍生物，和/或维生素B6。
12.权利要求9、10或11中的药物组合物，其中包括一种或多种的甲基供体。
13.权利要求12中的药物组合物，其中的甲基供体选自叶酸、甲基叶酸盐、S-腺苷甲硫氨酸、甜菜碱、胆碱、肉碱。
14.用于治疗和/或预防功能性维生素B12缺陷的药物组合物，该组合物包含通式为Coα-[α-(5，6-二甲基苯并咪唑基)]-Coβ-配基]钴胺酰胺的巯基化钴胺素，它的上β-轴配体基团通过硫钴键同钴胺酰胺配位。
15.权利要求14中的药物组合物，其中所述的巯基化钴胺素是谷胱甘肽钴胺素。
16.权利要求14中的药物组合物，其中的巯基化钴胺素选自亚硫酸钴胺素、半胱氨酰钴胺素、环己基巯基化钴胺素和五氟苯基巯基化钴胺素。
17.权利要求14～16任一项中的药物组合物，用于治疗或预防神经精神性和/或血管性疾病。
18.用于治疗和/或预防个体功能性维生素B12缺陷的药物组合物，该组合物包含维生素B12或其选自羟钴胺素、甲基钴胺素和腺苷钴胺素的衍生物，结合谷胱甘肽和/或谷胱甘肽化合物前体，这种谷胱甘肽化合物的前体选自N-乙酰基半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸盐、L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羟茴香醚、丁基化羟甲苯、γ-谷氨酰基半胱氨酸和半胱氨酰甘氨酸和乙酰肉碱用以促进钴胺素的细胞内加工。
19.权利要求18中的药物组合物，包含维生素B12或其衍生物和N-乙酰基半胱氨酸。
20权利要求18中的药物组合物，包含维生素B12或其衍生物和α-硫辛酸。
21.治疗和/或预防个体功能性维生素B12缺陷的方法，该方法包含给个体施用治疗有效量的组合物，该组合物直接或间接地提供细胞内钴胺素分子的上β-轴配体的钴-硫键，从而促进钴胺素的细胞内加工。
22.权利要求21中的方法，其中钴胺素的上β-轴配体是通过施用治疗有效量的巯基化钴胺素直接提供的。
23.权利要求22中的方法，其中的巯基化钴胺素是谷胱甘肽钴胺素。
24.权利要求21中的方法，其中钴胺素分子上β-轴配体的钴-硫键是通过联合施用维生素B12(氰钴胺素)或其衍生物和含硫分子间接提供的。
25.权利要求24中的方法，其中含硫分子是谷胱甘肽或其前体。
26.权利要求25中的方法，其中谷胱甘肽前体选自N-乙酰基半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-氨基乙磺酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、α-硫辛酸、L-α氧噻唑烷-4-羧酸盐、L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酰乙酯、丁基化羟茴香醚、丁基化羟甲苯、γ-谷氨酰基半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸和乙酰肉碱。
27.权利要求21～26任一项的方法，其中的组合物促进神经组织和血管内皮中钴胺素的加工。
28.权利要求27中的方法，进一步包含与该组合物联合施用一种或多种的附加化合物，用以帮助治疗或预防神经精神性和/或血管性疾病。
29.权利要求28中的方法，其中的一种或多种的附加化合物是参与高半胱氨酸代谢的因子。
30.权利要求29中的方法，其中附加的因子是叶酸盐和/或其衍生物，和/或维生素B6。
31.权利要求28、29或30中的方法，其中的组合物包括一种或多种的甲基供体。
32.权利要求31中的方法，其中的甲基供体选自叶酸、甲基叶酸盐、S-腺苷甲硫氨酸、甜菜碱、胆碱、肉碱。
全文摘要
一种用于治疗和/或预防介体功能性维生素B
文档编号A61P17/02GK1537009SQ02810724
公开日2004年10月13日 申请日期2002年4月22日 优先权日2001年4月25日
发明者A·麦卡登, A 麦卡登 申请人:科拜慈有限公司