一种含有l－苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物的制作方法

专利名称：一种含有l－苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有L-苏糖酸钙，大豆异黄酮和任选的维生素D3的组合物，尤其可用于预防或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的含有L-苏糖酸钙，大豆异黄酮和任选的维生素D3的组合物。
背景技术：
骨性关节炎是指可动关节由于关节软骨退行性改变和在关节表面、边缘形成新骨为其特征的内在的非炎症性疾病。软骨的变化最为显著，关节软骨发生软化，失去正常弹性，暴露软骨的胶原纤维，在关节活动时发生磨损。软骨深层发生裂隙，关节软骨失去其原来的蓝白色和光滑的色泽，而变成暗黄和颗粒状。磨损最大的关节面上的软骨被擦去，使软骨下骨显露。临床以关节的疼痛肿胀、功能障碍为主。此外，由此增生的骨赘压迫刺激周围神经、血管，引起肢体麻木疼痛，如颈椎病、腰椎管狭窄等，更给患者带来巨大痛苦。骨关节炎的发生与肥胖、骨密度、外伤和力的承受以及遗传因素有关。关节软骨由1-2mm厚度的胶原纤维、糖蛋白、透明质酸酯聚集而成，通过水合作用起垫子的作用，主要吸收和分散所承受的负重和机械力量，在生理状况下，关节软骨依靠关节周围肌肉的收缩及软骨下的骨质来完成上述任务。当二者出现问题时，例如软骨下骨质有异常如老年性退行性变、骨质疏松等或肌肉承受了过多的压力如肥胖、外伤等，就导致了软骨的损伤，从而可能发生骨性关节炎。这里值得一提的是骨密度，当软骨下骨小梁变薄、变僵硬时，其承受压力的耐受性就减小，因此在骨质疏松者发生骨性关节炎的机率就增多。
骨性关节炎的预防或治疗，其重要的一个方面就是通过促进关节软骨的生长和修复，最终达到预防和治疗的目的。目前，各种抗炎药物对骨性关节炎的症状具有一定的缓解作用，如减少疼痛等，从治本的角度讲，仍无更有效的方法。本发明的组合物可通过刺激软骨细胞的生长，增强骨胶原的合成从而达到预防和治疗骨性关节炎的作用。从本组合物对骨关节炎大鼠模型的治疗中可见证这一点。
骨质疏松症是骨矿物质和骨基质随年龄的增加(或妇女的绝经)等比例的减少、骨组织显微结构发生变化，使骨的正常荷载功能发生变化，骨密度降低，骨折危险明显增大、伴有周身骨骼疼痛和体态变化的一种疾病。骨质疏松的发生机制比较复杂，骨细胞包括成骨细胞及破骨细胞的功能起着关健性的作用，增加成骨细胞的数量和功能、抑制破骨细胞的功能是预防和治疗骨质疏松的重要手段，因为成骨细胞及破骨细胞两者共同作用，决定了骨骼中骨小梁的生长，骨盐矿架结构的形成，骨胶原的合成及包括钙元素在内的矿物质的沉积。缺钙是骨质疏松的一种表现，但单纯补钙不能解决骨质疏松的主要原因是人类骨骼衰老所致，具体说是因为骨细胞包括成骨细胞及破骨细胞功能的退化所致。因此，治疗或预防骨质疏松的关健是通过影响骨细胞使骨细胞减缓退化或衰老，促进成骨细胞、抑制破骨细胞。
从目前来看，社会上预防和治疗骨质疏松的物质主要有以下三类，一是二磷酸盐类，以抑制破骨细胞为主，如阿伦磷酸钠等；二是激素类，如雌激素或降钙素等，有刺激成骨细胞或抑制破骨细胞的作用。三是补钙剂，比如碳酸钙等，钙是骨骼的主要成分之一，骨质疏松的症状之一就是缺钙，但骨骼对钙的吸收及利用是要通过骨细胞的作用，因此单纯补钙效果不好。本发明中的组合物通过刺激成骨细胞的生长同时抑制破骨细胞的作用，来达到预防和治疗骨质疏松的目的，相关的基础研究及整体动物模型研究很好地说明了这一点。
股骨头坏死多由于股骨颈骨折后，股骨头的血液供应发生障碍所致。目前主要的治疗方法还只是手术治疗，药物或其它物质治疗股骨头坏死的效果均不好，本组合物对骨骼及关节软骨的生长和修复有明显的作用，同时可促进骨骼血管的重建及生长，从而可改善骨骼局部的血液循环，减少或减缓股骨头坏死的发生率。

发明内容
发明人发现，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮作为一种组合物使用，具有以下几方面的作用(1)能够显著刺激软骨细胞的生长，增加软骨细胞的数量，同时促进II型骨胶原的合成，从而可促进软骨的生长和修复；(2)大鼠骨关节炎模型的研究结果显示可以显著改善骨性关节炎模型大鼠的各种病理表现，减轻关节软骨的损害，预防和治疗骨性关节炎；(3)抑制破骨细胞的骨吸收作用，刺激成骨细胞的生长，增加I型骨胶原的合成，调节人体激素水平；(4)促进骨血管再生、增殖和改善骨血液循环，(5)可以提高骨质疏松模型大鼠的血钙水平，降低AKP水平，提高骨密度，骨钙含量，增加骨钙化程度和韧性，增加骨折断的受力强度和做功的能量，(6)该组合物在以上方面与L-苏糖酸钙组比较，效果明显，证实了二者具有协同作用。(7)用本发明的组合物治疗股骨头坏死，也取得了非常好的疗效。基于这些发现，实现了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种可用于预防或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的的含有L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物。
在本发明的组合物中，L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1-1500∶1-100，优选为1.5-1000∶1-70，更优选2.5-6∶1-2.5。本发明的组合物可以任选包括药学可接受的载体或稀释剂或常用添加剂，如香味剂，甜味剂等。L-苏糖酸钙与大豆异黄酮二者在组合物中的含量优选为10-100wt％，更优选30-95wt％，还更优选50-90wt％。
根据本发明的一个更优选的实施方案，本发明的组合物还含有适量的维生素D3，其中L-苏糖酸钙∶大豆异黄酮∶维生素D3的重量比为1-1500∶1-100∶0.000125-0.00125，优选为1.5-1000∶1-70∶0.00025-0.00075，更优选2.5-6∶1-2.5∶0.000375-0.0005。
本发明的组合物可以制成常用剂型，例如片剂，胶囊，颗粒剂，口服液等。制备本发明的组合物的方法为常规方法，这些方法对于本领域的技术人员来说是公知的。
在本发明的单位剂型中例如可以包括大豆异黄酮10-300mg，苏糖酸钙10-100mg(按钙元素计)，50-500IU维生素D3。日用量可以是1-6个单位剂型，优选1-3个单位剂型。
以下通过实施例来说明本发明。应该理解的是，这些实施例仅用于说明的目的，不限制本发明的范围。
实施例实施例1 片剂的制备(1000片)苏糖酸钙775g大豆异黄酮 50g预胶化淀粉 130g糊精15g甜味剂 10g香精6g微晶纤维素 80g聚乙烯吡咯烷酮 18g羧甲基纤维素80g硬脂酸镁1.6g上述物质混合，按常规制片工艺制成片剂。
实施例2 口服液的制备大豆异黄酮 8.5gL-苏糖酸钙 23.7g蔗糖88.5g柠檬酸 9.46g阿斯巴甜4.3g山梨酸钾0.18g上述物质加水至1000毫升，加热溶解，加入香精，搅拌均匀，分装到灭菌的瓶中，包装即可。
实施例3 胶囊的制备L-苏糖酸钙 294g大豆异黄酮 153g将二者混合均匀，再加入滑石粉4.22克，混合均匀，分装到胶囊中，包装，制成1000粒胶囊。
实施例4 片剂的制备(1000片g)苏糖酸钙775g大豆异黄酮 50g维生素D3200IU预胶化淀粉 130g糊精15g甜味剂 10g香精6g微晶纤维素 80g聚乙烯吡咯烷酮 18g羧甲基纤维素80g硬脂酸镁1.6g上述物质混合，按常规制片工艺制成片剂。
实施例5 胶囊的制备L-苏糖酸钙 294g大豆异黄酮 153g
维生素D3200000IU将二者混合均匀，再加入滑石粉4.22克，混合均匀，分装到胶囊中，包装，制成1000粒胶囊。
一、本发明组合物对骨性关节炎的疗效的动物试验骨性关节炎是指可动关节由于关节软骨退行性改变和在关节表面、边缘形成新骨为其特征的内在的非炎症性疾病。临床以关节的疼痛肿胀、功能障碍为主。此外，由此增生的骨赘压迫刺激周围神经、血管，引起肢体麻木疼痛，如颈椎病腰椎管狭窄等，更给患者带来巨大痛苦，本病在中老年人群中十分常见。
材料和方法1材料试验动物新生Wistar大白鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)试剂DMEM高糖培养基，胰蛋白酶，II型胶原酶，抗坏血酸，Phalloidin-DexasRed，Tubulin抗体，II型胶原蛋白抗体，甲苯胺蓝，BMP，IGF-I，TGF-β抗体，HRP-IgG，FITC-IgG，亚甲基蓝，DAB，OPD，RNA提取试剂盒仪器全自动生化分析仪 荧光显微镜，相差倒置显微镜，二氧化碳培养箱，低温离心机，电子天平，酶标仪，透射电子显微镜2方法(1)骨性关节炎动物模型的建立a骨性关节炎模型制作取出生7-8天的Wistar大白鼠，切除尾巴和双侧前肢，造成双后肢大鼠。具体操作以手术缝合线自双前肢肱骨中段及尾部结扎，消毒后，距结扎处2mm剪除远端，电凝止血，不需包扎，放回窝内，交母鼠喂养，三个月后可形成典型的骨性关节炎模型。
b实验分组正常对照组10只(A)，双后肢组24只(模型对照组B)，服用L-苏糖酸钙双后肢组24只(C)，服用大豆异黄酮双后肢组24只(D)，和服用L-苏糖酸钙+大豆异黄酮双后肢组24只(E)。
B、C、D和E组于出生一周造成双后肢大鼠模型，5组动物在同等条件下饲养，断奶后自由饮水，喂混合饲料。但B、C、D和E组水及食物放置较高，以促其直立。
c给药处理大鼠离乳后，开始持续灌胃给药至取材。C组L-苏糖酸钙0.77g/kg/d，D组大豆异黄酮0.3g/kg/d，E组L-苏糖酸钙0.60g+大豆异黄酮0.10g/d。
(2)软骨组织观察取材与病理切片的制作腹腔注射麻醉处死动物后，取一侧后肢股骨头于10％甲醛内固定2周，脱钙4周，常规脱水，二甲苯透明。石蜡浸透包埋。切片厚约6μm。股骨上端切片取自圆韧带前后200μm内的冠状面切片。均顺骨小梁方向纵切。
观察方法通过光学显微镜对各模型组与对照组大鼠不同阶段的股骨头关节软骨变化进行观察。
(3)电镜观察腹腔注射麻醉处死动物后，取一侧后肢股骨头固定，2％多聚甲醛和2％戊二醛混合液，在4℃下前固定1小时；磷酸缓冲液在4℃下浸洗样本2小时，其间换液2次；室温下，用1％四氧化锇溶液浸泡1小时，进行后固定。采用阶梯丙酮脱水，树脂包埋。37℃聚合12小时；45℃聚合12小时；60℃聚合12小时。修整包埋块，超薄切片切片厚度约600埃。醋酸铀饱和酒精溶液和枸橼酸铅进行超薄切片双重染色。在电镜下进行观察。
(6)大鼠软骨细胞体外培养方法取新生3-4天Wistar大白鼠关节软骨，剪成1cm左右的组织片，加入0.25％胰酶37℃消化30分钟，弃去上清液，再加入0.1％胶原酶37℃消化30min两次，取未消化的组织片，加入含10％小牛血清，50μg/ml抗坏血酸的高糖DMEM培养基，5％CO2，37℃培养。待细胞长满成单层状时传代，取3-4代细胞进行实验。
取样进行甲苯胺蓝、II型胶原蛋白染色鉴定。
将细胞随机分为L-苏糖酸钙(100μg/ml)组，大豆异黄酮组(60μg/ml)，L-苏糖酸钙(70μg/ml)+大豆异黄酮组(30μg/ml)。
L-苏糖酸钙对软骨细胞的作用亚甲基蓝染色法测得软骨细胞密度培养细胞传代后培养于24孔板中；将待测细胞青春培养基，PBS清洗干净；200μl 4％多聚甲醛(PBS液配制)固定30min；1ml PBS(0.01M，PH7.4)清洗三次，然后用100μl 1％亚甲基蓝染色10min；1ml的硼酸盐缓冲液(PH8.4)反复清洗，至清洗液无色；5ml 0.1NHCl脱色15min，取脱色液在662nm处测OD值。
免疫细胞化学染色法检测II型胶原蛋白将细胞培养于玻璃片上，取细胞生长至汇合的片子，用pH7.4 PBS缓冲液洗2次；室温下以3.7％多聚甲醛固定过夜；PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；1％牛血清蛋白BSA作用30min，于湿盒中封盖；一抗孵育2小时(室温，避光)；PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；二抗孵育1小时(室温，避光)；OPD法显色，酶标仪比色测定OD值，片子清洗后以亚甲蓝法染色，酶标仪测定OD值。
结果L-苏糖酸钙+大豆异黄酮对整体模型大鼠骨性关节炎的作用1骨性关节炎大鼠组织学变化骨性关节炎的病理表现主要为1关节软骨面表层变薄。2中深层出现大量骨髓组织与骨样组织。3软骨下骺软骨板先是变薄并可见骨样组织贯通，继而则增生变厚。4软骨下骨质增厚。5软骨细胞排列紊乱，中、深层可见软骨细胞簇。
本实验结果显示正常对照组(A)在13周时，关节软骨厚，细胞密度大，偶见骨样组织侵驻，骺骨板厚，细胞柱内细胞丰富，细胞柱排列紧密。18周时，关节软骨略有变薄，细胞略小，软骨膜层稍有变薄，偶见骨样组织与骨髓组织侵入，骺骨板完整，细胞丰富。23周时，关节软骨中度变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量中等，个小，骨髓及骨样组织侵入较多，骺骨板破损，细胞较大。28周时，关节软骨中度变薄，细胞量减少，个中等或较小，软骨膜层几乎消失。软骨中深层广泛出现骨髓及骨组织，骺骨板破损。
模型对照组(B)13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，承重处可见骨髓及骨组织侵入，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨中等变薄，细胞略少，个小。软骨膜层变薄，软骨中深层广泛出现骨髓及骨组织，骺骨板破损，有骨样组织贯通。23周时，关节软骨变薄，细胞量少，个小。软骨中深层广泛出现中至大量的骨髓及骨组织，骺骨板消失，28周时，关节软骨变得非常薄，细胞少且小，软骨膜层消失，软骨中深层出现大量骨样组织，骺骨板消失。
大豆异黄酮组13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，承重处可见骨髓及骨组织侵入，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨较厚，细胞丰富，较大。骨样组织与骨髓组织侵入较少，骺骨板较厚，略有破损，柱内细胞丰富。23周时，关节软骨重度变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量较少，个小，骨髓及骨样组织大范围侵入至软骨中深层，骺骨板消失。28周时，关节软骨重度变薄，细胞量少而个中等或较小，软骨膜层消失，软骨中深层出现较多骨组织。
L-苏糖酸钙组13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，承重处可见骨髓及骨组织侵入，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨较厚，细胞丰富，较大。偶有骨样组织与骨髓组织侵入，骺骨板较厚，略有破损，柱内细胞丰富。23周时，关节软骨重度变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量较少，个小，骨髓及骨样组织大范围侵驻贯通，骺骨板消失。28周时，关节软骨中度变薄，细胞量少而个中等或较小，软骨膜层几乎消失，软骨中深层出现广泛出现骨髓和骨组织。
L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组13周时，关节软骨较厚，细胞密度较大，骺骨板较厚，在承重处略有破损，细胞柱内细胞丰富。18周时，关节软骨较厚，细胞丰富，较大。偶有骨样组织与骨髓组织侵入，骺骨板较厚，略有破损，柱内细胞丰富。23周时，关节软骨变薄，软骨膜层明显变薄，细胞量较少，个小，骨髓及骨样组织大范围侵驻贯通，骺骨板破损。28周时，关节软骨薄，细胞量稍减少，个中等或较小，软骨膜层稍薄，软骨中深层广泛出现骨髓和骨组织，其中骨髓样组织较多。
从以上结果可以看出L-苏糖酸钙组，大豆异黄酮组和L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组明显优于对照模型组，而L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组优于L-苏糖酸钙组和大豆异黄酮组。
本发明组合物对大鼠软骨细胞的作用表1 药物对软骨细胞增殖的作用 单位OD平均值，n＝4

从以上统计学结果可以看出L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组明显优于L-苏糖酸钙组和大豆异黄酮组，说明L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的组合具有协同作用，其机理目前还不清楚。
本发明组合物对软骨细胞胶原蛋白II分泌的影响表2 本发明组合物对软骨细胞胶原蛋白II分泌的影响

从以上结果可以看出，L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组对软骨细胞胶原蛋白II分泌的作用大于L-苏糖酸钙组和大豆异黄酮组。
二、本发明组合物对骨质疏松症的疗效的动物试验动物及饲养Wistar种雌性大鼠，体重150±10g，由军事医科院实验动物中心提供，试验室温度22±1℃，相对湿度40-60℃，喂饲低钙饲料，饮用去离子水，正常对照组喂饲普通饲料及饮用自来水。
方法去势雌性大鼠骨质疏松模型的制备雌性大鼠体重150±10g，无菌摘除双侧卵巢，喂饲低钙饲料及饮用去离子水60天，造成骨质疏松模型。
试验处理取去卵巢大鼠70只，随机分为五组，每组15只。第一组为L-苏糖酸钙高剂量组，每天经口灌服1.93g/kg(相当于250mg/kg元素钙)，第二组为L-苏糖酸钙低剂量组(1.16g/kg，相当于150mg/kg元素钙)，第三组为大豆异黄酮组0.54g/kg，第四组大豆异黄酮0.35g/kg+苏糖酸钙0.77g/kg(相当于100mg/kg元素钙)，第五组为模型组，每天经口给等体积去离子水，上述一到四组喂饲低钙饲料，饮用去离子水。第六组取同批未摘除卵巢的大鼠15只作为正常对照组，喂饲普通饲料和饮用自来水。以上所用动物在实验的第60天，放血处死，取血分离血清用于血Ca、P、AKP的测定剥离大鼠双侧股骨，低温冰箱冻存，供下述分析用。
血清Ca、P和AKP的测定血清钙用甲基麝香草酚兰比色法测定；血清磷用单一试剂法测定；血清碱性磷酸酶(AKP)用对硝基苯磷酸二钠法测定。
骨密度测定取低温冰箱冻存的右侧股骨，应用骨密度仪测定股骨中央50％(F50)和近端20％(F20)处的骨矿盐含量，扫描速度为0.25mm/s，精确度为99％。单位为每平方厘米所含骨矿盐量(BMC/cm2)。
取右侧新鲜剥离的股骨，测长度、称湿重，在120℃烘箱中烘烤5小时，恒重后称重即为干重，然后再放入800℃马弗炉中烧6小时，恒重后称重即为灰分，用EDTA络合滴定法测定灰分中的钙盐含量。
股骨生物力学测定取低温冰箱冻存的左侧股骨，应用电子万能试验机进行股骨的三点弯曲试验，跨度为2.5cm，使用25kg传感器，标定1/50，速度10mm/min，应用函数记录仪记录载荷与挠度的函数关系，P为破坏性测试折断最大屈服点受力；Y为挠度。与材料韧性呈正比关系；K为斜率，与材料的刚度成正比；S为折断骨所做的功。在骨上显示钙化程度。
表2 本发明组合物对去卵巢骨质疏松大鼠血清钙、磷的影响

统计表明，L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组与L-苏糖酸钙高剂量组和大豆异黄酮组比较差异显著，p＜0.05。
表3 L-苏糖酸钙对去卵巢骨质疏松大鼠血清AKP的影响

统计表明，L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组与L-苏糖酸钙低剂量组和大豆异黄酮组比较差异显著，p＜0.05。
表4 对骨密度的影响

统计表明，L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组与L-苏糖酸钙低、高剂量组和大豆异黄酮组比较差异显著，p＜0.05。
表5 对去卵巢大鼠股骨生物力学的影响

以上结果表明，本发明的L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组在功效成份分别低于L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的情况下，效果分别优于二者。说明本发明L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的组合具有协同作用，本发明的组合物有预防和治疗骨质疏松的作用。
三、本发明组合物对破骨细胞骨吸收功能影响的体外研究1材料和方法1.1材料1.1.1动物新生雄性日本大耳白兔3只，体重80-110g，由成都生物制品研究所提供。
1.12药品及试剂α-MEM(Gibco产品)，新生胎牛血清(Gibco生产)，1，25-(OH)2D3(Sigma产品)，HEPES(Roch产品)，青霉素-链霉素(Gibco产品)，萘酚AS-BI磷酸盐(Sigma产品)、甲苯胺蓝(Sigma产品)。CTX的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Osteometer BioTech产品)。药物L-苏糖酸钙，大豆异黄酮组，L-苏糖酸钙+大豆异黄酮，葡萄糖酸钙(Sigma产品)，17-β雌二醇(Sigma产品)。
1.1.3主要仪器锯式切片机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、普通光学显微镜、尼康Eclipse600 & SPOT计算机图像分析系统、Philips525M型扫描电子显微镜、台式高速离心机、深低温冰箱、除菌过滤器、显微外科手术器械、96孔培养板等1.2方法1.2.1骨磨片的制备用低速锯式切片机将新鲜牛股骨皮质骨切成100μm厚片，用磨砂玻璃片磨成20μm厚、4mm×4mm的薄骨片，将骨磨片至蒸馏水中，超声清洗3×5min，自然晾干，紫外线照射消毒20min后置4℃冰箱内备用。分离破骨细胞前，取出骨片，浸泡于含抗生素(青霉素1000U/ml，链霉素1000μg/ml)的α-MEM培养液中，换液三次，每次20分钟。
1.2.2破骨细胞的分离用改良Chambers法，将新生兔断颈处死，无菌条件下取四肢长骨，在D-Hanks平衡盐溶液中去净附着在骨表面的软组织及骨骺，用α-MEM清洗骨干2次，然后在α-MEM全培养液内，将骨干纵行刨开，轻刮骨髓腔至颜色变白，用尖吸管吸取培养液反复冲洗髓腔面，收集冲洗液，细胞筛网过滤，去掉骨片，1000rpm离心5min，沉淀物加20ml培养液悬浮混匀。台盼蓝拒染法计算分离细胞活力，血细胞计数器计数，调节悬液体积，使悬液含细胞1×106/ml。
1.2.3破骨细胞的培养和药物的添加取2个96孔培养板，每孔内置100μlα-MEM全培养液和一骨片，将细胞悬液按100μl/孔加入(每孔1×105细胞)，静置80min，冲洗除去培养液和未粘附细胞，加入新培养液200μl，在37℃、5％CO2潮湿条件下培养24h，再次除去培养液和未粘附细胞，并在每10孔内加入浓度分别为10-9、10-7、10-5mol/L的L-苏糖酸钙、17β-雌二醇、大豆异黄酮和L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组的新培养液200μl(含10nM1，25-(OH)2D3)，即使各个药物浓度均有10-9、10-7、10-5mol/L三种工作浓度，另10孔内加入含等体积的三蒸水的全培养液作为对照，继续培养144h。每2d换液一次，每次换液4/5体积的培养液，并换以同体积的培养液。去除的旧培养液置入微量离心管中-70℃保存。
1.3破骨细胞形态观察及鉴定1.3.1倒置相差显微镜观察培养细胞的形态、运动情况和骨吸收陷窝的形成。
1.3.2TRAP染色及破骨细胞鉴定培养第7天，取各用药组和对照组骨片各2张，TRAP染色进行破骨细胞鉴定将骨片自然晾干，再于体积分数为2.5％的戊二醛固定液中4℃固定10min，同时温育孵育液(六偶氮副品红1ml，0.2mol/L醋酸缓冲液18ml，萘酚AS-BI磷酸盐20mg，50mmol酒石酸钾钠，pH5.0)至37℃。取出骨片，双蒸水洗3次，苏木素(Sigma产品)复染2min，蒸馏水冲洗，晾干，二甲苯透明，DPX封固，光镜观察。对照组中不含萘酚AS-BI磷酸盐。
1.4破骨细胞骨吸收功能测定1.4.1形态学评估1.4.1.1骨吸收陷窝测量及IOD测量培养的第7d取出培养板中各实验组(各浓度药物组)的骨片及对照组的骨片各8张，2.5％戊二醛固定7min，于0.25mmol/L氢氧化铵中超声清洗5min×3次，系列酒精脱水，自然晾干，1％甲苯胺蓝(含1％硼酸钠)染色3min，蒸馏水清洗，于尼康E600研究显微镜(×100倍)下，SPOT Cool CCD摄像头采集图像，用image pro plus 4.01计算机图像分析系统检测整张骨吸收陷窝的面积和IOD。
1.4.1.2SEM陷窝计数随机选取8张骨片光镜200倍下作骨吸收陷窝计数分析，再经蒸馏水超声清洗10min×3次，经体积分数为1％的锇酸固定、系列酒精脱水、CO2临界点干燥、镀金，作SEM的观察，300倍下骨吸收陷窝计数分析。
1.4.2生化学评估将新旧上清液混匀，各组保持相同体积，吸取上清液，按产品说明用ELISA法测定其I型胶原C-末端肽(CTx)的浓度，以ng/ml表示。
1.5数据处理数据均以x±s表示，多组计量资料样本均数的比较采用成组设计的方差分析，均数比较采用q检验或Dunnett-t检验，并作两变量的直线相关分析。采用SPSS 10.0软件进行统计分析。
2结果2.1破骨细胞形态学观察及鉴定 相差倒置显微镜下观察见多核巨细胞，细胞呈油煎蛋形，长条形、漏斗形或不规则形，内含约数个或数十个细胞核，体积较大，胞浆丰富、可见大小不一的空泡，边缘可见亮区，即为破骨细胞或破骨细胞样细胞；TRAP染色见TRAP阳性细胞培养7d后作TRAP染色，各骨片上均可见数量不等的TRAP阳性的破骨细胞，为多核巨细胞，胞浆丰富，TRAP染色胞浆呈颗粒状红色；甲苯胺蓝染色-光镜观察各骨片上有骨吸收陷窝形成，骨吸收陷窝呈紫红色，边界清楚，呈圆形、椭圆形、蜡肠形或不规则；扫描电镜(SEM)下见各骨片上有骨吸收陷窝形成，骨吸收陷窝边界清楚。SEM下进行陷窝计数(×300)与甲苯胺蓝染色-光镜观察下计数(×200)，结果分别为122.51±57.61和119.18±57.10陷窝数/骨片(n＝8)，基本一致(r＝0.892 p＜0.001)。
2.2破骨细胞骨吸收功能的测定尼康Eclipse600 & SPOT计算机图像分析系统分析各浓度药物组和对照组骨吸收陷窝面积、积分光密度(IOD)及ELISA法测定上清液CTx浓度(见表6)。
2.2.1各实验组骨吸收陷窝面积及上清液CTx浓度与对照组比较 除葡萄糖酸钙各组骨吸收陷窝面积、IOD及上清液CTx浓度较对照组无显著性差异(p＞0.05)外，L-苏糖酸钙、大豆异黄酮、L-苏糖酸钙+大豆异黄酮、17β-雌二醇的各浓度组陷窝面积、IOD及CTx浓度均较对照组低(p＜0.05或p＜0.001)。说明除葡萄糖酸钙组外，其余四组在不同浓度下对破骨细胞活性都有一定的抑制作用，其中L-苏糖酸钙+大豆异黄酮的各浓度组优于L-苏糖酸钙、大豆异黄酮和17β-雌二醇的相应各浓度组。
表6 各浓度药物组和对照组骨吸收陷窝面积、IOD及CTx浓度值(n＝8)药物 药物浓度 陷窝面积 CTx浓度 IOD(×102um2/骨片) (ng/ml) (×103)L-苏糖酸钙10-5M3974.38±450.92 265.62±33.06 41859±498510-7M4592.57±373.42 322.85±21.82 49857±551310-9M5094.32±417.58 415.37±25.42 56142±5124大豆异黄酮10-5M3526.48±358.23 368.85±34.25 48881±468410-7M4157.94±435.74 398.95±21.85 55268±585410-9M4435.36±397.25 449.25±18.98 62174±6845L-苏糖酸钙+ 10-5M+10-5M 2914.16±528.98 159.65±10.25 28645±7456大豆异黄酮10-7M+10-7M 3516.32±412.95 235.98±25.58 34856±485610-9M+10-9M 4216.63±551.24 288.36±22.65 50257±756417β-雌二醇 10-5M2832.15±592.48 169.85±28.28 29117±701410-7M3468.42±485.47 228.42±21.17 35887±573410-9M4538.54±345.26 297.58±18.25 49724±5465对照组 6144.37±619.87 495.65±36.58 84012±189本研究证实本发明组合物具有显著的抑制破骨细胞骨吸收活性的作用，使骨吸收陷窝面积及上清液CTx浓度减少，且呈剂量依赖性，大豆异黄酮组具有类似的作用，但较同浓度的L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组作用弱(p＜0.05)，L-苏糖酸钙+大豆异黄酮组与17β-雌二醇作用相当，二者比较无显著性差异，而L-苏糖酸钙组的作用却不明显。上清液I型胶原C-末端肽浓度与骨片骨吸收陷窝面积高度相关，且敏感性更高，可作为定量检测体外破骨细胞骨吸收功能的有效指标。
四、本发明组合物对股骨头坏死的疗效的临床试验入选者为40-65周岁，男女各半；在治疗前一个月内未服用其它相关治疗药物的股骨头坏死患者；给药期为6个月，试验过程中不得服用其它相关的治疗药物；试验结束后进行X光检查，及对其它指标进行评估。
试验共分两组，一组服用本发明中的组合物，一组服用安慰剂评价标准分三个等级，治愈疼痛跛行功能障碍消失，无骨坏死及骨增生硬化；显效疼痛跛行功能障碍消失，股骨头变大或扁平，骨坏死、骨增生硬化有改善；无效疼痛跛行功能障碍无明显改善，检查显示股骨头坏死及骨增生硬化无改善。
试验结果用本发明实施例1的组合物共治疗股骨头坏死病人126例。具体实验结果见下表

经统计，两组之间差异十分显著(P＜0.01)
权利要求
1.一种用于预防和/或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松症或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的含有L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物，其中L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1-1500∶1-100。
2.根据权利要求1的组合物，其中L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1.5-1000∶1-70。
3.根据权利要求1的组合物，其中L-苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为2.5-6∶1-2.5。
4.根据权利要求1的组合物，进一步包括维生素D3，其中L-苏糖酸钙∶大豆异黄酮∶维生素D3的重量比为1-1500∶1-100∶0.000125-0.00125，优选为1.5-1000∶1-70∶0.00025-0.00075，更优选2.5-6∶1-2.5∶0.000375-0.0005。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，还包括药学可接受的载体或稀释剂或常用添加剂。
6.根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的1-95％。
7.根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的10-90％。
8.根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的50-90％。
9.根据权利要求1的组合物，其中在所述组合物中，L-苏糖酸钙和大豆异黄酮的总量为组合物总量的70-90％。
10.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物以片剂、胶囊、口服液、颗粒剂的形式存在。
全文摘要
本发明涉及一种可用于预防或治疗骨性关节炎、股骨头坏死、骨质疏松或骨折，尤其因骨质疏松导致的骨折，或用于增加骨密度的含有L－苏糖酸钙，大豆异黄酮和任选的维生素D3的组合物，其中L－苏糖酸钙与大豆异黄酮的重量比为1－1500∶1－100。实验证明，(1)能够显著刺激软骨细胞的生长，从而可促进软骨的生长和修复；(2)大鼠骨关节炎模型的研究结果显示可以减轻关节软骨的损害，预防和治疗骨性关节炎；(3)抑制破骨细胞的骨吸收作用，刺激成骨细胞的生长，增加I型骨胶原的合成；(4)促进骨血管再生、增殖和改善骨血液循环，(5)提高骨密度，增加骨钙化程度和韧性，增加骨折断的受力强度和做功的能量；(6)用本发明的组合物治疗股骨头坏死，也取得了非常好的疗效。
文档编号A61P19/02GK1602856SQ0313478
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月30日 优先权日2003年9月30日
发明者戴向国 申请人:戴向国