专利名称：中药野马追有效部位在制备抗病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药野马追有效部位在制备抗病毒药物中的应用，尤其是在制备抗SARS病毒的口服或注射药物中的应用。
背景技术：
呼吸系统感染性疾病包括上呼吸道感染和肺部感染，是由病毒与病菌引起的炎症，多伴随头痛、发热、咳嗽、痰咯等症状，包括常见的普通感冒、流感、气管炎、支气管炎、肺炎、腺病毒疾病、合胞病毒疾病等。目前，西医对病毒感染性疾病无特效药，治疗仅以支持对症治疗为主。由于病毒种类繁多，感染范围广，免疫不持久，须依赖多次再感染方能维持，因此，广泛使用疫苗来预防不现实。而中医药防治本类疾病较西医有一定的优势。呼吸道感染在中医临床中多属“发热”、“头痛”、“感冒”、“咳嗽”、“痰饮”等范畴，有外感与内因之分，且往往内外因素共同作用于人体而致病。在脏腑功能方面，开始病在肺，经反复发作，势必累及脾、肾，甚至影响心脏功能。在疾病的发展过程中，由于人体的体质有强弱不同，禀赋有阴阳之分，疾病发展的趋势有快有慢，因此，临床治疗以辨证施治为主。临床研究表明，某些中药对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等有明显的杀菌抑菌作用，某些中药对细菌尸体类毒素有拮抗作用，某些中药对病毒有抑制作用，诸多研究工作挖掘了中药对呼吸系统感染性疾病治疗的确定性和广泛性。
野马追为菊科植物林泽兰(Eupatorium lindleyanum DC.)的全草，秋季采收，拣净，晒干或阴干。江苏民间常用野马追作清热解毒药，味苦，性平，有清肺止咳，化痰平喘，降血压之功效，主治支气管炎痰多咳嗽，高血压病。临床上主要用于慢性支气管炎，咳嗽痰多。
野马追全草含黄酮类、生物碱类、香豆素类与挥发油等成分。药理研究表明，总黄酮和总生物碱均有明显的镇咳作用。总生物碱有降压功效。其100％煎液1∶4，1∶8，1∶32，1∶64可分别抑制流感杆菌，甲型链球菌金黄色葡萄球菌及卡他球菌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是研究中药野马追有效部位在制备抗病毒尤其是抗SARS病毒药物中的应用，并确定有效部位的基本组成，以便于研究制备工艺以及建立药材和制剂质量标准，从而确保野马追抗病毒药物治疗效果可靠、质量稳定。同时在此基础上，研制含野马追有效部位的用于哺乳动物的抗病毒的口服制剂或注射剂。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案。
野马追总黄酮及其医药学上可接受的盐在制备防治病毒药物中的用途。
野马追总黄酮主要包括棕矢车菊素、金丝桃甙和黄芪甙。野马追总黄酮中还有槲皮素。野马追总黄酮中还有山萘酚和/或三叶豆甙。总黄酮中黄酮甙的含量≥20％(重量百分数)野马追总黄酮防治病毒是指流感病毒、仙台病毒和/或SARS病毒。
所述野马追总黄酮及其医药学上可接受的盐在制备防治病毒药物中的用途，其野马追总黄酮可以任选地与一种或多种其它抗病毒剂组合。例如，可与传统抗病毒中药金银花、野菊花、石膏、黄芩和/或苡仁的提取物(如水提物或醇提取)组配，也可与中药黄芩、虎杖的提取物(如水提物或醇提取)和/或牡荆油等组合抗病毒药物组配。
野马追总黄酮及其医药学上可接受的盐在制备防治病毒药物中的用途，所述药物为含治疗有效量野马追总黄酮或其医药学上可接受的盐，和药学上可接受组分和/或载体。药学上可接受组分为与野马追总黄酮联合防治病毒的化合物或组合物。所述药物为含治疗有效量的野马追总黄酮和药学上可接受组分和/或载体的口服制剂、胃肠外给药制剂，具体为片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、注射剂或静脉滴注剂。
药学上可接受载体有，崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000；润湿剂如十二烷基硫酸钠、吐温80；骨架材料如羟丙甲纤维素、乙基纤维素等。
软胶囊的载体，油相用大豆油、聚乙二醇400、棉籽油、花生油、麻油、玉米油、橄榄油等；增溶剂或潜溶剂如吐温80、聚氧乙烯醚蓖麻油、苯甲酸苄酯、乳酸乙酯等；抗氧剂如没食子酸丙酯、特丁基苯酚(BHT)、维生素E等。胶壳中明胶、甘油与水的比例可适当调节，胶壳中还可添加其他成分，如防腐剂对羟基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯等；增塑剂如山梨醇等；稳定剂如阿拉伯胶等；遮光剂如二氧化钛、硫酸钡、沉降碳酸钙等。
注射剂辅料有，增溶剂如吐温类、普流罗尼F-68、聚乙二醇、聚氧乙烯醚蓖麻油、聚维酮等；助溶剂如亚硫酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠；酰胺类化合物如尿素、乙酰胺、硫脲、苯甲酰胺等，氨基酸类如精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、组氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸，含羟基或羧基的化合物如蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、枸橼酸及其钠盐、乳酸、水杨酸钠等；助悬剂如羧甲基纤维素钠、聚维酮、羟丙甲基纤维素等；防腐剂如尼泊金甲、乙、丙和丁酯；pH调节剂如枸橼酸及枸橼酸盐、磷酸盐等；溶剂如注射用水、注射用乙醇、丙二醇等。
一、大孔树脂柱层析不同洗脱部分化学成分比较(薄层层析法)药材经80％乙醇提取得浸膏，以蒸馏水溶解，过滤，滤液浓缩，上大孔树脂柱(浸膏量的十倍大孔树脂湿法装柱，D101、DA201、D301、LD605、AB-8、S-8、HPD-100、HPD-600、NK-9、ZTC-I皆可)，依次以蒸馏水，10％乙醇，20％乙醇，30％乙醇，40％乙醇，50％乙醇，60％乙醇，70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇洗脱得水洗脱部分，10％乙醇部分，20％乙醇部分，30％乙醇部分，40％乙醇部分，50％乙醇部分，60％乙醇部分，70％乙醇部分，80％乙醇部分，90％乙醇部分，95％乙醇部分，进行硅胶薄层层析，展开剂为氯仿∶甲醇(5∶1)，喷三氯化铝显色剂，黄酮成分在365nm紫外灯下呈黄色，见图1。
附图表明，从30％C2H5OH至70％C2H5OH洗脱部分均有较多黄酮类成分，故采用大孔树脂柱层析(H2O，20％C2H5OH，70％C2H5OH，95％C2H5OH分别洗脱)来富集分离黄酮类成分。
二、活性筛选部位制备野马追为菊科植物林泽兰(Dendranthema nankingense X.D.Cui)的干燥地上部分。取野马追药材1.2kg，80％乙醇加热回流提取2次，回收溶剂，得浸膏144g，加水溶解浸膏后，用石油醚萃取，回收萃取溶剂后，石油醚部分29g，经硅胶(100-200目)层析分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得三个单体化合物，通过分析其理化性质与波谱学数据，与文献报道进行比较，确认了其结构，为蒲公英甾醇乙酸酯(96mg)、伪蒲公英甾醇(54mg)、伪蒲公英甾醇棕榈酸酯(66mg)。
取石油醚萃取后的母液，用大孔树脂(D101、DA201、D301、LD605、AB-8、S-8、HPD-100、HPD-600、NK-9、ZTC-I)柱层析，依次以水与不同浓度的乙醇梯度洗脱，收集水、20％乙醇、70％乙醇、95％乙醇洗脱部分，干燥后分别得到53g、34.6g、21g、3g。其中，70％乙醇洗脱部分为野马追总黄酮，真空干燥后重21g，称取野马追总黄酮154mg作为抗SARS病毒实验样品，见实施例1、2；同时将余野马追总黄酮(70％乙醇洗脱部分)进行硅胶柱层析(100-200目)，先用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，再用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱(所谓梯度洗脱是指二种溶剂组成的洗脱液中，极性大溶剂的比例逐渐加大，使得洗脱液的极性从小到大逐渐增加)，分离得到6个单体化合物，通过分析其理化性质与波谱学数据，与文献报道进行比较，确认了六个有效成分，为槲皮素(31mg)、山萘酚(14mg)、棕矢车菊素(58mg)、金丝桃甙(36mg)、三叶豆甙(18mg)、黄芪甙(36mg)。
目前，野马追药材的研究基本上局限于药理、疗效与毒副作用，因此，对其有效成分的提取、分离与结构鉴定是当务之急。申请人对野马追总黄酮、总生物碱类等有效部位进行系统分离，得到众多单体化合物，用作筛选工艺，以及建立药材和制剂质量标准的标准物质。
图1大孔树脂柱层析不同洗脱部分(10％乙醇部分，20％乙醇部分，30％乙醇部分，40％乙醇部分，50％乙醇部分，60％乙醇部分，70％乙醇部分，80％乙醇部分，90％乙醇部分，95％乙醇部分)化学成分比较的薄层层析图。
具体实施例方式
野马追总黄酮药效学试验实施例1野马追总黄酮体外抗SARS病毒药物初筛试验结果
(一)实验材料1.细胞VeroE6细胞(非洲绿猴肾细胞)。
2.病毒SARS病毒，BJ-01株。
3.培养液含10％胎牛血清的DMEM培养液。
4.药物野马追总黄酮提取物，江苏省中医药研究院提供(二)实验步骤1.CPE法测定病毒对VeroE6细胞半数毒性浓度(TCID50)。
1.CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度。
2.药物的最大无毒浓度对SARS病毒的药效测定。
(三)实验结果1.病毒的TCID50为10-7。
2.药物取4个浓度即200、100、10和1ug/ml进行细胞毒性测定，每浓度做4个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为100ug/ml。
3.取100ug/ml药液，做4个复孔，观察对SARS病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照。结果显示该浓度对SARS病毒有抑制作用。
结论在本试验条件下，野马追总黄酮对VeroE6细胞的无毒浓度为100ug/ml，此浓度对SARS病毒有完全抑制作用。
实施例2野马追总黄酮抗病毒试验(一)材料来源药物野马追总黄酮提取物，所含浓度10.64mg/ml，江苏省中医药研究院提供。
病毒株(1)流感病毒A/FMl/47/H1N1(属正粘病毒，本室保存，鸡胚传代)；(2)仙台病毒(属副粘病毒，本室保存)。
细胞MDCK，人胚肺二倍体传代株。
(二)方法所用病毒预先传代，滴定后取100TCID50为感染量。
药物和病毒相互作用处理方法①药物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml先作用细胞，24小时后再加100TCID50的流感病毒或仙台病毒；②药物100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml加100TCID50的流感病毒或仙台病毒4℃过夜，第二天接种细胞；③药物100ug/mi、30llg/mi、10ug/ml加100TCID50的流感病毒或仙台病毒时加入细胞；④病毒对照。
⑤药物对照利巴韦林100ug/ml⑥细胞对照。
实验重复3次。
(三)试验结果表1、野马追总黄酮提取物对流感病毒和仙台病毒的抑毒作用药物浓度 100ug/ml 30ug/ml 10ug/ml药物先处理细胞24小时后加病毒 FMl病毒- --仙台病毒HA - --Hd - --药物加病毒放4C过夜FMl病毒- --仙台病毒HA ＜1∶5＜1∶5 ＜1∶5Hd + ++ ++药物和病毒同时加入细胞FMl病毒- --仙台病毒HA 1∶5 1∶5 1∶5Hd + ++ ++-+++病毒对照FMl病毒1∶10仙台病毒 1∶10注流感病毒用MDCK细胞，仙台病毒用人胚肺细胞。
药物在三个浓度对细胞均无毒性。
药物对流感病毒FMl抑毒效果如下①药物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml先处理细胞，然后再加100TCID50FMl病毒，37℃CO2培养箱培养，逐日观察，均有显著抑毒效果。
②药物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml三个浓度，加100TCID50FMl病毒，置于4℃冰箱处理，然后再接种细胞，37℃CO2培养箱培养，逐日观察，也有显著抑毒效果。
③药物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml三个浓度和100TCID50FMl，同时加入细胞，37℃CO2培养箱培养，逐日观察，也有显著抑毒效果。
药物对仙台病毒抑毒效果如下①药物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml先处理细胞，然后再加100TCID50仙台病毒，37℃CO2培养箱培养，逐日观察，有效。
②药物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml和仙台病毒同时加入，置于4℃冰箱处理，然后再接种细胞，37℃CO2培养箱培养，逐日观察，无抑毒效果，血凝和血吸附均阳性。
③药物以100ug/ml、30ug/ml、10ug/ml三个浓度和100TCID50仙台病毒同时加入细胞，37℃CO2培养箱培养，逐日观察，无抑毒效果。
结论野马追总黄酮提取物对流感病毒(亚甲型，H1N1)FMl株，三个不同药浓度均有显著抑毒效果。
野马追总黄酮提取物对副流感病毒(仙台病毒株)，三个不同浓度对药物先处理细胞，24hr后加病毒有效，而对三个不同浓度对病毒和药物放4℃处理，及同时加入细胞均无抑毒效果。
权利要求
1.野马追总黄酮及其医药学上可接受的盐在制备防治病毒药物中的用途。
2.权利要求1所述防治病毒药物中的用途，其特征在于野马追总黄酮主要包括棕矢车菊素、金丝桃甙和黄芪甙。
3.权利要求2所述防治病毒药物中的用途，其特征在于野马追总黄酮中还有槲皮素。
4.权利要求3所述防治病毒药物中的用途，其特征在于野马追总黄酮中还有山萘酚和/或三叶豆甙。
5.权利要求1所述防治病毒药物中的用途，其特征在于防治病毒是指流感病毒、仙台病毒和/或SARS病毒。
6.权利要求1所述防治病毒药物中的用途，其特征在于所述野马追总黄酮任选与一种或多种其它抗病毒剂组合。
7.权利要求1-3之一所述防治病毒药物中的用途，其特征在于所述药物为含治疗有效量野马追总黄酮或其医药学上可接受的盐，和药学上可接受组分和/或载体。
8.权利要求7所述防治病毒药物中的用途，其特征在于药学上可接受组分为与野马追总黄酮联合防治病毒的化合物或组合物。
9.权利要求8所述防治病毒药物中的用途，其特征在于所述药物为含治疗有效量的野马追总黄酮和药学上可接受组分和/或载体的口服制剂、胃肠外给药制剂。
10.权利要求9所述防治病毒药物中的用途，其特征在于所述药物为片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、注射剂、静脉滴注剂。
全文摘要
野马追总黄酮及其医药学上可接受的盐在制备防治病毒尤其是防治SARS病毒药物中的用途，野马追总黄酮主要选自槲皮素、山萘酚、棕矢车菊素、金丝桃甙、三叶豆甙、黄芪甙，或者槲皮素、山萘酚、棕矢车菊素、金丝桃甙、三叶豆甙和黄芪甙的混合物，野马追总黄酮对VeroE6细胞无毒浓度为100ug/ml，此浓度对SARS病毒有完全抑制作用。
文档编号A61P31/12GK1486699SQ03152938
公开日2004年4月7日 申请日期2003年9月4日 优先权日2003年9月4日
发明者段金廒, 杨念云, 钱士辉, 沈明勤, 钱大玮, 彭蕴茹 申请人:江苏省中医药研究院