专利名称：从水母中分离的具有抗氧化活性的蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物，具体讲是两类具有抗氧化活性的水母蛋白，可作为抗衰老药物的药源，同时也为天然食品添加剂的研制提供新途径。
背景技术：
活性氧自由基对机体具有巨大的损伤作用，如会引起蛋白质损伤、酶失活、膜质过氧化，导致衰老、肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病的发生。人工合成的二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基甲氧基(BHA)、丙二醇(PG)等具有较好的清除活性氧自由基的作用，常用作食品添加剂，但近年研究表明，BHT、BHA、PG具有致癌作用。因此筛选对人体安全、高效的活性氧清除剂有着重要的意义。
水母蛋白结构新颖独特，具有多种生物活性，如酶活性、影响离子运转等，但对于抗氧化活性还未见报道。我国水母资源丰富，从海南岛、广东、山东，一直到辽宁沿海均有分布，水母大量存在时，它将干扰人们在海上的几乎所有活动，如游泳，养渔业，更重要的是它伤及人的身体，如果被它刺到，能产生多种症状，包括疼痛、皮肤蛰痕、水肿、神经抑制、心跳停止、麻痹、甚至死亡。但对水母资源的利用，现阶段只是经简单加工后，作为食品，附加值不高。所以有必要对水母蛋白进行研究，使水母这种低值生物资源获得高值化利用。
发明内容
本发明的目的是利用丰富的水母资源，从水母中分离出具有抗氧化活性的蛋白及分析水母蛋白的应用，使水母这种低值生物资源获得高值化利用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为分离得到了两类具有抗氧化活性的水母蛋白，第一类的分子量大于800K，第二类的分子量小于30K。(根据葡聚糖凝胶的排阻分子量来初步确定水母蛋白的分子量)
这两类水母蛋白的分离工艺步骤为1)将称量的水母均匀绞碎后，细胞破碎，加入0.5-5倍的重量/体积比的磷酸缓冲溶液中，放入2-6℃下，浸泡0.5-2h；2)在4℃下，转速10000-20000rpm(相对离心力9160-25480g)，离心10-30min，取上清液；残渣用0.5-3倍的重量/体积比的磷酸缓冲溶液(5-20mM，PH4-8)二次浸取，在4℃下，浸泡0.5-2h；再在4℃下，转速10000-20000rpm(相对离心力9160-25480g)，离心10-30min；合并两次离心的上清液；3)用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定合并的上清液中水母蛋白的浓度；4)用凝胶过滤层析法，将2)中的合并的上清液分离，得到两类水母蛋白；第一类蛋白的分子量大于800K，等电点PI在3-9，于百分饱和度30-60％的硫酸铵溶液中沉淀；第二类蛋白的分子量小于30K，等电点PI在4-8，于百分饱和度0-30％的硫酸铵溶液中沉淀；所获得的两类蛋白的氨基酸质量百分组成如下表1两类蛋白的氨基酸组成(％)氨基酸种类 第一类蛋白第二类蛋白天门冬氨酸(Asp) 7.61 8.43苏氨酸(THR) 4.12 3.89丝氨酸(SER) 2.52 2.62色氨酸(TRP) 3.23 3.43谷氨酸(GLU) 13.29 13.15甘氨酸(GLY) 13.09 12.18丙氨酸(ALA) 5.35 4.86胱氨酸(CYS) 11.00 11.18缬氨酸(VAL) 5.23 4.99蛋氨酸(MET) 3.85 3.89异亮氨酸(ILE)3.06 3.11亮氨酸(LEU) 3.85 3.82酪氨酸(TYR) 2.06 2.07苯丙氨酸(PHE)4.19 4.12
赖氨酸(LYS) 4.19 4.20组氨酸(HIS) 0.50 0.65精氨酸(ARG) 6.02 6.09脯氨酸(PRO) 5.78 6.09总氨基酸 98.94 98.77所述水母为新鲜水母或置于-80～-20℃的低温下保存的新鲜水母；磷酸缓冲溶液的浓度5-20mM，PH4-8。
这两种蛋白能够抑制超氧阴离子自由基(O2·-)、羟自由基(·OH)的产生，防止红细胞因过氧化氢氧化溶血和肝脂质过氧化。
本发明具有如下优点1)抗氧化活性高。本发明水母蛋白抗氧化活性高，可作为抗衰老药物的药源，同时也为天然食品添加剂的研制提供新途径。
2)无毒害。本发明水母蛋白属于天然抗氧化剂，对人、畜无毒害。
3)生产成本低。本发明水母蛋白利用了水母这种丰富的海洋生物资源，为水母这种低值资源获得高值化发展提供了新的途径。
图1A～C为葡聚糖凝胶分离水母蛋白洗脱体积和吸光度关系曲线；其中，图1A葡聚糖凝胶SephadexG-100分离水母蛋白；图1B葡聚糖凝胶SephadexG-200分离第一类水母蛋白；图1C葡聚糖凝胶SephadexG-50分离第二类水母蛋白；图2A～B为两类蛋白的红外光谱图；图2A第一类蛋白的红外谱图；图2B第二类蛋白的红外谱图；图3水母蛋白的硫酸铵(分级)沉淀曲线；第一类蛋白分布于百分饱和度30％-60％的硫酸铵沉淀中；第二类蛋白分布于百分饱和度0-30％的硫酸铵沉淀中。
具体实施例方式
本发明的保护范围不仅局限于下列实施例中。
一、水母蛋白分离的实施例实施例1(1)将一定量的水母用超声波破碎仪破碎，加入0.5倍的重量/体积比的5mM，pH4的磷酸缓冲溶液(PB)中，放入2℃下，浸泡0.5h；
(2)在4℃下，转速10000rpm，离心30min，取上清液；残渣用0.5倍的重量/体积比的5mM，pH4的磷酸缓冲溶液(PB)二次浸取，在4℃下，浸泡0.5h；再在4℃下，转速10000rpm，离心30min；合并两次离心的上清液；(3)用考马斯亮兰染色法(该法选自《蛋白质分子基础》，陶慰孙等编，高等教育出版社)，以牛血清白蛋白为标准，测水母蛋白在595nm处的吸光度(A595)，根据朗伯比尔定律，进而算出上清液中水母蛋白的浓度(Cmg/ml)。
(4)用凝胶过滤层析法(该法选自《蛋白质分子基础》，陶慰孙等编，高等教育出版社)，选用凝胶SephadexG-100，将(3)中的合并的上清液分离，得到两类水母蛋白，洗脱液为50mM，PH6的磷酸缓冲溶液。第一类蛋白的分子量大于800K(用SephadexG-200对其分离，洗脱体积与空体积相当，SephadexG-200的排阻分子量为800K)，第二类蛋白的分子量小于30K(用SephadexG-50对其分离，洗脱体积大于空体积，SephadexG-50的排阻分子量为30K)。
实施例2(1)将一定量的水母用超声波破碎仪破碎，加入2.0倍的重量/体积比的10mM，pH6的磷酸缓冲溶液(PB)中，放入4℃下，浸泡1h；(2)在4℃下，转速15000rpm，离心20min，取上清液；残渣用1.5倍的重量/体积比的10mM，pH6的磷酸缓冲溶液(PB)二次浸取，在4℃下，浸泡1h；再在4℃下，转速15000rpm，离心20min；合并两次离心的上清液；(3)用考马斯亮兰染色法(该法选自《蛋白质分子基础》，陶慰孙等编，高等教育出版社)，以牛血清白蛋白为标准，测水母蛋白在595nm处的吸光度(A595)，根据朗伯比尔定律，进而算出上清液中水母蛋白的浓度(Cmg/ml)。
(4)用凝胶过滤层析法(该法选自《蛋白质分子基础》，陶慰孙等编，高等教育出版社)，选用凝胶SephadexG-100，将(3)中的合并的上清液分离，得到两类水母蛋白，洗脱液为50mM，PH6的磷酸缓冲溶液。第一类蛋白的分子量大于800K(用SephadexG-200对其分离，洗脱体积与空体积相当，SephadexG-200的排阻分子量为800K)，第二类蛋白的分子量小于30K(用SephadexG-50对其分离，洗脱体积大于空体积，SephadexG-50的排阻分子量为30K)。
实施例3(1)将一定量的水母用超声波破碎仪破碎，加入5.0倍的重量/体积比的20mM，pH8的磷酸缓冲溶液(PB)中，放入4℃下，浸泡2h；(2)在4℃下，转速20000rpm，离心10min，取上清液；残渣用1.5倍的重量/体积比的20mM，pH8的磷酸缓冲溶液(PB)二次浸取，在4℃下，浸泡1h；再在4℃下，转速20000rpm，离心10min；合并两次离心的上清液；(3)用考马斯亮兰染色法(该法选自《蛋白质分子基础》，陶慰孙等编，高等教育出版社)，以牛血清白蛋白为标准，测水母蛋白在595nm处的吸光度(A595)，根据朗伯比尔定律，进而算出上清液中水母蛋白的浓度(Cmg/ml)。
(4)用凝胶过滤层析法(该法选自《蛋白质分子基础》，陶慰孙等编，高等教育出版社)，选用凝胶SephadexG-100，将(3)中的合并的上清液分离，得到两类水母蛋白，洗脱液为50mM，PH6的磷酸缓冲溶液。第一类蛋白的分子量大于800K(用SephadexG-200对其分离，洗脱体积与空体积相当，SephadexG-200的排阻分子量为800K)，第二类蛋白的分子量小于30K(用SephadexG-50对其分离，洗脱体积大于空体积，SephadexG-50的排阻分子量为30K)。
表2葡聚糖凝胶SephadexG-100分离水母蛋白
如图1A～C所示，葡聚糖凝胶分离水母蛋白洗脱体积和吸光度关系曲线。其中，图1A为葡聚糖凝胶SephadexG-100分离水母蛋白；图1B为葡聚糖凝胶SephadexG-200分离第一类水母蛋白；图1C为葡聚糖凝胶SephadexG-50分离第二类水母蛋白。
二、水母蛋白抗氧化活性的实施例1.水母蛋白对超氧阴离子自由基的清除作用采用吩嗪硫酸甲酯-NADH体系产生自由基。反应体系为3.0ml的Tris-HCl缓冲液(16mmol/L，pH8.0)，其中含有78μmol/L还原型辅酶I(NADH)，50μmol/L硝基四氮唑蓝(NBT)，10μmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)，以及不同浓度的水母蛋白溶液。超氧阴离子自由基和NBT的显色反应采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度。在空白对照实验中，用Tris-HCl缓冲液替换NADH。
实验结果以清除率表示清除率％＝(A-A1)/(A-A0)×100％；实验结果参照表3所示，其中，A空白对照值，A1加入样品后的吸光值，A0参比；表3水母蛋白对超氧自由基的清除作用
结果分析两类蛋白对超氧阴离子具有很强的清除作用，清除作用对浓度具有依赖性，即随着浓度的提高，清除作用增强，EC50分别为6.12μg/ml，0.88μg/ml，远低于BHA，BHT，维生素E，它们的EC50分别为31μg/ml，61μg/ml，88μg/ml(MünirOktay，
Gülin and .
Determination of in vitro antioxidantactivity of fennel(Foeniculum vulgare)seed extracts，Lebensmittel-Wissenschaftund-Technologie，Volume 36，Issue 2，March 2003，Pages 263-271)。
2.水母蛋白对羟自由基的清除作用·OH是由EDTANa2-Fe(II)-H2O2体系产生，由于·OH可特异地使番红花红色褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量。反应体系中含有pH7.4的磷酸缓冲液1.5ml，番红花(260μg/ml)0.2ml，3％的H2O20.8ml，EDTANa2-Fe(II)0.7ml，一定量不同浓度的水母蛋白溶液，混合均匀后于37℃水浴保温30min，然后于520nm处测吸光度A值。空白组以蒸馏水代替样品液，对照组以蒸馏水代替样品液和EDTANa2-Fe(II)，反应总体积为4.0ml。
实验结果以清除率表示清除率％＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％；实验结果参照表4所示；表4水母蛋白对羟自由基的清除作用
结果分析两类蛋白对羟自由基具有清除作用，第二类蛋白的清除作用很强，浓度为9.99μg/ml时，清除率达到94.49％。清除作用对浓度具有依赖性，即随着浓度的提高，清除作用增强。两类蛋白对羟自由基的EC50分别为45.42μg/ml，1.52μg/ml，远低于甘露醇和维生素E，它们的EC50分别为4536μg/ml，1907μg/ml。
3.水母蛋白对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验健康Wistar大鼠眼眶取血，制成抗凝血，1000×g离心10min，移弃血浆和白细胞，向沉淀的红细胞中加入等渗的生理盐水，混匀，1000×g离心10min，弃上清液，如此反复2次洗涤红细胞，将红细胞制成0.5％的悬浮液。取红细胞悬浮液1ml，加不同浓度的水母蛋白溶液，最后加100mmol/l的H2O2，混匀，37℃温浴60min，用生理盐水稀释5倍，1000×g离心10min，上清液于415nm处测定吸光度值。实验结果参照表5所示；表5水母蛋白对H2O2诱导的红细胞氧化溶血作用
结果分析两类蛋白对H2O2诱导的红细胞氧化溶血具有很强的抑制作用，第一类蛋白的浓度为6.74μg/ml时，抑制率达到81.21％，第二类蛋白的浓度为0.47μg/ml时，抑制率达到84.35％，抑制率对浓度的依赖性不是很强，随着浓度的提高，抑制率变化不是很明显。
4.水母蛋白对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用健康Wistar大鼠，颈椎脱臼致死，迅速分离肝组织，用冰冷的Tris-HCl缓冲液(20mmol/l)制成20％的匀浆，9810×g离心20min，沉淀再洗一次并离心，合并上清液。在0.2mol/l Tris-HCl缓冲液中(pH7.4)加含肝匀浆液0.2ml，FeSO410μmol/l，抗坏血酸0.12mmol/l及不同浓度的水母蛋白溶液，在37℃温浴60min，保温结束后加入20％三氯乙酸(TCA)1.0ml终止反应。混匀，再加入0.67％硫代巴比妥酸(TBA)1.5ml，沸水浴加热15min。离心去除蛋白质沉淀后，于532nm测定吸光度值。实验结果参照表6所示。
表6水母蛋白对大鼠肝匀浆脂质过氧化作用
结果分析两类蛋白对肝匀浆脂质过氧化具有明显的抑制作用，EC50分别为18.74μg/ml，5.74μg/ml，两类蛋白对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性。
权利要求
1.从水母中分离的具有抗氧化活性的蛋白，其特征在于其分离步骤为，1)将称量的水母均匀绞碎后，细胞破碎，加入0.5-5倍的重量/体积比的磷酸缓冲溶液中，放入2-6℃下，浸泡0.5-2h；2)在4℃下，转速10000-20000rpm，离心10-30min，取上清液；残渣用0.5-3倍的重量/体积比的磷酸缓冲溶液二次浸取，在4℃下，浸泡0.5-2h；再在4℃下，转速10000-20000rpm，离心10-30min；合并两次离心的上清液；3)用凝胶过滤层析法，将2)中的合并的上清液分离，得到两类水母蛋白；第一类蛋白的分子量大于800K，等电点PI在3-9，于百分饱和度30-60％的硫酸铵溶液中沉淀；蛋白质量百分组成天门冬氨酸7.61％，苏氨酸4.12％，丝氨酸2.52％，色氨酸3.23％，谷氨酸13.29％，甘氨酸13.09％，丙氨酸5.35％，胱氨酸11.00％，缬氨酸5.23％，蛋氨酸3.85％，异亮氨酸3.06％，亮氨酸3.85％，酪氨酸2.06，苯丙氨酸4.19％，赖氨酸4.19％，组氨酸0.50％，精氨酸6.02％，脯氨酸5.78％，总氨基酸98.94％；第二类蛋白的分子量小于30K，等电点PI在4-8，于百分饱和度0-30％的硫酸铵溶液中沉淀；蛋白质量百分组成天门冬氨酸8.43％，苏氨酸3.89％，丝氨酸2.62％，色氨酸3.43％，谷氨酸13.15％，甘氨酸12.18％，丙氨酸4.86％，胱氨酸11.18％，缬氨酸4.99％，蛋氨酸3.89％，异亮氨酸3.11％，亮氨酸3.82％，酪氨酸2.07％，苯丙氨酸4.12％，赖氨酸4.20％，组氨酸0.65％，精氨酸6.09％，脯氨酸6.09％，总氨基酸98.77％。
2.按照权利要求1所述的从水母中分离的具有抗氧化活性的蛋白，其特征在于所述水母为新鲜水母或置于-80～-20℃的低温下保存的新鲜水母。
3.按照权利要求1所述的从水母中分离的具有抗氧化活性的蛋白，其特征在于磷酸缓冲溶液的浓度5-20mM，PH4-8。
4.一种权利要求1所述的蛋白的应用，其特征在于这两种蛋白能够抑制超氧阴离子自由基(O2-)、羟自由基(OH)的产生，防止红细胞因过氧化氢氧化溶血和肝脂质过氧化。
全文摘要
本发明涉及海洋生物，具体讲是两类具有抗氧化活性的水母蛋白，其分离步骤为，水母绞碎细胞破碎后，加入磷酸缓冲溶液中，2－6℃浸泡0.5－2h；转速10000－20000rpm，离心10－30min，取上清液；磷酸缓冲溶液二次浸取，转速10000－20000rpm，离心10－30min；合并两次离心的上清液；用凝胶过滤层析法，将合并的上清液分离，得到两类水母蛋白；它们能够抑制超氧阴离子自由基(O
文档编号A61P43/00GK1752101SQ20041005048
公开日2006年3月29日 申请日期2004年9月22日 优先权日2004年9月22日
发明者李鹏程, 于华华, 刘希光, 邢荣娥, 刘松, 郭占勇, 王丕波, 李翠萍 申请人:中国科学院海洋研究所