作为红细胞生成刺激剂的中链长脂肪酸类、甘油酯类和类似物的制作方法

专利名称：作为红细胞生成刺激剂的中链长脂肪酸类、甘油酯类和类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及贫血的治疗方法。包括与使用化疗和放疗相关的治疗贫血的方法以及治疗因慢性肾衰竭导致的贫血的方法或使用AZT(齐多夫定)治疗HIV-感染的患者。本发明还涉及减轻药物毒性和增强药物功效。本发明特别涉及中链长脂肪酸类作为祖红细胞，特别是红系爆发集落形成单位(红细胞)细胞或BFU-E细胞产生的刺激剂的应用，所述的中链长脂肪酸类诸如为癸酸、辛酸或其盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物。
背景技术：
化疗指的是应用细胞毒性剂根除癌细胞和肿瘤，所述的细胞毒性剂诸如，但不限于环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、长春碱、长春新碱、博来霉素、依托泊苷、托泊替康、伊立替康、泰索帝、泰素、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他滨、顺铂、卡铂或苯丁酸氮芥。然而，这些活性剂是非特异性的且特别在高剂量下，它们对正常和快速分裂的细胞具有毒性。这通常在进行化疗和放疗的患者中产生各种副作用。骨髓抑制，即在骨髓中血细胞产生严重减少是一种这类副作用。其特征在于贫血、白细胞减少、中性粒细胞减少、粒细胞缺乏和血小板减少。严重的慢性中性白细胞减少的特征还在于循环的中性白细胞数量选择性减少和对细菌感染的易感性增加。
使用化疗药治疗癌症的实质在于将细胞毒性机制与相对宿主细胞呈高度增殖的肿瘤细胞的选择性机制结合。然而，罕有化疗药具有这类选择性。化疗药的细胞毒性限制了对癌症患者的给药剂量、影响其治疗周期并严重危害其生命质量。
尽管其它正常组织也受到不良影响，但是骨髓对诸如化疗或放疗这类增殖特异性治疗特别敏感。急性和慢性骨髓毒性是癌症化疗的常见副作用，它导致血细胞计数下降和贫血、白细胞减少、中性白细胞减少、粒细胞缺乏和血小板减少。这类作用的一个原因在于由细胞毒性剂或放疗对这些细胞的杀伤作用和多成熟髓室排空诱导的反馈作用机制引起的干细胞分化导致的复制造血细胞(例如多能干细胞和其它先祖细胞)数量减少。第二个原因在于还涉及直接(突变)和间接(干细胞群老化)作用的干细胞的自我更新能力下降(Tubiana，M.等《放疗与肿瘤学》(Radiotherapy and Oncology)291-17，1993)。因此，癌症治疗通常导致红细胞或体循环中的红细胞减少。
红细胞为含有血红蛋白且主要用于氧的运输的无核双凹形盘样细胞。血红蛋白是含有用于氧的四个结合位点的四肽。贫血指的是存在当特征在于红细胞比容测定的红细胞数量、血红蛋白量或血液中红细胞压积的低于正常值时的情况。将红细胞比容或″红细胞容积″看作贫血的特别可靠的指标。一般来说，在正常成年人中，女性和男性(在海平面上)的红细胞计数(百万/mm3)、血红蛋白(g/100ml)和红细胞比容或红细胞压积(ml/100ml)的平均值为4.8±0.6和5.4±0.9、14.0±2.0和16.0±2.0以及42.0±5.0和47.0±5.0，正如《Harrison内科学原理》(Harrison′s Principles of Internal Medicine)第8版，Appendix-表A-5，McGraw Hill(1977)中所述。在正常人中，红细胞由骨髓产生且释放在循环中，其中它们可以存活约120天。它们随后被单核细胞-吞噬细胞系统除去。
贫血是不同疾病和疾患的症状。因此，可以根据病因学对贫血分类。例如，再生障碍性贫血的特征在于缺乏红细胞再生且对治疗有抗性。在这类患者中，存在骨髓样细胞、红细胞系和血小板生成干细胞群明显下降，导致各类血细胞减少。溶血性贫血因红细胞存活期缩短和骨髓不能补偿其生存期减少所致。它可能是遗传性的或可能因化疗、感染或自身免疫过程所致。缺铁性贫血指的是特征在于低铁储存或没有铁储存、低血清铁浓度、低血红蛋白浓度或红细胞比容等的贫血形式。铁缺乏是最常见的贫血原因。最常见影响成年人的恶性贫血因胃粘膜无法分泌足够的内因子而导致维生素B12吸收不良所致。镰状细胞性贫血因遗传上确定的血红蛋白合成缺陷所致。其特征在于血液中存在镰形的红细胞。上述情况仅是对医学而言已知的许多不同贫血中的典型。然而，在本发明的上下文中，特别关注解决与治疗癌症中使用化疗或放疗相关的贫血。
按照《今日生物世界》(BioWorld Today)(第4页；2002年7月23日)中公开的陈述，今年在美国有约120万癌症患者进行细胞毒性化疗且他们中约800,000或67％发生贫血。另外，贫血还与需要定期透析或肾移植才能存活的患者的肾病晚期有关。这属于慢性肾衰竭或存在渐进且通常为不可逆的肾功能衰退的临床情况范围。
红细胞生成素(EPO)是肾脏中产生的分子量为34,000的糖蛋白。EPO刺激骨髓中定型的红细胞系造血祖细胞的分裂和分化(BFU-E细胞)并维持细胞存活力(抑制BFU-E和CFU-E细胞的编程性细胞死亡)。EPO的生物作用是受体介导的。在不同动物中氨基酸的同一性在人EPO与猴子EPO之间为92％且在人EPO与小鼠EPO之间为80％。EPO生物合成的主要刺激为组织低氧。然而，正如从上述观察到的，EPO具有治疗某些贫血的显著治疗潜能。例如EPO可以用于治疗因内源性EPO产生减少导致的贫血，所述的内源性EPO产生减少可能因肾损伤或肾脏无功能所致(例如如上所述的慢性肾衰竭)。另一方面，EPO可以用于治疗因骨髓损伤和随后的祖红细胞细胞(例如BFU-E细胞)增殖下降所致的贫血，所述的祖红细胞细胞(例如BFU-E细胞)增殖下降可能因使用细胞毒性化疗或放疗治疗癌症患者所致(也如上所述)。各种形式的重组EPO可以从市售得到。它们在用于其制备的表达系统及其位点和蛋白质糖基化程度方面不同。α型红细胞生成素在CHO细胞中得到表达且购自商品名Procrit、Epogen或Eprex。如EPO，α型红细胞生成素在天冬酰胺(Asn)残基上带有三个N-连接的糖基化位点Asn 19、Asn 33和Asn 78。β型红细胞生成素在三个位点上N-糖基化，而ω型红细胞生成素在Asn 24、Asn 28、Asn 83上N-糖基化且部分在丝氨酸(Ser 126)上O-糖基化。近来，已经证实过度糖基化形式的EPO含有五个N-连接的糖基化位点。它是购自Aranespe商品名的α型红细胞生成素的缓慢或延长释放形式。这种蛋白质因其血清半衰期延长约3-倍而与天然形式相比表现出增强的生物活性。然而，这些糖基化蛋白质的应用是昂贵的和受限的，因为必须通过重组技术生产它们。如果对患者″化学保护″以防止免疫抑制，那么这类治疗后的改善治疗是不必要的。因此，对减轻因化疗和放疗诱发的骨髓抑制状态的不理想副作用的新组合物和方法存在需求。
发明概述本发明通过提供刺激哺乳动物，包括人体内的造血系统的新方法满足了对化学保护剂的需求。本发明还提供了治疗化疗和放疗引起的骨髓抑制作用和刺激造血系统可以具有治疗价值，但不限于贫血的任意其它情况的新方法。
按照该方法，可以对哺乳动物，特别是人给予显著减少化疗和放疗副作用的有效量的组合物，该组合物包括在药物上可接受载体中的癸酸、辛酸或金属盐(钠、钾、钙、镁)或其甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯类或烷基酯类或其它类似物。
因此，本发明的一个目的是提供使用癸酸、辛酸或金属盐(钠、钾、钙、镁)或其甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯类或烷基酯类或其它类似物的组合物，它们用于生产作为单一活性剂或作为两种或多种活性剂与和/或不与其它和化疗剂或诱导骨髓抑制状态的这类药物组合的化学保护药物组合物。
本发明的另一个目的涉及癸酸、辛酸或钠盐或其甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯类或相关化合物作为血细胞生成刺激因子的应用。
此外，本发明包括含有癸酸、辛酸或钠盐或其甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯类或其它类似物的组合物和这类化合物在治疗骨髓抑制和随后的贫血和免疫抑制中的应用。
本发明的一个目的在于提供对哺乳动物，包括人提供有效化学保护作用的方法。
本发明的另一个目的在于提供有效增加化疗和放疗在哺乳动物，包括人中的功效的方法。
本发明的另一个目的在于提供使用更常用剂量乃至为获得更好治疗有益性而增加化疗组合物剂量，同时避免副作用增加的方法。
本发明的另一个目的在于提供有效减轻或消除哺乳动物，包括人中化疗诱发的贫血的方法。
本发明的另一个目的在于提供治疗因慢性肾衰竭导致的贫血，尤其是患有晚期肾病的患者中的贫血的方法。
本发明的另一个目的在于提供治疗因其它医疗过程，诸如矫形外科或使用诸如AZT这类其它药物导致的贫血的方法。
最后，本发明的另一个目的在于提供使对接受者的不良作用降至最低或没有不良作用的方法。
在综述了如下公开实施方案的详细描述和待批权利要求后，本发明的这些和其它目的、特征和优点显而易见。
发明详述高剂量化疗和放疗破坏了骨髓中的造血细胞。患者随之发生红细胞、血小板和中性白细胞严重耗尽。贫血导致疲劳、缺乏精力和呼吸急促。血小板减少导致凝血时间延长和出血障碍。中性白细胞减少使患者处于感染增加的危险中。骨髓抑制是癌症治疗中的剂量限定因素。
本发明涉及恢复患者造血系统的方法。目前用于该目的的方法利用了细胞因子或糖蛋白生长因子。例如，红细胞生成素可以用于刺激反应性骨髓红细胞系增殖和成熟。如果合适，批准在人体中使用红细胞生成素用于治疗贫血例如因不能产生足量红细胞导致的贫血。然而，存在限制红细胞生成素应用的局限。实际上，这些局限中的许多对重组糖蛋白细胞因子的医学应用而言是常见的-可用性、毒性和功效，尤其是长期应用。例如，用重组人红细胞生成素治疗的某些患者对糖蛋白发生免疫反应，导致纯红细胞发育不良。当后者发生时，对重组蛋白发生的抗体也攻击患者等同或内源性蛋白。患者随之发生比药物治疗前更为恶化的贫血。
可以通过使用带有碳链长为8(C8，辛酸或辛酸)或10(C10，癸酸或癸酸)的脂肪酸酯化甘油制备中链甘油三酯(类)(MCT)。MCT通常为C8和C10脂肪酸甘油酯类的混合物；然而，MCT还可含有少量(各自2±1％)的C6(己酸或己酸)和C12(正十二烷酸或月桂酸)甘油酯类。另一方面，长链甘油三酯(类)(LCT)由具有大于12个原子的碳链长度的脂肪酸酯化的甘油组成。存在于LCT中的典型脂肪酸类包括棕榈酸(C16)和硬脂酸(C18)。不同于MCT，LCT是膳食脂肪的主要成分。实际上，MCT和LCT具有显著不同的生物特性。MCT与LCT之间存在的某些生理差异描述在《Harrison内科学原理》(Harrison′s Principles ofInternal Medicine)第8版，1520-1521(1977)；第15版，1668-1669(2001)中。例如，与LCT相反，MCT不需要通过胰脂肪酶水解，这是因为它们被肠上皮细胞吸收。
MCT及其成分中链脂肪酸类是用于食品和药物工业的无毒性物质。例如Traul，K.A.等(《食品与化学毒理学》(Food and ChemicalToxicology)3879-98，2000)描述了MCT已经用于逐步增加的大量食品和营养品应用，因为它们可以提供超过LCT的许多优势。MCT还主要用作各种人和兽药制剂和化妆品中的乳化剂。他们涉及了大量支持MCT安全性的毒理学研究。例如，他们注意到已经在临床试验中证实了MCT的人膳食消耗安全性至多达1g/kg的水平。C8和C10脂肪酸类具有相似的安全性和应用。例如，在The Mersk Index，第11版，266(1989)中，报导了辛酸具有的LD50(口服，大鼠)＝10.08g/kg，它基本上无毒性。实际上，按照联邦管理法规(CFR)第184部分，美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了辛酸的GRAS(一般认为是安全的)确认。类似地，按照第172部分(CFR)，将游离脂肪酸类(例如癸酸、辛酸)及其金属盐看作用于食品的安全添加剂。正如Dimitrijevic，D.等注意到的(《制药学和药理学杂志》(Journal of Pharmacy andPharmacology)53149-154，2001)，在日本和瑞典批准癸酸(钠盐)在人体应用中作为直肠药物产品的吸收促进剂。美国专利US 4,602,040(1986)中描述了MCT作为药物赋形剂的应用。更近来，PCT公开号WO01/97799中描述了中链脂肪酸类，特别是辛酸和癸酸作为抗菌剂的应用。
然而，直到本文公开的令人意外的发现为止，尚不了解中链脂肪酸类，诸如癸酸、辛酸或金属盐或其单酸甘油酯、二脂酰甘油酯类或甘油三酯类(MCT)或相关化合物在刺激从红细胞系造血祖细胞产生红细胞或红细胞生成中的有效性。正如本文所述的，MCT可以包括C8(辛酸)和C10(癸酸)脂肪酸的甘油三酯类，它们构成了至少98％的涉及刺激造血作用和红细胞生成的活性。前一种活性描述在我们的PCT公开号WO 02/83120中，而在上述文献中并未描述刺激红细胞生成和治疗贫血。实际上，这一发现是完全令人意外的，因为文献中几乎没有报导有关低于糖蛋白的分子量或小分子能够刺激红细胞生成。Wrighton，N.C.等描述了红细胞生成素模拟肽(EMP)的合成二聚化形式(《天然生物技术》(Nature Biotechnology)151261-1265，1997)。尽管明显小于红细胞生成素，但是EMP是在每种单体中含有20个氨基酸的多肽。更重要的是，EMP的活性明显低于红细胞生成素。更近来，PCT公开号WO 02/19963中描述了合成的红细胞生成蛋白(SEP)作为具有红细胞生成素样生物活性的合成稳定多肽。报导的SEP的优点在于它是通过化学合成而非通过相对更昂贵的重组技术制备的稳定的相对长半衰期的分子。通过引入乙二醇单元(例如PEG)获得稳定且由此可以将附加水平的复杂性引入SEP制剂。总之，现有技术中教导了刺激红细胞产生需要应用较大的多肽或蛋白质分子。
本发明涉及中链脂肪酸类或其金属盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯、二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT组合物作为红细胞生成活化或生长因子，且它具体地说作为祖红细胞细胞产生刺激剂的应用。当用于化疗和放疗时，在治疗前、过程中和/或之后给予中链脂肪酸类或其金属盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯或其它类似物或MCT以缩短贫血期限并加速造血系统补充。此外，能够在使用化疗和放疗的多点处(例如在治疗前使用脂肪酸和之后使用MCT)使用中链脂肪酸类与其金属盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯或其它类似物和/或MCT的组合。另一方面，能够在使用化疗和放疗之前、过程中和/或之后同时给予该组合。在因EPO产生减少导致的严重贫血中，中链脂肪酸类或其金属盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯或其它类似物或MCT用作治疗剂。还可以在骨髓移植后使用中链脂肪酸类或其金属盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯或二脂酰甘油酯或其它类似物或MCT以便刺激骨髓干细胞，由此缩短从贫血中恢复的时间期限。
本文所用的″中链脂肪酸类，诸如癸酸或辛酸或其金属盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT组合物″指的是包括所述活性组分和一种或多种药物上可接受的载体的组合物。
本文所用的术语″药物上可接受的载体″指的是不会干扰中链脂肪酸类，诸如癸酸或辛酸或其金属盐或甘油三酯类其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT组合物的生理作用且对哺乳动物，包括人无毒性的物质。
可以使用癸酸或辛酸或其盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT和药物上可接受的载体通过本领域技术人员公知的方法配制本发明的癸酸或辛酸或其盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT组合物(MerckIndex，Merck & Co.，Rahway，NJ)。这些组合物包括，但不限于固体、液体、油、乳剂、凝胶、气溶胶、吸入剂、胶囊、丸剂、贴剂和栓剂。
所有方法均包括是使活性组分与构成一种或多种辅助组分的载体混合的步骤。
本文所用的术语″化疗″指的是使用细胞毒性剂杀伤增殖细胞的过程。术语″化疗过程中″指的是给予细胞毒性剂的作用持续的期限。另一方面，术语″化疗后″用以包括给予细胞毒性剂后给予组合物的所有情况而与给予的细胞毒性剂的作用持久性无关。
当将本发明的方法应用于化疗时，可以在化疗前、过程中或之后(即给予细胞毒性剂前、过程中或之后)给予癸酸或辛酸或其盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT组合物。
所谓″细胞毒性剂″是指杀伤显著增殖的细胞的活性剂，所述显著增殖的细胞例如为肿瘤细胞、病毒感染的细胞或造血细胞。可以用于实施本发明的细胞毒性剂的实例包括，但不限于环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、长春碱、长春新碱、博来霉素、依托泊苷、托泊替康、伊立替康、泰索帝、泰素、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他滨、顺铂、卡铂或苯丁酸氮芥和任意上述化合物的激动剂。细胞毒性剂还可以为抗病毒药例如AZT(即3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷)或3TC/拉米夫定(即3-硫胞苷)。
本文所用的术语″化学保护″指的是为防止哺乳动物发生因使用化疗剂治疗哺乳动物产生的毒性作用的保护作用。最常见的是，化疗剂是细胞毒性剂，其治疗作用因干扰或抑制DNA复制、RNA转录或随后的蛋白质翻译的某些方面的能力而产生。因此，化学保护剂指的是对哺乳动物给予的防止哺乳动物发生因使用化疗剂治疗哺乳动物产生的毒性作用或有利于动物恢复的任意化合物。
可以诊断贫血且其严重程度可以由本领域技术人员确定。术语″贫血″可以指当发生红细胞数量、血红蛋白量或红细胞压积低于正常值的减少时存在的情况。这类临床标准可变。不受限制，贫血可以是循环红细胞量减少的结果。还可以由本领域技术人员确定治疗功效。可以提供治标效应。
在一个优选的实施方案中，所述的药物组合物为任意合适的用于治疗贫血的口服、舌下、直肠、局部给药或吸入(鼻腔喷雾)、肌内、真皮内、皮下或静脉内给药的组合物形式。
可以理解用于治疗所需的本发明组合物的量将根据给药途径、所治疗疾病的性质、患者年龄和情况的不同而改变且最终由参与的临床医师决定。所需剂量通常可以以单剂量或作为在合适的间隔采用的分次剂量提供，例如根据需要每天两次、三次或三次以上以进行或开始治疗。术语″治疗(treatment)″或″治疗(treating)″包括对哺乳动物中存在的疾病或疾患的任意疗法和预防所述疾病或疾患(例如贫血)。包括(a)预防可能易感疾病但尚未诊断为患有该病的患者发生疾病或疾患；(b)抑制或阻止疾病或疾患发展；和(c)通过使一种或多种症状消退或改善缓解疾病或疾患。
尽管为用于治疗，可以将中链脂肪酸类或其金属盐或甘油三酯类其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT作为原料给药，但是优选将所述的活性药物组分制成药物制剂或组合物。通过混入任意常用的赋形剂制成无毒性组合物，诸如，但不限于甘露糖醇、乳糖、海藻糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、纤维素、羧甲基纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、甘油、碳酸镁、柠檬酸钠、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠和甘氨酸。
在本发明优选的实施方案中，活性组分给药量使得在血液中的浓度(游离和/或与血清清蛋白结合的)大于1μm。在其它实施方案中，在血液中的浓度可以大于1mM。在本发明另一个优选的实施方案中，有必要达到足够的活性药物组分局部浓度以获得在靶组织(例如骨髓)中的生物或医疗显著作用。至少在靶组织上需要相对高浓度的活性药物组分，因为必需使本发明癸酸或辛酸或其盐或甘油三酯类或其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT组合物形成胶束或聚集物结构以引起生物反应。单剂量可以由约1g-约10g(及其任意中间范围)的活性组分总量组成。
在另一个实施方案中，所述的药物组合物可以为适合于肠内、粘膜(包括舌下、肺和直肠)或非肠道(包括肌内、真皮内、皮下和静脉内)给药的形式。如果合适，可以将制剂便利地制成分散剂量单位且可以通过任意制药领域众所周知的方法制备。所有方法均包括将活性药物组分与液体载体或固体载体细粉或它们两者紧密混合且然后如果必要使形成所需形式的步骤。如果需要，可以使用适合于使活性药物组分缓释的上述制剂。本领域众所周知的缓释制剂包括使用脂质体、生物相容性聚合物、快速浓注或连续输注。
还可以将中链脂肪酸类或其金属盐或甘油三酯类其单酸甘油酯类或二脂酰甘油酯类或其它类似物或MCT与其它治疗活性剂，诸如细胞毒性抗癌药或其它抗癌药(免疫调制或调节药或治疗疫苗或抗血管生成药等)或免疫抑制药(包括消炎药)联用。可以依次或同时在单独或组合的药物制剂中给予这类组合中的各个成分。可以将上述涉及的这种组合呈药物制剂的所用形式且由此本发明的另一个方面包括了含有上述定义的组合及其药物上可接受的载体的药物制剂。
具体实施例方式
实施例下面进一步解释本发明的实施，但不用来限定本发明。
实施例1化学保护研究MCT对免疫细胞增殖或保护的体内诱导通过用在第0天时静脉内给予200mg/kg环磷酰胺(CY)或80mg/kg 5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗使6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠免疫抑制。为了检验MCT或其它化合物的免疫保护作用，在使用所述化合物的第0天的前3天、前2天和1前1天时经口服预治疗小鼠。在第5天时通过心脏穿刺和脱颈椎处死小鼠。然后记录股骨(作为骨髓细胞来源)的总体病理观察结果。
表1表示了在有化合物存在或没有化合物存在下在环磷酰胺免疫抑制动物中获得的股骨总体病理观察结果。结果证实正常小鼠的股骨具有鲜红的颜色，表明定向造血干细胞及其子代的增殖状态。当使用环磷酰胺治疗时，骨髓的造血细胞贫耗且具有透明的″白色″外观，表明来源于骨髓的定向造血干细胞增殖受到抑制。然而，在细胞毒性诱导的免疫抑制情况下，添加MCT、辛酸甘油酯、癸酸甘油酯、癸酸或癸酸钠使环磷酰胺的作用逆转。这使股骨产生红色外观，表明定向造血干细胞，特别是红细胞群扩充。当用5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导免疫抑制时，观察到了相同结果。
表1环磷酰胺(CY)、CY+MCT、CY+辛酸甘油酯、CY+癸酸甘油酯、CY+癸酸和CY+癸酸钠对来自股骨的骨髓外观的作用总体病理观察结果。

实施例2化学保护研究免疫细胞增殖或保护的体内诱导癸酸甘油酯、癸酸和癸酸钠的比较按照实施例1中所述的方案进行癸酸甘油酯、癸酸和癸酸钠对体内免疫细胞增殖或保护的诱导的作用。在处死动物后，将组织在PBS缓冲液中搅碎并用血细胞计数器对细胞进行计数。
通过在环磷酰胺治疗小鼠中使用癸酸甘油酯、癸酸或癸酸钠口服预治疗观察到脾红细胞计数显著增加(附

图1)。此外，与未免疫抑制的动物(对照组)相比，某些治疗的动物在脾红细胞计数方面恢复到了″基线水平″。
实施例3化学保护研究免疫细胞增殖或保护的体内诱导癸酸钠的口服和静脉内剂量反应按照实施例1中所述的方案进行口服和静脉内给予癸酸钠对体内免疫细胞增殖或保护的诱导的作用。在处死动物后，将组织在PBS缓冲液中搅碎并用血细胞计数器对细胞进行计数。通过在环磷酰胺治疗小鼠中使用癸酸钠口服和静脉内给药预治疗观察到脾红细胞增殖计数显著增加(附图2)。此外，静脉内给予癸酸钠使脾红细胞计数增加到了对照组小鼠(未免疫抑制)的″基线水平″。
实施例4化学保护研究红细胞增殖或再生的体内诱导与GM-CSF比较按照实施例1中所述的方案进行口服和静脉内给予癸酸钠和GM-CSF对体内免疫细胞增殖或保护的诱导的作用。在处死动物后，将组织在PBS缓冲液中搅碎并用血细胞计数器对细胞进行计数。通过在环磷酰胺治疗小鼠中使用癸酸钠和GM-CSF(高浓度，1μg/kg)观察到骨髓红细胞计数显著增加(附图3)。此外，当与GM-CSF联用时，发生骨髓红细胞计数累积性增加。
另外，当单独使用癸酸钠时，它能够诱导如附图4中所示的外周血细胞数量显著增加。
实施例5贫血模型癸酸钠对骨髓集落形成单位(CFU)增殖/分化或保护的离体诱导为了检验癸酸钠在贫血模型中的免疫保护或免疫恢复作用，使用化合物在前3天、前2天和前1天经静脉内预治疗BALB/c小鼠。通过用在第0天对6-8周龄雌性BALB/c小鼠经腹膜内给予60mg/kg苯肼来诱发贫血。在第6天时通过心脏穿刺和脱颈椎处死小鼠。然后从股骨中获取骨髓细胞。用PBS冲洗和洗涤细胞。基于活细胞计数，以5×105个细胞/ml的浓度将细胞重新悬浮于补充了2％FBS的IMDM培养基中。将来自这些细胞的两个一式两份的3×104个细胞/平皿平板接种在Methocult培养基中，使得可以进行集落形成单位(CFU)形成试验。在2-3天培养后记录CFU-E和BFU-E。14-16天培养后记录CFU-GM和CFU-GEMM。
正如附图5中解释的，癸酸钠增加了正常小鼠的CFU-E和CFU-GEMM数量。在苯肼诱发的贫血小鼠中，癸酸钠诱导CFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM显著增加。
实施例6癸酸甘油酯和辛酸甘油酯增加体外人骨髓细胞的增殖骨髓细胞获自癌症患者的胸骨。用PBS洗涤细胞并以2×106个细胞/ml的浓度重新悬浮。将细胞在37℃下和有或没有癸酸甘油酯或辛酸甘油酯存在下的RPMI/FBS培养基中培养48-72小时。温育后，用1μCi的[3H]-胸苷将细胞脉冲6小时。用Tomtec收集平板并用Microbeta β-计数器计数。DNA中掺入[3H]-胸苷是细胞增殖中的直接指示。
附图6表示癸酸甘油酯对骨髓增殖的作用的典型实验。与对照组相比癸酸甘油酯将骨髓增殖增加了3-4倍。此外，当与红细胞生成素(EPO)联用时，分别在48和72小时时出现骨髓增殖的累积或协同增加。
附图7表示辛酸甘油酯对骨髓增殖作用的典型实验。与对照组相比辛酸甘油酯将骨髓增殖增加了2倍。此外，当与红细胞生成素(EPO)联用时，出现骨髓增殖的协同增加。
实施例7癸酸甘油酯增加体外人骨髓BFU-E(祖红细胞细胞)集落形成和CFU-GEMM增殖骨髓细胞获自不同癌症患者的胸骨。用PBS洗涤细胞并以2×106个细胞/ml的浓度重新悬浮。将细胞在37℃下和有或没有癸酸甘油酯存在下的RPMI/FBS或Myelocult(干细胞技术，Vancouver)/FBS培养基中培养5天。温育后，收集、洗涤并计数细胞。基于活细胞计数将细胞以5×105个细胞/ml的浓度重新悬浮于补充了2％FBS的IMDM培养基中。将来自这些细胞的四个一式两份的2.5×104个细胞/平皿平板接种在Methocult培养基中，使得可以进行集落形成单位(CFU)形成试验。在14-16天培养后记录CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E。
表2和3表示癸酸甘油酯对RPMI/FBS培养基中骨髓细胞集落形成的作用的两次实验。癸酸甘油酯的存在增加了CFU-GEMM数量(达3倍)和BFU-E集落形成(达13倍)。后一种细胞是红细胞的先祖细胞。
表4和5表示证实癸酸甘油酯对Myelocult/FBS培养基中骨髓集落形成的作用的两次实验，所述的Myelocult/FBS培养基是更富集的培养基(补充了其它生长因子)。癸酸甘油酯的存在增加了CFU-GEMM数量(达2倍)和BFU-E集落形成(达6倍)，它们是红细胞的先祖细胞。
表2癸酸甘油酯对体外在RPMI/FBS培养基中培养的人定向造血干细胞(CFU形成)的作用

表3癸酸甘油酯对体外在RPMI/FBS培养基中培养的人定向造血干细胞(CFU形成)的作用

表4癸酸甘油酯对体外在Myelocult/FBS培养基中培养的人定向造血干细胞(CFU形成)的作用

表5癸酸甘油酯对体外在Myelocult/FBS培养基中培养的人定向造血干细胞(CFU形成)的作用

*CFC＝琼脂集落生成细胞
权利要求
1.包括通式I、II、IIa、III和IIIa的化合物或其组合的组合物在制备用于刺激红细胞生成的药物中的应用 R1-CO-OR2II(R1-CO-O)kMIIaR1-Z-SO2-OR2III(R1-Z-SO2-O)kMIIIa其中R1各自独立为C7-11烷基；A和B独立为H或CO-R1；R2为H或C1-4烷基；M为金属一价阳离子(k＝1)或二价阳离子(k＝2)；Y为O或NH；且Z为O、NH、CH2O或键。
2.权利要求1的应用，其中所述的组合物包括至少两种通式I的化合物，它们为中链甘油三酯类(MCT)，其中R1各自为直链或支链饱和或不饱和C7或C9烷基。
3.权利要求2的应用，其中所述的混合物包括带有R1各自为CH3(CH2)8-的第一种MCT。
4.权利要求2或权利要求3的应用，其中所述的组合物进一步包括各自为0.1％-3％的第三种通式I的化合物，其中R1各自为CH3(CH2)4-；和第四种通式I的化合物，其中R1各自为CH3(CH2)10-。
5.权利要求2的应用，其中所述的混合物包括由如下结构式所述的C8和C10脂肪酸甘油三酯类的四种几何异构体
6.权利要求1的应用，其中所述的组合物包括通式II的化合物，它带有的R2为氢且为中链脂肪酸。
7.权利要求1的应用，其中所述的组合物包括通式III的化合物，它带有的R2为氢。
8.权利要求1的应用，其中所述的组合物包括通式IIa的化合物且其中M为选自钙、镁、钾和钠的金属抗衡离子。
9.权利要求1的应用，其中所述的组合物包括通式IIIa的化合物且其中M为选自钙、镁、钾和钠的金属抗衡离子。
10.任意上述权利要求的应用，其中所述的组合物包括辛酸或癸酸.
11.任意上述权利要求的应用，其中所述的组合物包括辛酸钠或癸酸钠。
12.任意上述权利要求的应用，其中所述的组合物包括辛酸钠或癸酸钙。
13.任意上述权利要求的应用，其中所述的组合物包括辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯。
14.任意上述权利要求的应用，其中至少一种化合物的存在量使得它在血液中的浓度大于1μM。
15.任意上述权利要求的应用，其中所述的组合物进一步包括人红细胞生成素。
16.任意上述权利要求的应用，用于治疗因化疗导致的贫血。
17.任意权利要求1-15中的应用，用于治疗因放疗导致的贫血。
18.任意权利要求1-15中的应用，用于治疗慢性贫血。
19.任意权利要求1-15中的应用，用于治疗暂时性贫血。
20.任意权利要求1-15中的应用，用于治疗因慢性肾衰竭导致的贫血。
21.任意权利要求1-15中的应用，用于治疗因晚期肾疾病导致的贫血。
22.任意权利要求1-15中的应用，用于治疗药物诱发的贫血。
23.任意权利要求1-15中的应用，用于治疗因医疗或外科手术导致的贫血。
24.任意权利要求1-15中的应用，用于增加哺乳动物体内的红细胞产生。
25.任意权利要求1-15中的应用，用于增加哺乳动物体内的血红蛋白产生。
26.任意权利要求1-15中的应用，用于增加哺乳动物红细胞比容。
27.任意权利要求1-15中的应用，用于增加哺乳动物体内的红细胞系造血祖细胞产生。
28.任意权利要求1-15中所述的组合物，用于治疗应用。
29.包括如权利要求1-14中任一项定义的任意通式I、II、IIa、III和IIIa中的至少一种化合物和人红细胞生成素的产品，作为用于疗法中分别、同时或依次应用的联用制剂。
全文摘要
包括通式I、II、IIa、III和IIIa任一项的化合物或其组合的组合物在制备用于刺激红细胞生成的药物中的应用，其中R
文档编号A61K31/20GK1753665SQ200480004978
公开日2006年3月29日 申请日期2004年2月6日 优先权日2003年2月7日
发明者C·宾尼, L·加农, P·劳伦, B·扎克利 申请人:普罗米蒂克生物科学公司