专利名称：光敏剂和噬菌体的轭合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有光敏剂和噬菌体(bacteriophage)的轭合物的组合物，特别是被认为是葡萄球菌噬菌体(staphylophage)的葡萄球菌的噬菌体。本发明还涉及所述轭合物在感染性疾病的光动力学治疗的方法中的用途。
背景技术：
由于许多种病原细菌的抗生素耐药性的快速显现，对抗细菌感染的抗菌剂的作用日益变得无效。这种病原体之一是金黄色葡萄球菌(S.aureus)，它的特性是引起诸如疖、痈、脓疱病的皮肤感染，以及痤疮、烧伤和伤口的感染。如果感染有机体是毒性菌株，那么例如感染或集落化的棉塞可以产生被认为是中毒性休克综合征的有生命威胁的毒血症。有机体也可以从这些感染或者从诸如静脉导管的外来物中进入血流，并引起诸如心内膜炎、骨髓炎、脑膜炎和肺炎的这些其它位置的感染。
许多细菌能够导致皮肤和伤口的感染，例如，凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、链球菌(streptococci)、棒状杆菌属(corynebacterium spp.)、大肠杆菌(E.coli)、产气克雷伯杆菌(Klebsiella aerogenes)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、绿浓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和消化链球菌属(Peptostreptococcusspp.)。这些细菌日益显示出对抗生素治疗的耐药性。
特别地，金黄色葡萄球菌的耐药菌株已经出现。在1961年第一次报告了甲氧苯青霉素(Methicillin)耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)(Jevons，M.(1961)British Medical Journal，1，124-5)，现在这些菌株成为全世界医院获得性感染的主要原因，并在很多护理和居住地中流行。其引起了明显的感染，并且每年在英国有数百病人的发病率，这对卫生保健是一种令人担忧的挑战(Ayliffe等，J Hosp Infect(1988)，39，253-90)。
自从第一次报告了MRSA，已经证明这些有机体已经对很多种抗菌剂产生耐药性，这些抗菌剂包括红霉素、氨基糖苷类、四环素类、三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺类和氯霉素。MRSA菌株已经发展为仅仅对单种临床提供的抗生素敏感了诸如万古霉素(vancomycin)和替考拉宁(teicoplanin)的糖肽类。但是，抗药性发展至此，现在已经报告有对万古霉素有耐药性的菌株(Hiramatsu，K.(1998)，American Journal ofMedicine，104，7S-10S)。这些菌株被称为VRSA(耐万古霉素的金黄色葡萄球菌)和异-VRSA(暴露在高水平的万古霉素后而产生的耐药性菌株)。目前，对MRSA感染的病人的处理通常包括抗菌剂的给药，但情况仍然是，有发展为对许多所使用的药剂的耐药性的证据。
由于对所有现有的抗菌素基本耐药的菌株的出现，MRSA现在已成为健康的严重威胁。目前，术语MRSA本身更精确地用在甲氧苯青霉素和多种抗菌素耐药的金黄色葡萄球菌。
已经发现某些MRSA菌株不仅在医院内部而且在医院之间迅速传播。这些菌株已经被称为流行性MRSA(EMRSA)。自从1981年报告了第一株EMRSA菌株(EMRSA-1)以来，已经鉴别出17种不同的EMRSA，它们全部都对多种抗菌素具有耐药性。最近，两种最流行的菌株是EMRSA-15和EMRSA-16，它们占已报告的30000种MRSA分离菌的60-70％(Livermore，D(2000)Int.J.Antimicrobial Agents，16，S3-S10)。重要的是，MRSA菌株(被称为社区获得的MRSA(CA-MRSA))已经开始在社区中传播，即，在非就医的个体之间。
从以上所述，很显然，迫切需要对抗细菌感染，特别是MRSA感染的替代方法。
一种方法是使用光活性剂获得使有机体致死的光敏作用。这涉及用可光活化的化学药品(光敏剂)处理有机体，在适合波长的光的照射下，该化学药品会产生引起溶菌作用的细胞毒性物质。在体外使用甲苯胺蓝O(TBO)和二磺酸铝酞菁(AlPcS2)作为光敏剂，这种技术已经用于达到杀灭广谱的包括金黄色葡萄球菌和MRSA的细菌。光敏剂和激光都不能单独起到杀菌的作用(Wilson等，(1994)J AntimicrobChemother 33，619-24)。在随后的研究中，已经发现16株EMRSA菌株在AlPcS2的存在下容易被低剂量的红光(674nm)杀灭(Griffiths等，(1997)J Antimicrob Chemother，40，873-6)。在更高的光照剂量下，可达到100％杀灭。
光动力学治疗(PDT)是这种方法在疾病治疗中的应用。它是治疗肿瘤中确立的程序并成为消毒血液产品手段的基础。现在，已经评价了PDT对治疗感染的应用。例如，与氩激光器联合的血卟啉已经用于治疗多种神经外科手术后感染和脑脓肿(Lombard等，(1985)，肿瘤与其它疾病的光动力治疗(Photodynamic Therapy of Tumours and otherDiseases)，Jori & Perria出版)。一个有关于感染性疾病的PDT的潜在的问题是它缺乏特异性。因此，如果宿主细胞以及目标有机体同时结合或摄取光敏剂，接下来的照射也可以导致宿主细胞的死亡。克服这种问题的一种方法是通过使用靶向化合物即任何一种能特异结合到病原体表面的化合物。
已表明，几种靶向化合物当轭合到光敏剂时，它们能够成功地去除细菌的特异菌株。例如，免疫球蛋白G(IgG)已经用于靶向金黄色葡萄球菌蛋白A(Gross等(1997)，Photochemistry and Photobiology，66，872-8)。抗牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)脂多糖的单克隆抗体(Bhatti等(2000)，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，44，2615-8)和抗牙龈卟啉单胞菌与粘放线菌(Actinomyces viscosus)的多聚-L-赖氨酸肽(Soukos等(1998)，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，42，2595-2601)。通过右旋糖苷链轭合到光敏剂锡(IV)绿素e6(SnCe6)的单克隆抗体选择性地杀灭在630nm波长照射的绿浓假单胞菌(P.aeruginosa)，而金黄色葡萄球菌未受影响(Friedberg等(1991)，AnnN Y Acad Sci，618，383-393)。
本发明的发明人已经使用轭合到SnCe6的IgG来靶向EMRSA菌株1、EMRSA菌株3、EMRSA菌株15和EMRSA菌株16(Embleton等(2002)，J Antimicrob Chemother，50，857-864)。与单独使用光敏剂比较，达到了更高水平的杀灭，并且在与血链球菌(Streptococcus sanguis)的混合物中选择性地杀灭EMRSA菌株。IgG的局限在于仅能靶向表达蛋白A的金黄色葡萄球菌。因此，亟需能靶向任何金黄色葡萄球菌菌株的选择性的靶向剂。
噬菌体是感染某些细菌的病毒，经常使细菌的细胞溶解并因此引起细胞死亡。噬菌体已被客观地建议用作抗菌剂。但是，在金黄色葡萄球菌疾病的治疗中使用葡萄球菌的噬菌体(称为葡萄球菌噬菌体)的一个问题是他们限制了宿主的范围。尽管有能溶解许多种金黄色葡萄球菌菌株的多价抗菌素，可是其它的菌株还是有耐药性，因此单独的噬菌体并不能提供杀灭所有金黄色葡萄球菌菌株的有效方法。
已知，尽管一些噬菌体仅仅杀灭有限范围的细菌，可它们会结合较广谱的细菌。本发明人现在已经发现一些噬菌体可以用作光敏剂的有效的靶向传输系统。
本发明人已经发现当将噬菌体连接到光敏剂时，用合适波长的光照射时，所形成的光敏剂-噬菌体轭合物会高效地杀灭细菌。
噬菌体-光敏剂轭合物能被用来治疗或预防很广范围的皮肤和伤口的细菌感染。最常见的从皮肤和伤口感染分离的有机体有凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，链球菌，例如化脓性链球菌(Streptoccocus pyogenes)、棒状杆菌属、大肠杆菌、产气克雷伯杆菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、痤疮丙酸杆菌、杆菌属、绿浓假单胞菌和消化链球菌属。
特别地，光敏剂和葡萄球菌噬菌体轭合物可以用于抗葡萄球菌属(Staphylococci spp.)的菌株的光动力学治疗的方法，特别是抗MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA和CA-MRSA。
本发明提供了组合物，其包括连接到噬菌体而形成光敏剂-噬菌体轭合物的光敏化合物(光敏剂)。该噬菌体可以是葡萄球菌的噬菌体，并且优选是能结合到金黄色葡萄球菌，特别是MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA或CA-MRSA的葡萄球菌噬菌体。所述组合物可以用在光动力学治疗的方法中。
所述噬菌体优选使用共价键连接到所述光敏剂，该光敏剂和/或该噬菌体包含或可以被修饰为包含利用化学或光反应试剂共价交联的基团，从而产生交联键，例如硫醇-硫醇交联、胺-胺交联、胺-硫醇交联、胺-羧酸交联、硫醇-羧酸交联、羟基-羧酸交联、羟基-硫醇交联以及它们的组合的交联键。
所述光敏剂可合适地选自卟啉(例如血卟啉衍生物、次卟啉)、酞菁(例如锌、硅和铝酞菁)、绿素类(例如锡绿素e6、锡绿素e6的多聚赖氨酸衍生物、间-四羟基苯绿素、苯并卟啉衍生物、锡本紫红素)、菌绿素类、吩噻嗪类(例如甲苯胺蓝、亚甲蓝、二甲基亚甲蓝)、吩嗪(例如中性红)、吖啶类(例如吖啶黄、原黄素、吖啶橙、氨吖啶)、德卟啉类、花菁类(例如部花菁540(merocyanine 540))、蒽环类(例如阿霉素和表阿霉素)、脱镁叶绿甲脂酸类、sapphyrins类(五齿芳香族大环类)、富勒烯、卤化咕吨类(例如孟加拉玫瑰红)、苝醌颜料(例如金丝桃菌、竹红菌素)、gilvocarcins类、叔噻吩类、苯并菲啶类、补骨脂素类和核黄素类。
本发明使用上述轭合物杀灭细菌，为了获得更有效地抗特定感染细菌的轭合物，可以根据欲杀灭的特定有机体来选择用于轭合物的噬菌体。在优选的实施方案中，感染细菌是MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA或CA-MRSA，并且轭合物包括葡萄球菌的噬菌体75或噬菌体φ11。
尽管有更多的实施例，但下面的表1仅示出了一些细菌-噬菌体配对的例子。更为新型的噬菌体可以被分离和/或用于目标细菌。可以通过使用单价噬菌体、多价噬菌体或者单价噬菌体的组合或者单价与多价噬菌体的组合，按照需要改变治疗的特异性。
表1
本发明的组合物合适地含有至少0.01μg/ml的光敏剂，优选至少0.02μg/ml，更优选至少0.05μg/ml直至200μg/ml，优选最高至100μg/ml，更优选最高至50μg/ml。所述组合物中所述噬菌体的合适的量为1×105-1×1010pfu，优选为1×106-1×109pfu，更优选1×106-1×108pfu。
本发明的组合物还包含二价离子源，例如Ca2+或Mg2+，优选Ca2+。例子包括氯化钙、碳酸钙和氯化镁，所述离子合适的含量为5-200mM，优选5-15mM，更优选约10mM。
所述组合物还可以包含一种或多种选自缓冲剂、调节渗透压的盐、抗氧化剂、防腐剂、胶凝剂和再矿化剂的成分。
本发明进一步提供了杀灭细菌的方法，其包括，(a)用本发明的组合物接触欲处理的区域，以至于在所述区域的任何细菌结合到所述光敏剂-噬菌体轭合物；和(b)用能被光敏剂吸收的波长的光照射所述区域。
合适的细菌在上述表1中列出，优选金黄色葡萄球菌，更优选MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA或CA-MRSA。
在本发明的方法中，可以使用任何发射适当波长的光源。选择光的波长相应于所述光敏剂的吸收最大值并且具有有效的能量来活化该光敏剂。所述光源可以是能产生单色或多色光的任何设备或生物系统。例子包括激光、发光二极管、弧光灯、卤素灯、白炽灯或生物发光或化学发光的发射器。在某种环境下，太阳光也可以是合适的。优选地，由所述光源发射的光波长可以为200-1060nm，优选400-750nm。合适的激光可以有1-100mW的功率并且光束直径为1-10mm。用于激光照射的合适的激光的光剂量为5-333Jcm-2，优选5-30Jcm-2。对于白光照射，合适的剂量为0.01-100kJ/cm2，优选0.1-20kJ/cm2，更优选3-10kJ/cm2，合适的照射持续时间为1秒-15分钟，优选1-5分钟。
以下光源可以合适地用于本发明氦氖(HeNe)气体激光器(633nm)氩激发染料激光器(500-700nm，5W输出)铜蒸汽激发染料激光器(600-800nm)受激准分子激发染料激光器(400-700nm)金蒸汽激光器(628nm，10W输出)可调固态激光器(532-1060nm)，包括Sd:YAG发光二极管(LED)(400-800nm)二极管激光器(630-850nm，25W输出)，例如镓硒砷化物钨丝灯卤素冷光源荧光灯。
在本发明的方法中，所述组合物合适在药物可接受的含水载体中呈溶液或悬浮液的形式，但也可以为诸如粉末或凝胶，软膏或乳剂的固态。所述组合物可以通过搽擦、撒、喷雾或其它常用技术用于感染区域。
本发明进一步提供所述组合物用于治疗人体或动物体的用途，该组合物适当地提供了在治疗由细菌感染引发的状态的用途，特别是被葡萄球菌所感染，更特别是被MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA或CA-MRSA所感染。
本发明可以用于治疗细菌感染，特别是被葡萄球菌所感染，更特别是被MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA或CA-MRSA所感染，从而可以治疗或预防诸如疖、痈、乳腺炎和脓疱病的皮肤感染，可以治疗或预防痤疮、烧伤或伤口的感染，或者可以治疗或预防起因于细菌感染的心内膜炎、骨髓炎、脑膜炎和肺炎，可以治疗或预防由于使用导管、植入物或其它医疗设备所引起的感染，或者可以预防手术后例如剖腹产的感染。
本发明也可以用于预防通过载体的细菌的传输，该载体本身，如果有，几乎不出现症状。
图1显示了噬菌体75-SnCe6轭合物对不同的EMRSA菌株的效果。
图2显示了轭合物、非轭合物、仅有光敏剂或仅有噬菌体且存在或没有照射对EMRSA-16和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的效果。
图3至图5显示了本发明改变光剂量对EMRSA-16和金黄色葡萄球菌8325-4的效果。
图6显示了使用固定浓度的φ11-SnCe6轭合物时光剂量对EMRSA-16的效果。
图7显示了本发明对于VRSA(Mu3)菌株、异-VRSA(Mu50)和CA-MRSA(MW2)的效果。
图8显示了本发明对于化脓性链球菌的效果。
图9显示了本发明对于痤疮丙酸杆菌的效果。
实施例材料和方法制备以下培养液营养肉汤2(NB2)培养液通过将25g营养肉汤2(Nutrient Broth 2)(Oxoid)(10.0g/lLab-Lemco粉末，10.0g/l胨，5.0g/l NaCl)加入到1升去离子蒸馏水而制成1升培养液。混合后，该培养液在121℃高压灭菌15分钟。
胰化胨大豆酵母肉汤培养液(TSY)通过将39g胰化胨大豆肉汤(Tryptone Soya Broth)(Oxoid)(17.0g/l酪蛋白胰消化物，3.0g/l豆粕的papaic消化物，2.5g/l葡萄糖，2.5g/l二碱基磷酸钾，5.0g/l NaCl)和0.5％酵母提取物(9.8g/l总氮，5.1g/l氨基氮，0.3g/l NaCl)加入到1升去离子蒸馏水而制成1升培养液，混合后，该培养液在121℃高压灭菌15分钟。
营养肉汤2顶层琼脂将0.35％(w/v)的细菌学琼脂(Agar Bacteriological)(琼脂1号，AgarNo.1，Oxoid)加入到NB2培养液，经过混合，该培养液在121℃高压灭菌15分钟。
营养肉汤2底层琼脂将0.7％(w/v)的细菌学琼脂(Agar Bacteriological)加入到NB2培养液，经过高压灭菌，加入10mM CaCl2(在1升NB2中含10ml 1MCaCl2)。
哥伦比亚血液琼脂(CBA)将37.1g哥伦比亚琼脂基(Columbia Agar Base，Oxoid)(23.0g/l特种胨，1.0g/l淀粉，5.0g/l NaCl，10.0g/l琼脂)加入到1升去离子蒸馏水，高压灭菌后，让液体琼脂在室温中冷却直至可以操作，然后加入5％(v/v)去纤维蛋白的马血液(E &O Laboratories，Scotland)。
甘露醇盐琼脂(MSA)将111g甘露醇盐琼脂(Oxoid)(75.0g/l NaCl，10.0g/l甘露醇，1.0g/lLab-Lemco粉末，10.0g/l胨，0.025g/l酚红，15.0g/l琼脂)加入到1升去离子蒸馏水。
全部混合物在121℃高压灭菌15分钟。然后将液体琼脂倾倒入培养板中，覆盖并冷却过夜。
目标有机体用于实施例中的有机体如下所示，给出了名称和NCTC(英国国家典型培养物保藏中心，National Collection of Type Cultures，UK)或ATCC(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection，USA)的保藏号感染性的甲氧苯青霉素耐药的金黄色葡萄球菌(EMRSA)-1(NCTC11939)(EMRSA)-3(NCTC 13130)(EMRSA)-15(NCTC 13142)(EMRSA)-16(NCTC 13143)Mu3(ATCC 700698)，是一种具有对万古霉素异源耐药性的抗甲氧苯青霉素金黄葡萄球菌(MRSA)菌株，被设计为异源抗万古霉素金黄葡萄球菌(异-VRSA)(Hanaki等(1998)，J.Antimicrob.Chemother.42199-209)Mu50，是典型的VRSA菌株(Hiramatsu等(1997)，J.Antimicrob.Chemother.40135-136)MW2是社区获得的MRSA菌株。社区获得的MRSA菌株(CA-MRSA)在其基因组中的共有葡萄球菌盒染色体mec(staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)IV型，经常是有毒的，并且主要引起皮肤和软组织感染。原型CA-MRSA菌株的基因序列MW2已经显示了附加毒性因子的存在而不是平常地存在于其它的金黄色葡萄球菌菌株(Baba等(2002)，Lancet.25；359(9320)1819-27)。
表皮葡萄球菌(NCTC 11047)化脓性链球菌(ATCC 12202)痤疮丙酸杆菌(ATCC 29399)
金黄色葡萄球菌8324-5(Novick(1967)Virology 33；156-166)通过在CBA上每周的亚培养来维持所有的菌株。
噬菌体噬菌体75(Public Health Laboratory Service，UK)是血清组F葡萄球菌噬菌体，能感染EMRSA-16，EMRSA-3并微弱感染EMRSA-15。
噬菌体φ11(Iandolo et al，(2002)，Gene 289(1-2)；109-118)是一种血清组B的温和噬菌体，φ11是具有低的溶原化作用频率的转导噬菌体。它感染包括很多人和动物病原体的金黄色葡萄球菌细胞溶解组III菌株。
噬菌体繁殖在15ml Falcon试管中加入中指数(mid-exponential)的EMRSA-16(300μl)，将大约105pfu噬菌体75加入到该试管并且让其在室温下培养30分钟使该噬菌体感染所述的细菌。将9ml冷却的熔化的顶层NB2琼脂(含10mMCaCl2)加入到该试管中，然后将混合物倾倒在未干的NB2基质琼脂培养板上，将该培养板在37℃培养过夜。
第二天早晨将含10mMCaCl2的1ml NB2加到每个培养板中，将含液体培养液的顶层琼脂刮入到一个小的离心管中。然后将收集到的琼脂在4℃在15000rpm的离心机中旋转15分钟。收集上清液并通过0.45μm(Nalgene)的过滤器以除去任何细菌细胞。得到的噬菌体75的溶液在4℃下储存。
噬菌体沉淀进行噬菌体沉淀以纯化繁殖后的从NB2培养液得到的噬菌体75。向5ml的NB2中的噬菌体75，加入1.3ml 5M NaCl(1M的最终浓度)和0.2ml 1x磷酸盐缓冲液(PBS)(8.0g/l NaCl，0.2g/l KCl，1.15g/lNa2HPO4，0.2g/l KH2PO4)，并将20％的PEG(聚乙二醇8000，Sigma)加入到该溶液中慢慢搅拌过夜直至完全溶解。然后将该溶液放在冰上过夜然后第二天早上将该溶液在4℃以8000rpm离心20分钟，除去上清液，留下的粒状物再次悬浮在2.5ml 1x PBS，并通过0.45μm的过滤器过滤。
光敏剂所使用的光敏剂是锡(IV)绿素e6(SnCe6)(Frontier Scientific，Lancashire，英国)，在633nm波长有光活性。
轭合物的制备在搅拌下将2mg SnCe6溶解在800μl的活性缓冲液中(0.1MMES(2-(N-吗啉(乙基磺酸)(Sigma))，0.5M NaCl，pH5.5)，制得EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)盐酸碳二亚胺)(Sigma)溶液(1ml活性缓冲液中含4mg)和S-NHS(N-羟磺基琥珀酰亚胺)(Fluka)溶液(250μl活性缓冲液中含2.7mg)。
对溶解的SnCe6，加入200μl溶解的EDC和S-NHS，该混合物在搅拌下在室温放置1至4小时来提供稳定的氨反应中间产物。由于SnCe6是一种光敏试剂，因此用铝箔将该混合物覆盖。通过加入1.4μlβ-巯基乙醇(Sigma)反应终止。
使用1∶1∶2.5摩尔比的SnCe6∶EDC∶S-NHS的反应物进行实验。
通过加入0.7ml 1M NaOH将SnCe6反应混合物的pH值中和到7.0，然后将1.5ml噬菌体加到氨反应溶液中使该噬菌体上的氨基与SnCe6的羧基反应，接着混合4至16小时，该反应用2.5μl的乙醇胺(Sigma)终止。
如以上噬菌体沉淀中所述的，在通过沉淀两次光敏剂-噬菌体轭合物(PS-噬菌体)的轭合作用之后将PS-噬菌体从单体PS中分离，接着针对PBS透析PS-噬菌体。
在以下的实施例中，噬菌体75的浓度是7.3×106pfu/ml，SnCe6/噬菌体-SnCe6的浓度为1.5μg/ml。
激光器所使用的激光器是采用输出功率为35mW的127型Stabilite氦-氖(He-Ne)激光器(Spectra Physics，美国)，激光器以直径1.25mm的平行光束、633nm的波长照射。
实施例1将在中指数生长期的EMRSA-16的培养物稀释到1×107cfu/ml，接着与磁力搅拌棒一起将该已稀释的细菌的几个20μl样品放入96孔培养板(Nunc)的孔中。
将上述制备的100μl噬菌体75-SnCe6轭合物和10mM的最终浓度的氯化钙(CaCl2)加入到该细菌中，将孔中的内容物在室温下伴随搅拌孵育5分钟。通过将100μl 1xPBS加入到细菌中实施为对照，并用作试验样品的参考，试验重复一次。
孵育后，所述孔中的内容物伴随着搅拌直接暴露到相应于能量密度为21J/cm2的激光中5分钟，将铝箔放入周围的孔中使任何泄漏的激光均反射回目标孔中，对照为没有激光照射。
所述激光暴露后，立刻从每个孔中取出100μl的样品，并在1.5mlEppendorf试管中在1ml TSY中从10-1到10-4进行系列稀释，接着将每个稀释液的50μl等分试样放于并展开在一半的CBA培养皿上，该培养皿放置在37℃的培养箱中过夜。第二天早晨计数活存数量，在四组数值间取平均数并乘以适当的稀释系数，并进行绘图分析。
7.3×106pfu/ml的噬菌体1.5μg/ml的SnCe6/噬菌体发现超过99.9％的EMRSA-16被杀灭。
实施例2用EMRSA-1代替EMRSA-16重复实施例1，发现99.98％的细菌被杀灭。
实施例3用EMRSA-3代替EMRSA-16重复实施例1，发现超过99.99％的细菌被杀灭。
实施例4用EMRSA-15代替EMRSA-16重复实施例1，发现超过99.99％的细菌被杀灭。
实施例5用表皮葡萄球菌代替EMRSA-16重复实施例1，发现超过99.99％的细菌被杀灭。
实施例1-5的结果显示在图1中。
实施例6用EMRSA-16和表皮葡萄球菌各10μl代替EMRSA-16的20μl的样品重复实施例1，将样品放在MBA板来上计数。
7.3×106pfu/ml的噬菌体1.5μg/ml的SnCe6/噬菌体2.1J/cm2的激光发现在该混合培养物中超过99.99％的两种细菌菌株被杀灭。
对比实施例首先在没有轭合物且没有进行激光照射，第二用SnCe6光敏剂并且用激光照射，以及第三用噬菌体75且没有进行激光照射，重复实施例。
实施例6和对比实施例的结果如图2所示。
这些实施例显示，所述轭合物高效地杀灭了所试验的所有EMRSA菌株。由于噬菌体75仅能感染EMRSA-15和EMRSA-16，这说明该噬菌体能成功地结合到不能感染的菌株上，因此噬菌体75可作为靶向剂。然后被附着的光敏剂依靠激光照射而影响杀灭细菌。
单独用表皮葡萄球菌和与MRSA的混合物均能获得显著的杀伤，说明该噬菌体也结合到无关的葡萄球菌菌株上。所述噬菌体75-SnCe6轭合物可用于多种葡萄球菌感染。
实施例7使用抗金黄色葡萄球菌的φ11-SnCe6轭合物和激光源的靶向光动力学治疗除了将金黄色葡萄球菌菌株8325-4用作繁殖菌株以外，按照以上噬菌体75所述将噬菌体φ11繁殖并进行沉淀。用上面描述的方法将锡绿素e6(SnCe6)轭合到葡萄球菌噬菌体φ11上，获得了2.3和3.5μgml-1的SnCe6与4.7×107pfu ml-1的噬菌体的结合浓度。接着这些φ11-SnCe6轭合物与多种金黄色葡萄球菌进行孵育并用35mW的HeNe激光器(21J/cm2)以633nm的波长照射5分钟，轭合的SnCe6的最终浓度是1.15μg ml-1。
结果显示，5分钟的照射后，φ11-SnCe6轭合物得到了对金黄色葡萄球菌8325-4(相对于在磷酸盐缓冲溶液中的对照计算)的92.33％的杀灭率，同时相应浓度(1.15μg ml-1)的SnCe6没有获得任何杀灭。结果如图3所示。
我们还证明尽管在严格的最佳的条件下φ11仅能感染有机体(EMRSA-16)的抗甲氧苯青霉素菌株，但这个φ11-SnCe6轭合物可有效地对抗这种菌株，获得了88.11％的杀灭率。对照试验的范围诸如没有光敏剂的光照(L+S-)，没有光照的光敏剂(L-S+)，和1×107pfu ml-1的未共扼的噬菌体(L-S-)，没有产生明显的杀灭。结果如图4所示。
在钙(10mM)的存在下通过增加光剂量到10分钟，使用φ11-SnCe6轭合物(1.75μg ml-1)，我们得到抗金黄色葡萄球菌8325-4的99.88％的杀灭。结果如图5所示。
对于图3至图5，加入光敏剂(或者SnCe6或者φ11-SnCe6)得到1.15μg ml-1(相对于SnCe6)的终浓度。光源是35mW的氦/氖激光器，在图3和图4的情况下照射(使用照射时)5分钟，在图5的情况下照射10分钟。
研究改变光剂量对用SnCe6-噬菌体φ11轭合物获得的杀灭的效果。除了用氦/氖激光器以1分钟、5分钟、10分钟、20分钟和30分钟的不同的时间照射细菌悬浮液外，按照上述方式进行试验。在每种情况下，φ11-SnCe6轭合物的浓度(最终浓度等于3.5μg ml-1的SnCe6)是相同的。
在黑暗中用φ11-SnCe6轭合物对有机体孵育60分钟对活存计数没有明显作用。但是，当φ11-SnCe6轭合物存在下用激光照射悬浮液，伴随着更长的照射时间可以获得更大的杀灭，用30分钟的照射时间，获得了活存计数的减少接近99.9999％使用φ11-SnCe6给出了3.5μg ml-1的最终浓度(相对于SnCe6)，光源是35mW的氦/氖激光器并照射(当使用照射时)1分钟、5分钟、10分钟、20分钟和30分钟。结果如图6所示。
在图3-6中SnCe6＝锡绿素e6φ11-SnCe6＝锡绿素e6轭合到噬菌体φ11上PBS＝磷酸盐缓冲液L+S+＝在轭合物存在下照射的细菌L+S-＝在没有轭合物时照射的细菌L-S+＝在没有光照下存在轭合物的细菌L-S-＝在没有光照和轭合物时的细菌实施例8使用噬茵体75-锡(IV)绿素e6轭合物和白光源对金黄色葡萄球菌致命的光敏作用细菌菌株金黄色葡萄球菌8325-4EMRSA-16光源KL200(Schott)，这是20瓦卤素冷光源，附加到其上的光导向是柔性的光纤维束，其以5cm距离引导到96孔培养板上。4孔的正方形放置在光源的中心。
近似的光强度＝44,000勒克斯(lux)或470μW/nm按照上面所述将噬菌体75轭合到SnCe6上，使用的噬菌体的浓度为1×107pfu/ml。
对在营养液中生长过夜的金黄色葡萄球菌培养物进行离心，再悬浮在PBS中并在600nm处将OD值调节到0.05(近似于4×107cfu/ml)。
将50μl的细菌培养物等份加入96孔培养板中并将50μl的如下一种溶液加入该孔中1)在PBS中的3.5μg/ml SnCe6-噬菌体75(最终浓度1.75μg/ml，1×106pfu/孔)2)在PBS中的1.75μg/ml SnCe6-噬菌体75(最终浓度0.875μg/ml，5×105pfu/孔)3)在PBS中的3.5μg/ml SnCe6(最终浓度1.75μg/ml)4)在PBS中的1.75μg/ml SnCe6(最终浓度0.875μg/ml)5)PBS6)在PBS中的浓度为5×105或1×106pfu/孔的噬菌体75这些孔或者用白光(一次4个孔)照射，或者用锡箔包上储存在黑暗中。
多种的照射时间后，从每孔中取出等份，系列稀释并展开到哥伦比亚血液琼脂上，将琼脂培养皿在37℃孵育过夜，第二天进行计数。
结果表2金黄色葡萄球菌8325-4
EMRSA-16
％杀灭率-这是与用PBS孵育的细菌并保持在黑暗中比较而计算出的。
所有结果都是重复试验的平均数。
对照包括用SnCe6、噬菌体75-SnCe6和噬菌体75孵育的细菌而没有进行白光照射。噬菌体75也进行白光照射。
所有的对照都有细菌计数，它与未加入光敏剂和未进行照射的对照悬浮液没有明显地不同。
实施例9对金黄色葡萄球菌菌株Mu3、Mu50和MW2进行进一步试验，向金黄色葡萄球菌(Mu3和Mu50)的抗万古霉素菌株或社区获得的MRSA(MW2)菌株的悬浮液，加入盐溶液、噬菌体75、SnCe6或噬菌体75-SnCe6并用氦/氖激光器以35mW照射样品。
所使用的SnCe6的浓度为1.5μg/ml，噬菌体浓度为5.1×107噬菌区形成单位/ml，光能剂量为21J/cm2。柱上的数字表示相对于仅加入盐溶液的样品的有机体的％杀灭率。结果如图7所示。
实施例10使用锡绿素e6(SnCe6)对化脓性链球菌的致死光敏作用在37℃、含有5％CO2的空气气氛中，化脓性链球菌ATCC12202在脑心灌注液(Brain Heart Infusion broth)中生长。通过离心法收集细胞并再悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)中并稀释到在PBS中的1×107cfu/ml。接着将20μl稀释了的细菌悬浮液的样品与磁力搅拌棒一起放入96孔培养板中的孔中。将在PBS中的100μl不同浓度(1-50μl/ml)的SnCe6加入细菌悬浮液，对照为加入到细菌的100μlPBS且或者照射(L+S-)或者保持在黑暗中(L-S-)，重复该试验一次。
孵育后，伴随着搅拌，一些孔中的内容物用具有633nm波长的发射光的35mW的氦/氖激光器照射10分钟，相应的能量密度为42J/cm2。将铝箔放在周围的孔中使任何泄漏的激光反射回目标孔中。对照孔没有进行激光照射。
用激光照射后，立刻从每个孔中取出100μl样品并在1.5mlEppendorf试管中在1ml TSY中从10-1到10-5进行系列稀释，接着将每个稀释液的两份50μl的等份试样展开在一半的CBA培养皿上，该培养皿放置在37℃的细菌培养箱中至多48小时，计数得到的菌落以确定活存有机体的数量。
随着SnCe6浓度的增长在黑暗中孵育的有机体活存计数没有明显地受到影响。没有光敏剂也没有用激光照射有机体。但是在SnCe6存在下对有机体的照射产生了依赖于浓度的存活计数降低。用50μl/ml的光敏剂的浓度获得了99.9997％的有机体的杀灭率。结果如图8所示。在图8中L+(空心柱)＝在没有SnCe6存在但有各种浓度光敏剂存在下用激光照射的培养物；L-(阴影柱)＝在没有SnCe6存在但有各种浓度光敏剂存在下在黑暗中孵育的培养物。
实施例11使用锡绿素e6(SnCe6)对痤疮丙酸杆菌的致死光敏作用在37℃、厌氧气氛中，痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)ATCC 29399在预先还原的脑心灌注液中生长。通过离心法收集细胞并再次悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)中并在PBS中稀释到1×108cfu/ml。接着将20μl稀释了的细菌悬浮液的样品与磁力搅拌棒一起放入96孔培养皿中的孔中。将在PBS中的100μl不同浓度(1-50μl/ml)的SnCe6加入细菌悬浮液，对照为加入到细菌的100μl PBS且或者照射(L+S-)或者保持在黑暗中(L-S-)，该试验进行两次。
孵育后，伴随着搅拌，用具有633nm波长发射光的35mW的氦/氖激光器照射一些孔中的内容物10分钟，相应的能量密度为42J/cm2。将铝箔放在周围的孔中使任何泄漏的激光反射回目标孔中。对照孔没有进行激光照射。
用激光照射后，立刻从每个孔中取出100μl样品并在1.5mlEppendorf试管中在1ml预先还原的TSY中从10-1到10-5进行系列稀释，接着将每个稀释液的两份50μl的等份试样展开在一半的CBA培养皿上，该培养皿在37℃厌氧孵育，计数得到的菌落以确定活存有机体的数量。
随SnCe6浓度的增加在黑暗中孵育的有机体的成活计数没有明显地受到影响。没有使用光敏剂也没有用激光照射有机体。但是在SnCe6存在下对有机体的照射产生了依赖于浓度的存活计数的降低。用50μl/ml的光敏剂的浓度获得了100％的有机体的杀灭率。结果如图9所示。在图9中，L+(空心柱)＝在没有SnCe6存在但有各种浓度光敏剂存在下用激光照射的培养物；L-(暗影柱)＝在没有SnCe6存在但有各种浓度光敏剂存在下在黑暗中孵育的培养物。
实施例12TBO和噬菌体的轭合物的制备将1mg甲苯胺蓝O(TBO)与0.4mg EDC、0.6mg S-NHS和200μl噬菌体(5×107pfu/ml)溶解在800μl的活性缓冲液中(0.1M MES，0.5MNaCl，pH5.5)。在加入1.4μl 2-巯基乙醇中和EDC之后，在搅拌下反应进行15到30分钟，反应再进行2至4小时，之后加入羟胺达到10mM的最终浓度终止反应。
通过两次噬菌体沉淀并接着用PBS透析，将TBO-噬菌体轭合物从游离的TBO分离。
权利要求
1.组合物，其含有光敏剂和噬菌体的轭合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述噬菌体是葡萄球菌噬菌体。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述光敏剂共价地连接到所述噬菌体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中所述光敏剂选自卟啉类、酞菁类、绿素类、菌绿素类、吩噻嗪类、吩嗪类、吖啶类、德卟啉、菁族、蒽环类、脱镁叶绿甲脂酸类、sapphyrins类、富勒烯、卤化咕吨类、苝醌颜料、gilvocarcins类、叔噻吩类、苯并菲啶类、补骨脂素类和核黄素类。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述光敏剂是锡(IV)绿素e6(SnCe6)。
6.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述噬菌体选自噬菌体53、75、79、80、83、φ11、φ12、φ13、φ147、φMR11、48、71、φ812、SK311、φ131、SB-I、U16、C1、SF370.1、SP24、SFL、A1、ATCC 12202-B1、f304L、φ304S、φ15、φ16、782、P1c1r100KM、P1、T1、T3、T4、T7MS2、P1、M13、UNL-1、ACQ、UT1、tbalD3、E79、F8、pf20B3、F116、G101、B86、T7M、ACq、UT1、BLB、PP7、ATCC 29399-B1和B40-8。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述噬菌体是噬菌体75或噬菌体φ11。
8.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述光敏剂的浓度为0.01-200μg/ml。
9.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述噬菌体的浓度为1×105-1×1010pfu/ml。
10.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中还包含Ca2+离子源，优选氯化钙。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其在药物可接受的载体中呈溶液的形式。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂、盐、抗氧化剂、防腐剂、胶凝剂或再矿化剂中的一种或多种。
13.杀灭细菌的方法，包括(a)用上述权利要求任一项所述的组合物接触欲处理的区域，从而使任何存在的细菌结合到所述的光敏剂-噬菌体轭合物；且(b)用被所述光敏剂吸收的波长的光照射所述区域。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细菌是葡萄球菌、特别是MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA或CA-MRSA。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述的光是激光或白光。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述激光来自于氦氖气体激光器。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述激光具有200-1060nm的波长。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述激光器具有1-100mW的功率以及1-10mm的光束直径。
19.根据权利要求19所述的方法，其中所述激光照射的光剂量为5-333Jcm-2。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述白光的光剂量为0.01-100kJ/cm2。
21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中所述照射的持续时间为1秒至15分钟。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的方法，其中存在于被处理的所述区域内或上面的所述组合物的浓度为0.00001-1％w/v。
23.权利要求1-12中任一项所述的组合物的用途，是用于治疗人体或动物体。
24.权利要求1-12中任一项所述的组合物在治疗细菌感染的药物制备中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌，特别是MRSA、EMRAS、VRSA、异-VRSA或CA-MRSA。
26.在光动力学治疗(PDT)中噬菌体作为靶向剂的用途。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述噬菌体是葡萄球菌噬菌体。
28.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其基本上是实施例中所描述的。
29.根据权利要求13-22中任一项所述的方法，其基本上是实施例中所描述的。
30.根据权利要求23-27中任一项所述的用途，其基本上是实施例中所描述的。
全文摘要
本发明提供含有光敏剂和噬菌体的轭合物的组合物，该轭合物可用于在光动力学治疗的靶向方法中杀菌，特别是MRSA、EMRAS、VRSA、异－VRSA或CA－MRSA菌株。
文档编号A61K47/48GK1867357SQ200480029625
公开日2006年11月22日 申请日期2004年10月8日 优先权日2003年10月9日
发明者迈克尔·威尔逊, 肖恩·奈尔 申请人:Ucl 生物医学公共有限公司