专利名称：植物种子提取物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及可用于预防动脉硬化等的新型植物种子提取组合物，含有该植物种子提取组合物的食品、饲料和医药组合物，以及该植物种子提取组合物的制备方法。
背景技术：
随着近年来生活方式的欧美化，心绞痛、心肌梗塞、脑梗塞等动脉硬化性疾病与癌症一起成为日本人的头号死因。对于在动脉硬化巢形成的初期LDL(低密度脂蛋白)的氧化扮演着重要的角色这一观点人们已基本达成共识，因此最近逐渐指出不仅要将血中胆固醇水平控制在适当的水平，而且控制氧化LDL的生成也是重要的。
已知食品、特别是源于植物的物质中含有丰富的抗氧化物质，有人在考虑是否是绿茶或红葡萄酒中含有的抗氧化物质被摄入至LDL中(或其附近)并除去自由基来防止氧化LDL的生成(Fuhrman等，Am.J.Clin.Nutr.，61；pp549-54，1995)。也有积极摄入这些食品将抑制癌或心脏病的免疫学研究(Renaud等，Lancet，339pp1523-26，1992)。
有报告指出来自芝麻种子木质素、葡萄种子多酚等特定的植物种子的特定成分对实验动物显示抗动脉硬化作用(Kang等，J.Nutr.，129pp1885-90，1999；Yamakoshi等，Atherosclerosis，142pp139-49，1999)。但现实是这种植物种子成分在动物实验水平上明确抗动脉硬化性的例子还很少，众多研究尚停留在试管水平。例如，特开平8-337536号公报中公开了焙炒植物种子并由经发酵处理的种子中提取出的抗活性氧作用剂。在该技术中，虽然利用植物种子作为原料，但由于需要焙炒、发酵处理等操作，因此通用性低，并非实用的方法。另外没有明确显示出起到抑制动脉硬化的效果。另外，Zhang等人(Zhang等，Chem.Pham.Bull.，45pp1910-14，1997)报道了由红花的油粕中利用各种溶剂的分配操作提取出的化合物组的结构，其中有体外具有抗氧化活性的物质。但是，现状是这些具有抗氧化活性的化合物对于预防动脉硬化有效尚不明确。考虑到已知体外的抗氧化活性未必与体内的抗动脉硬化活性相关(Fruebis等，J.Lipid Res.，38pp2455-64，1997；Fruebis等，Atherosclerosis，117pp217-24，1995Munday等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，18pp114-19，1998)，植物种子中的抗氧化物质是否具有抗动脉硬化性，至少需要在实验动物水平上进行确认。虽然Moon等人在红花种子的粉末、乙醇提取物或热水提取物中发现了抑制给与胆固醇负荷饵料的大鼠血中胆固醇上升的作用(Moon等，Nutr.Res.，21pp895-904，2001)，但该大鼠的胆固醇负荷实验结果是用来评价抑制胆固醇吸收的，而不是用来评价抑制动脉硬化的。
另一方面，已知在红花种子中含有体外抗氧化活性、抗炎性活性的血清素衍生物(Zhang等，Chem.Pham.Bull.，44pp874-876，1996；Kawasaki等，J.Interferon Cytokine Res.，18pp423-428，1998)。另外已知红花种子中含有作为糖苷的血清素衍生物(Zhang等，Chem.Pham.Bull.，45pp1910-14，1997)。另外报告了红花种子中含有血清素衍生物和作为腹泻诱发性物质的酚性糖苷2-羟基牛蒡子苷(2-hydroxyarctiin)(Palter.R.等，Phytochemistry，11pp2871-2874，1972)。虽然报告说该2-羟基牛蒡子苷是用pH5的水提取出的，但对血清素衍生物的行为并未进行考察(Lyon.C.K.等，J.Amer.Oil Chem.Soc.，56pp560-564，1979)。
发明内容
本发明的课题在于提供大量含有体内具有活性、且降低了副作用的新型植物种子提取组合物，含有该植物种子提取组合物的食品、饲料、医药组合物，以及提供该植物种子提取组合物的制备方法，该方法适用于食品、饲料、医药组合物的制备。
本发明人中的小山等人发现脱脂后的植物种子、特别是红花种子或菜籽种子的有机溶剂提取物(用己烷洗涤脱脂种子的含水乙醇提取液之后，用乙酸乙酯提取出的提取物)体外具有抑制人血浆中的LDL的氧化的作用，脱脂后的植物种子的有机溶剂提取物体内还具有抑制小鼠的血管内壁上形成的粥状斑(plaque)的形成的作用，在实验动物中对预防动脉硬化有效(PCT/JP03/04607)。而且，本发明人中的小山等人发现血清素衍生物(对香豆酰血清素和阿魏酰血清素)的混合物在实验动物中对预防动脉硬化有效(PCT/JP03/04607)。由此发现可容易地类推出与这些血清素衍生物一样，已知红花种子中含有的作为糖苷的血清素衍生物体内具有活性，对预防动脉硬化有效。
对于预防动脉硬化，腹泻是有害的。于是，本发明人基于上述情况和发现，着眼于获得体内具有活性、对预防动脉硬化有效的血清素衍生物的含量多、且作为腹泻诱发性物质的2-羟基牛蒡子苷的含量少的植物种子提取组合物，和为了获得所述组合物的提取方法。
本发明人为了解决上述课题进行了锐意研究，结果首次发现通过用水洗涤脱脂后的植物种子，从得到的洗涤处理物中用有机溶剂进行提取，可得到血清素衍生物的含量多、且2-羟基牛蒡子苷的含量少的组合物，完成了本发明。由于使用食品、饲料、医药组合物的制备中通常可使用的制备用剂可实施本发明的方法，因此适用于食品、饲料、医药组合物的制备。本发明包含以下项目。
(1)一种植物种子提取组合物，其是用水洗涤脱脂后的植物种子，从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的。
(2)一种植物种子提取组合物，其是对用水洗涤脱脂后的植物种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的提取物进行浓缩、干燥得到的。
(3)上述(1)或(2)所述的组合物，其中植物种子为红花的种子。
(4)一种红花种子提取组合物，其中，对香豆酰血清素、阿魏酰血清素、对香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的总含量，与2-羟基牛蒡子苷的含量的重量比为1∶0.01～0.2。
(5)上述(4)所述的组合物，其是用水洗涤脱脂后的红花的种子，从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的。
(6)上述(4)所述的组合物，其是对用水洗涤脱脂后的红花的种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的提取物进行浓缩、干燥得到的。
(7)上述(1)、(2)、(3)、(5)或(6)所述的组合物，其中有机溶剂为低级醇。
(8)上述(7)所述的组合物，其中低级醇为乙醇。
(9)含有上述(1)～(8)中任一项所述的组合物的食品。
(10)含有上述(1)～(8)中任一项所述的组合物的饲料。
(11)含有上述(1)～(8)中任一项所述的组合物的医药组合物。
(12)一种植物种子提取组合物的制备方法，其含有用水洗涤脱脂后的植物种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取的工序。
(13)一种植物种子提取组合物的制备方法，其含有对用水洗涤脱脂后的植物种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的提取物进行浓缩、干燥的工序。
(14)上述(12)或(13)所述的制备方法，其中，植物种子为红花的种子。
(15)上述(12)、(13)或(14)中任一项所述的制备方法，其中，有机溶剂为低级醇。
(16)上述(15)所述的制备方法，其中，低级醇为乙醇。
本发明的植物种子提取组合物为作为有效成分的血清素衍生物的含量多、且作为腹泻诱发性化合物的2-羟基牛蒡子苷的含量少的新型组合物。根据本发明的方法可适合于制备上述植物种子提取组合物，而且本发明的方法不使用一般在食品、饲料等用途中作为制备用剂不优选使用的乙酸乙酯也可进行制备，因此适于食品、饲料等的制备。
图1为关于参考例1中各试样的LDL的被氧化性的效果的示意曲线图。
图2为显示参考例2中红花粕提取组合物、菜籽粕提取组合物具有抑制apoE(-/-)小鼠[动脉硬化小鼠模型](给药第5周，14周龄)的大动脉内的动脉硬化的效果的照片概略图，(a-1)表示对照组，(b-1)表示红花组，(c-1)表示菜籽组。照片本来为彩色照片，染红的部分为粥状斑。图2为为了明确该染红部分对该照片绘图并且将染红的部分涂成黑色显示的概略图。
图3为参考例3中给与各试样第15周的apoE基因敲除小鼠(21周龄，雄性)的大动脉起始部病变面积的示意曲线图。图中，SFM表示红花粕提取组合物，CS表示对香豆酰血清素，FS表示阿魏酰血清素。
具体实施例方式
本发明中使用的植物种子可以是任何植物的种子，例如可列举出红花、菜籽、大豆等的种子，优选红花的种子。本发明中，植物种子是指构成植物种子的全体、或其一部分，例如可以是取出了种皮、胚乳、胚芽等的种子，或它们的混合物。
本发明中使用脱脂后的植物种子、即脱脂物(粕)作为原料。植物种子的脱脂物可利用本身公知的方法脱脂植物种子而得到，例如可压榨提取种子或在种子的破碎物中加入正己烷等提取后，从提取系统中取出固形分，干燥该固形分而得到。脱脂程度通常为60重量％以上，优选为80重量％以上。
本发明的特征在于，在后述的有机溶剂提取前，用水洗涤作为原料的脱脂后的植物种子。
水无特别限定，例如可使用蒸馏水、自来水、工业用水和它们的混合水等的任一种。只要能获得本发明的效果，水中可含有其他物质，例如无机盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化钙等)、酸(例如氯化氢、乙酸、碳酸、过氧化氢、磷酸等)、碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠等)等。洗涤时的pH通常为2～9，优选为5～7。
水的用量，作为总量相对于作为原料的脱脂后的植物种子通常为2～100倍量(水容量/脱脂后的植物种子重量，下同)，优选为10～40倍量。
洗涤可用本身公知的方法使作为原料的脱脂后的植物种子和水接触来进行。例如，可列举出在水中混悬脱脂后的植物种子后，过滤，回收固形的洗涤处理物的方法等。洗涤可使上述量的水一次或多次、或连续地接触脱脂后的植物种子来进行。接触时的温度通常为5～45℃，优选为25～35℃。接触时间通常为10～240分钟，优选为15～60分钟。
本发明的特征在于，从如上得到的脱脂后的植物种子的洗涤处理物中用有机溶剂提取，得到植物种子提取组合物。
有机溶剂可列举出例如低级醇、丙酮和它们的混合溶剂等，但并不限定于此。有机溶剂可以含水，也可以是无水物。有机溶剂的浓度通常为20～95重量％，优选为50～90重量％。考虑到提取后的提取物的浓缩、干燥和制备食品，有机溶剂优选低级醇。低级醇可列举出例如碳原子数1～4的醇，具体可列举出，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇等，但并不限于此。考虑到制备食品，低级醇优选乙醇。乙醇优选含有50重量％以上的乙醇分的含水乙醇或无水乙醇。
有机溶剂的用量通常为作为原料的脱脂后的植物种子的2～40倍量(有机溶剂容量/脱脂后的植物种子重量，下同)，优选为2～10倍量。提取温度通常为20～75℃，优选为50～70℃。提取时间通常为10～240分钟，优选为60～120分钟。
提取后，利用过滤等从悬浊液中分离固形分得到的提取液，可以直接或者根据需要浓缩、干燥作为本发明的植物种子提取物使用。浓缩、干燥可以直接浓缩、干燥提取液，也可以添加赋形剂(例如乳糖、蔗糖、淀粉、环糊精等)来实施。上述溶剂提取出的组合物的纯度作为本发明的植物种子提取组合物有用，也可以利用本身公知的方法进一步精制。
作为食品、饲料、医药组合物(动脉硬化预防剂等)使用利用上述方法得到的本发明的植物种子提取组合物时，组合物存在于对生理有害的溶剂中的情况下，使用经干燥的物质，或者生理上允许的溶剂中溶解、混悬或乳化该干燥物得到的物质。组合物的形态包括水性液等液状物，和减压浓缩而干燥的固体、冷冻干燥品等固形物。
利用上述方法得到的本发明的植物种子提取组合物，其特征在于，作为总量血清素衍生物(例如对香豆酰血清素、阿魏酰血清素、对香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷等)的含量多、且2-羟基牛蒡子苷的含量少。在此，含量是指添加赋形剂时，除去添加的赋形剂求得的含量。利用上述方法得到的本发明的植物种子提取组合物中、例如红花种子提取组合物，根据组合物的纯度等不同，但作为总量，相对于植物种子提取组合物总量，通常含有10～70重量％、优选20～50重量％的对香豆酰血清素、阿魏酰血清素、对香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷，2-羟基牛蒡子苷的含量相对于植物种子提取组合物总量，通常为20重量％以下，优选5重量％以下。利用上述方法得到的本发明的植物种子提取组合物中、例如红花种子提取组合物，对香豆酰血清素、阿魏酰血清素、对香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的总含量，与2-羟基牛蒡子苷的含量的重量比通常为1∶0.05～0.2，优选为1∶0.01～0.2。
本发明还涉及一种新型红花种子提取组合物，其中，对香豆酰血清素、阿魏酰血清素、对香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的总含量，与2-羟基牛蒡子苷的含量的重量比为1∶0.05～0.2，优选为1∶0.01～0.2。本发明的新型红花种子提取组合物优选利用上述本发明的方法来制备。
本发明中，血清素衍生物的含量是使用高效液相色谱，用资生堂公司制Capcell Pak C18柱，将含水乙腈作为线性梯度洗脱溶剂，检测UV290nm，与标准样品进行比较，测定的值。本发明中，2-羟基牛蒡子苷的含量是使用高效液相色谱，用资生堂公司制Capcell PakC18柱，将含水乙腈作为线性梯度洗脱溶剂，检测UV279nm，与标准样品进行比较，测定的值。
本发明的植物种子提取组合物、特别是红花种子提取组合物，由于血清素衍生物的含量多，因此给与或摄取血清素衍生物、或者预防性给与或摄取可用于有效的疾病的治疗或预防，例如动脉硬化的预防等。而且，本发明的植物种子提取组合物、特别是红花种子提取组合物，由于作为腹泻诱发性物质的2-羟基牛蒡子苷的含量少，因此副作用小。因此，本发明的植物种子提取组合物、特别是红花种子提取组合物，作为动脉硬化预防剂等的医药组合物、动脉硬化预防用等的食品、动脉硬化预防用等的饲料极为有用。
本发明的植物种子提取组合物、特别是红花种子提取组合物可预防动脉硬化，结果对于动脉硬化引起的疾病、例如心绞痛、心肌梗塞、间歇性跛行、脑梗塞等的预防有用。
本发明的植物种子提取组合物，适用于人、人以外的动物(例如人以外的哺乳类(猪、牛、马、狗、猫等家畜)、鸟类(火鸡、鸡等家禽)等)等。
本发明的“食品”是指所有食品，在含有所谓健康食品的一般食品之外，也包括厚生劳动省的保健功能食品制度中规定的特定保健用食品和营养功能食品，还包括补充剂。
作为食品、饲料、医药组合物可使用本发明的植物种子提取组合物本身。还可以在各种食品、例如调味酱、蛋黄酱等一般食品(包括所谓的健康食品)中含有本发明的植物种子提取组合物来使用。将本发明的植物种子提取组合物与赋形剂(例如乳糖、蔗糖、淀粉等)一起，根据情况与香料、色素等一起，制成片剂、丸剂、颗粒、细粒、粉末、微球、胶囊、溶液、乳液、混悬液、糖浆和含片等制剂，可用作特定保健用食品和营养功能食品等保健功能食品、补充剂、医药制剂(医药组合物)(主要口服)来使用。另外，本发明的植物种子提取组合物可用于饲料，可在通常的饲料中添加使家禽和家畜等摄取或给与家禽和家畜等。
特别是医药组合物的情况下，可与可药用载体(还包括添加剂)一起制剂化。作为可药用载体，如本领域技术人员所知，可列举出，例如赋形剂(例如乳糖、蔗糖、淀粉、D-甘露醇等)、粘合剂(例如纤维素、蔗糖、糊精、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素等)、润滑剂(例如硬脂酸镁等)、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠等)、溶剂(例如水、盐水、豆油等)、保存剂(例如对羟基安息香酸酯等)等，但并不限于此。
本发明的植物种子提取组合物的摄取量或给与量，根据组合物的纯度、对象人的年龄、体重、健康状态、疾病的种类等不同，例如优选作为动脉硬化预防用通常成人每日10mg～10g、优选100mg～10g，1日1次至数次摄取或服用。
利用本发明的方法制备的植物种子提取组合物，使用作为以往食用等使用的植物种子、特别是食用油的原料的红花的种子，且腹泻诱发性物质的含量少，因此毒性极低，几乎看不到副作用。
实施例下面列举实施例更加具体地例示本发明，但本发明并不限于这些实施例1在带有搅拌机的容器中装入0.1kg脱脂后的红花种子(红花粕)，加入0.5L水，在30℃温度下搅拌30分钟，然后在室温下，在离心过滤机(200g)中加入内容物，分离为固形分和洗涤液分。重复4次在固形分中加入0.5L水的洗涤。然后，在0.17kg该洗涤后的粕中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝1∶9重量比)溶液，60℃下搅拌1小时，在离心过滤机(200g)中加入内容物，分离为固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。减压浓缩0.5L该提取液后，进行真空干燥，得到2.7g红花粕提取物。
实施例2在带有搅拌机的容器中装入0.1kg脱脂后的红花种子(红花粕)，加入0.5L水，在30℃温度下搅拌30分钟，然后在室温下，在离心过滤机(200g)中加入内容物，分离为固形分和洗涤液分。重复4次在固形分中加入0.5L水的洗涤。在0.17kg洗涤后的粕中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝5∶5重量比)溶液，60℃下搅拌1小时，在离心过滤机(200g)中加入内容物，分离为固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。减压浓缩0.5L该提取液后，进行真空干燥，得到2.4g红花粕提取物。
实施例3在带有搅拌机的容器中装入0.1kg脱脂后的红花种子(红花粕)，加入2L水，在30℃温度下搅拌30分钟，然后在室温下，在离心过滤机(200g)中加入内容物，分离为固形分和洗涤液分。在0.17kg洗涤后的粕中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝1∶9重量比)溶液，60℃下搅拌1小时，在离心过滤机(200g)中加入内容物，分离为固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。减压浓缩0.5L该提取液后，进行真空干燥，得到2.4g红花粕提取物。
比较例1在0.1kg脱脂后的红花种子(红花粕)中加入0.5L含水乙醇(水∶乙醇＝1∶9重量比)溶液，60℃下搅拌3小时，抽滤内容物，分离为固形分和提取液分，得到0.5L的提取液。作为第2工序，减压浓缩0.5L该提取液后，溶解在0.1L水中。添加0.1L己烷洗涤0.1L该水溶液后，添加0.1L乙酸乙酯，混合后，实施分配，得到乙酸乙酯层。减压浓缩该乙酸乙酯提取液，进行真空干燥，得到1.2g红花粕提取物。
实施例4红花粕提取物的分析和评价对于制备的各例的红花粕提取物，利用下述方法进行红花粕提取物的分析，分析对香豆酰血清素(CS)、阿魏酰血清素(FS)、对香豆酰血清素糖苷(CS-Glc)、阿魏酰血清素糖苷(FS-Glc)和2-羟基牛蒡子苷。结果见表1～3。
表6.实验设计
通过快速推注cH36，接着注入来阻断TF，在被E.Coli攻击的狒狒中，能够将前炎性细胞因子IL-8和Il-6的系统性表达削弱至较低的水平(图11A-B)，并提供对肾和肺的部分保护。期间的分析显示，cH36的施予削弱了平均肺动脉压、肺系统顺应性的增加(图8A-B)以及肺泡-动脉氧梯度的增加。迄今所检查的动物的肾脏在尸体剖检中看起来总体正常，肾髓过氧化物酶水平保持得更低(图9A)，尿输出在实验期间被维持。被处理的动物中小肠湿/干比显著低于对照动物，表明cH36处理过的动物中水肿更少(图9B)。
这些数据显示，用Sunol-CH36靶向TF对凝血进行阻断，可以预防革兰氏阴性脓毒病中的器官损伤的发展以及炎症。这些数据还第一次显示了用于用抗凝血剂控制人类ARDS的新策略。
B.下述数据进一步显示，cH36和cH36-Fab有用于预防脓毒病狒狒中的肺损伤。
简言之，本实施例这部分的目的是进一步验证Sunol-cH36和cH36-Fab对肺中炎症以及前凝血-纤维蛋白溶解平衡的作用，并将之关联于狒狒的实验性脓毒病模型中ALI中结构和气体交换的异常。见上文中A节。
对所有的狒狒(Papio cyanocephalus)进行机械通风(21％O2)，麻醉，并在活的E.coli(1-2×1010CFU/kg)脓毒病发作之前12小时，通过静脉给予热杀死的E.coli的剂量(1×109CFU/kg)。研究设计由三组狒狒构成，如下文中表7所示。第一组中的狒狒(n＝6)被施予<p>在50ml乙醇中溶解分散5mg红花粕提取物。将该分散物作为分析样品。在下述条件下将该分析样品供于高效液相色谱，分析血清素衍生物。应说明的是，作为标准样品的对香豆酰血清素、阿魏酰血清素使用了血清素和反-4-香豆酸或反-4-阿魏酸缩合得到的物质。对香豆酰血清素糖苷、阿魏酰血清素糖苷使用Chemical andPharmaceutical Bulletin 45卷1910-1914(1997)中记载的方法得到的物质。
高效液相色谱的条件固定相资生堂Capcell Pak C18 5μm柱径4.6mm，柱长250mm洗脱溶剂由0.1％三氟乙酸水溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈水溶液，线性梯度洗脱40分钟洗脱溶剂流量1ml/分钟检测器UV(290nm)2-羟基牛蒡子苷的分析在50ml乙醇中溶解分散5mg红花粕提取物。将该分散物作为分析样品。在下述条件下将该分析样品供于高效液相色谱，分析2-羟基牛蒡子苷。应说明的是，作为标准样品的2-羟基牛蒡子苷使用Journal of the American oil chemists’society 35卷560-564(1978)中记载的方法得到的物质。
高效液相色谱的条件固定相资生堂Capcell Pak C18 5μm柱径4.6mm，柱长250mm洗脱溶剂由0.1％三氟乙酸水溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈水溶液，线性梯度洗脱40分钟洗脱溶剂流量1ml/分钟检测器UV(279nm)实施例5对大鼠(SD(IGS)，雄性，7周龄)单次给予(混悬在％羧甲基纤维素中)红花粕提取物(表1组合物和表3组合物)，在粪皿上直接确认有无给药后24小时内的腹泻、软便。结果见表4。
由表4可知，在经口给予比较例1的未实施水洗样品(表3组合酸转移酶也可用于本发明的方法中。
表8.用Galβ1，4GlcNAc序列作为受体底物的唾酸转移酶
1)Goochee et al.，Bio/Technology 91347-1355(1991)2)Yamamoto et al.，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert et al.，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996)用于本发明方法中的唾酸转移酶的一个例子是ST3GalIII，它也称为α(2，3)唾酸转移酶(E.C.2.4.99.6)。该酶催化唾液酸向Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的转移(参见如Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1991))，且负责糖肽中天冬酰胺连接的寡糖的唾液酸化。唾液酸与Gal连接，从而在两个糖之间形成α-连接。糖之间的键(连接)是在NeuAc的2-位置和Ga l的3-位置之间的。该特定的酶可从大鼠肝中分离(Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人的cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787；Kitagawa & Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因组(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，从而促进了通过重组表达对该酶的生产。在一个优选的实施方案中，本发明的唾液酸化方法应用大鼠ST3GalIII。
用于请求保护的方法的唾酸转移酶的例子是来自弯曲杆菌属(Campylobacter)的CST-I(参见如美国专利No.6,503,744、234nm的吸收5小时。由过氧化脂质生成曲线，根据近藤等人(J.Nutr.Sci.Vitaminol.，43pp435-44，1997)的方法，计算延迟时间，用将对照组(仅添加溶剂)的值作为100的相对值评价各样品对LDL的被氧化性的影响(图1)。任何样品均可见或多或少地抑制了LDL的被氧化性(即，延长延迟时间)的倾向，但菜籽粕和红花粕特别强地抑制了LDL的氧化。在上述试验中，被稀释的LDL与混和前的阶段下的各样品的稀释倍数为菜籽粕、红花粕200倍稀释，其他50稀释。
参考例2(体内的动脉硬化预防效果)如下调制菜籽粕、红花粕的提取物。
在榨油后的600g菜籽粕中加入3000ml的90体积％乙醇水，60℃的水浴中加温、搅拌3小时后，过滤。对过滤后的固形分进行1次同样的操作，将得到的滤液合并，利用减压浓缩得到500ml的浓缩液。在浓缩液中加入水，使总量为1000ml，混悬内容物后，用500ml的正己烷洗涤2次，用500ml乙酸乙酯提取2次洗涤后的水层。用无水硫酸镁脱水乙酸乙酯提取液，过滤后减压浓缩，得到12.5g固形物。
对榨油后的600g红花粕实施与上述同样的操作，得到10.1g的提取物。
将9周龄的雄性apoE基因敲除小鼠(apoE(-/-)；购自JacksonLaboratory)以1组9只分为对照/菜籽(菜籽粕提取物给药组)/红花(红花粕提取物给药组)的3组，使各组分别自由摄取表5所示的组成的饵料5周。在第2周(n＝6)和第5周(n＝3)处死小鼠，从大动脉起始部至大腿动脉分支部摘出大动脉，将用Sudan IV染色的血管内壁部分上形成的粥装斑的面积与对照组相比较。经过2周给药，菜籽组、红花组与对照组相比显示了抑制斑形成的倾向。在之后延长3周给药的组间比较中，上述倾向进一步增强(斑面积红花＜菜籽＜对照)，这些油粮植物粕提取物具有抑制动脉硬化的初期病变形成的效果(图2)。
表19.由HPLC确定的来自ST3Gal3重构的Cri-IgG1的不同糖形式的相对量。
通过比较，G0糖形式的ST6Gal1重构不能达到在ST3Gal3重构中发现的完全水平。图115A-115D和图116A-116C分别显示了从CE和HPLC分析获得的结果。在任意一种糖重构样品中均没有发现S2G2糖形式。然而，所有G2糖形式均转变为S1-G2。MALDI-MS分析也支持这些数据(图117A-117C)。
Cri-IgG1的重构聚糖的稳定性.最后，研究了通过外切糖苷酶处理和糖基化进行重构的Cri-IgG1聚糖的稳定性。将每一种糖重构的Cri-IgG1抗体贮存于4℃，并在重构后2周通过SDS-PAGE检查降解。如图118A-118E所示，重构的DEAE和SPA抗体均保持约150kDa的分子量，显示很少至没有降解，而不管进行的糖重构类型如何。Fc Cri-IgG1抗体保持约38kDa的分子量，也显示很少至没有降解，而不管进行的重构类型如何。
重构的Cri-IgG1抗体的效应子功能生物测定.效应子功能生物测定源自Mimura等人(2000，Molecular Immunology 37697-706)的方法。Cri-IgG1抗体的糖形式的IC50是通过抑制由红细胞引起的U937细胞的超氧化物反应来确定的，其中红细胞由天然抗-NIP抗体进行了敏化。
在1000单位/mL干扰素γ存在时将单细胞的U937细胞培养2日，以诱导细胞分化及其产生超氧化物的能力。然后将细胞洗涤并以2×106细胞/mL重悬于Hanks平衡盐溶液中，该盐溶液中不具有酚红，而含有20mM pH7.4的HEPES和0.15mM BSA。在Cri-IgG1抗体的各种糖形式不存在或存在时于37℃温育30分钟用抗-NIP(5-碘-4-羟基-3-硝基苯乙酰)抗体对红细胞进行敏化。然后用PBS洗涤细胞3次，并将其以2.5×<p>[表6]
产业实用性如上所述，可知本发明提供的植物种子提取组合物对预防动脉硬化显著有效。另外，本发明的植物种子提取组合物为天然原料，因此安全性高，几乎无副作用，本发明的食品、饲料、医药组合物有利于没有使用上的问题。而且，本发明的方法对于获得有效成分的含量多、腹泻诱发性物质的含量少的本发明的植物种子提取组合物是有效的。
以上对于若干本发明的
具体实施方式
进行了详细的说明，但本领域技术人员可对所示的特定方案根据本发明的教导和优点在不实质上超出的范围内进行各种修正和变更。因此，这种修正和变更也包括在所有后述的权利要求书要求保护的本发明的精神和范围内。
本申请以在日本申请的特愿2003-352829为基础，其内容均包含在本申请中。
权利要求
1.一种植物种子提取组合物，其是用水洗涤脱脂后的植物种子，从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的。
2.一种植物种子提取组合物，其是对用水洗涤脱脂后的植物种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的提取物进行浓缩、干燥得到的。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，植物种子为红花的种子。
4.一种红花种子提取组合物，其中，对香豆酰血清素、阿魏酰血清素、对香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的总含量，与2-羟基牛蒡子苷的含量的重量比为1∶0.01～0.2。
5.如权利要求4所述的组合物，其是用水洗涤脱脂后的红花的种子，从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的。
6.如权利要求4所述的组合物，其是对用水洗涤脱脂后的红花的种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的提取物进行浓缩、干燥得到的。
7.如权利要求1、2、3、5或6所述的组合物，其中，有机溶剂为低级醇。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，低级醇为乙醇。
9.含有如权利要求1～8中任一项所述的组合物的食品。
10.含有如权利要求1～8中任一项所述的组合物的饲料。
11.含有如权利要求1～8中任一项所述的组合物的医药组合物。
12.一种植物种子提取组合物的制备方法，其含有用水洗涤脱脂后的植物种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取的工序。
13.一种植物种子提取组合物的制备方法，其含有对用水洗涤脱脂后的植物种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取得到的提取物进行浓缩、干燥的工序。
14.如权利要求12或13所述的制备方法，其中，植物种子为红花的种子。
15.如权利要求12、13或14中任一项所述的制备方法，其中，有机溶剂为低级醇。
16.如权利要求15所述的制备方法，其中，低级醇为乙醇。
全文摘要
提供大量含有作为具有体内活性的有效成分的血清素衍生物、且降低了副作用的新型植物种子提取组合物，含有该植物种子提取组合物的食品、饲料、医药组合物。还提供该植物种子提取组合物的制备方法，该方法适用于食品、饲料、医药组合物的制备。本发明涉及用水洗涤脱脂后的植物种子，从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取出植物种子提取组合物；对香豆酰血清素、阿魏酰血清素、对香豆酰血清素糖苷和阿魏酰血清素糖苷的总含量，与2－羟基牛蒡子苷的含量的重量比为1∶0.01～0.2的红花种子提取组合物；含有用水洗涤脱脂后的植物种子、从得到的洗涤处理物中用有机溶剂提取工序的植物种子提取组合物的制备方法。
文档编号A61K31/7048GK1863542SQ20048002957
公开日2006年11月15日 申请日期2004年10月6日 优先权日2003年10月10日
发明者小山直人, 关哲也, H·蚁坂, 石井康一 申请人:味之素株式会社