专利名称：一种止痛巴布膏的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种止痛药物的制备方法，更具体地说涉及一种以中草药为原料制备止痛巴布膏的制备方法，属于中药领域。
背景技术：
在目前临床上各疾病的止痛中，西药一般采用毒麻制剂，易产生耐药性及成瘾性，且口服药物对身体的副作用较大；在外用贴膏中，常用的中药制剂黑膏药含铅，长期使用能使人体血铅和尿铅含量明显增高，病人难以接受，同时也造成对环境的污染。而止痛巴布膏有丰富的临床应用基础，该方含有活血化瘀止痛的名贵中药雄黄、三七、乳香、没药等，具有镇痛、抗癌、消肿等功效，临床效果显著而确切，但目前大多为糊剂，须临时配制，体积较大，使用、贮藏均不方便。中国专利CN1290530A公开了一种癌痛宁巴布膏及其制备方法，该方法是以天南星、姜黄、血竭、乳香、没药、冰片等为原料制备的癌痛宁巴布膏，但该方法所能提取的中草药的有效成分较低，制备的癌痛宁巴布膏对各种癌症病疼的虽有一定的镇疼作用，疗效仍不能令人满意。
发明内容
本发明的目的在于提供一种止痛巴布膏的制备方法，以解决上述现有技术中所存在的问题和不足，该方法制备的止痛巴布膏具有载药量高、生物相容性好、透气性和保湿性好、无过敏性和利于透皮吸收等优点。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明的止痛巴布膏的制备方法，包括以下步骤A)取雄黄，捡去杂质，先粗粉碎，将其微粉化至50％的颗粒粒径小于5μm，备用；B)取三七，粉碎成粗粉，用65％～75％乙醇回流提取两次，每次加醇7～9倍药材重量，每次提取1～2小时，合并回流液，减压回收乙醇至含药量为0.3～0.5g·ml-1，提取液通过大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性，然后用6～8倍柱体积的50％～55％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得三七总皂苷浸膏，备用；C)萃取乳香得萃取物，备用；D)萃取没药得萃取物，备用；E)取冰片用乙醇溶解后和上述雄黄超微粉、三七总皂苷浸膏、乳香萃取物、没药萃取物及透皮吸收促进剂一起加入已混匀的空白基质中，搅拌均匀并涂布于裱背材料上，加盖保护膜，切割后，封装即得止痛巴布膏。
上述制备方法步骤A)中所述的微粉化方法为乳钵研磨法、高剪切乳化法、球磨法或气流粉碎法，优选气流粉碎法，所述的气流粉碎法为初步水飞后在40～60℃温度条件下烘干，用气流粉碎机粉碎至50％的颗粒粒径小于5μm得雄黄超微粉。
上述制备方法步骤B)中所述的大孔吸附树脂柱为AB-8大孔吸附树脂柱或D101大孔吸附树脂柱，步骤B)中所述的提取液通过大孔吸附树脂柱时循环三次。
上述制备方法步骤C)中所述的乳香萃取方法为超临界CO2萃取法、水蒸气蒸馏法、超声提取法或索氏提取法，优选超临界CO2萃取法，所述的超临界CO2萃取法的萃取条件为萃取压力20～30Mpa、温度40～60℃、萃取时间4～8小时。
上述制备方法步骤D)中所述的没药的萃取方法为超临界CO2萃取法、水蒸气蒸馏法、超声提取法或索氏提取法，优选超临界CO2萃取法，所述的超临界CO2萃取法的萃取条件为萃取压力20～30Mpa、温度40～60℃、萃取时间4～6小时。
上述制备方法步骤E)中所述的空白基质是用重量配比为聚乙烯吡咯烷酮∶聚丙烯酸钠∶羧甲基纤维素钠∶甘油＝1∶2∶1∶8的原料混合均匀后制得；步骤E)中所述的透皮吸收促进剂为质量百分浓度2～4％的氮酮；步骤E)中所述的裱背材料上药物的涂附厚度为0.5～1mm，每块药膏的切割尺寸为7×10cm。
本发明的一种止痛巴布膏的制备方法，包括以下步骤A)取雄黄，捡去杂质，粗粉碎，初步水飞后在60℃温度条件下烘干，用气流粉碎机粉碎至50％的颗粒粒径小于5μm得雄黄超微粉，备用；B)取三七，粉碎成粗粉，用70％乙醇回流提取两次，每次加醇8倍量，每次提取1.5小时，合并回流液，减压回收乙醇至含药量为0.3～0.5g·ml-1，提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性，然后用6倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得三七总皂苷浸膏，备用；C)用超临界CO2萃取法在萃取压力25Mpa、温度45℃、萃取时间6小时条件下萃取乳香，得萃取物，备用；
D)用超临界CO2萃取法在萃取压力25Mpa、温度45℃、萃取时间4小时条件下萃取没药，得萃取物，备用；E)取冰片用乙醇溶解后和上述雄黄超微粉、三七总皂苷浸膏、乳香萃取物、没药萃取物及质量百分浓度3％的氮酮一起加入用重量配比为聚乙烯吡咯烷酮∶聚丙烯酸钠∶羧甲基纤维素钠∶甘油＝1∶2∶1∶8的原料混合均匀后制得的空白基质中，搅拌均匀并涂布于裱背材料上，涂附厚度为0.5～1mm，加盖保护膜，每块药膏切割为7×10cm尺寸，封装即得止痛巴布膏。
与现有技术相比本发明的有益效果本发明的方法制备的止痛巴布膏具有载药量高、生物相容性好、透气性和保湿性好、无过敏性和利于透皮吸收等优点，同时还具有较好的止痛作用，基本无皮肤刺激性和过敏性，可广泛应用于临床；制备方法中将雄黄超微粉碎后，可使雄黄粒径由传统的极细粉——75μm左右减小至5μm甚至更小，即节省药物资源的同时又更好的发挥雄黄的药效；本发明的制备方法可使三七的提取物、乳香和没药萃取物的有效成分含量较高、种类较多，从而使本发明方法制备的止痛巴布膏具有很好的疗效；另外体外透皮试验结果显示用本方法制备止痛巴布膏的雄黄透皮效果较好，乳香中有效成分、没药中有效成分β-榄香烯和冰片也显示了很好的透皮性。
图1为本发明止痛巴布膏制备工艺流程2为雄黄超微粉碎颗粒粒径分布3为不同浓度乙醇洗脱三七总皂苷结果图4为不同浓度乙醇洗脱三皂苷单体结果图5为不同氮酮浓度时各成分渗透速率结果具体实施方式
以下通过实施例进一步阐述本发明的制备方法，在实施例中空白基质是用配比为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)∶聚丙烯酸钠(PNA)∶羧甲基纤维素钠(CMC-Na)∶甘油＝1∶2∶1∶8的原料混合均匀后制得。
实施例1A)取雄黄100g，捡去杂质，粗粉碎，初步水飞后在60℃温度条件下烘干，用气流粉碎机超微粉碎半小时后得雄黄超微粉85g，备用，所得颗粒50％的颗粒粒径小于4.18μm，分布相对较集中，且加工过程可有效避免产生大量热量使得雄黄被氧化；B)取三七200g，粉碎成粗粉，用70％乙醇回流提取两次，每次加醇8倍药材重量，每次提取1.5小时，合并回流液，减压回收乙醇至含药量为0.3g·ml-1，提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性，然后用6倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得三七总皂苷浸膏120g，备用；C)取乳香200g，用超临界CO2萃取法在萃取压力25Mpa、温度45℃、萃取时间6小时条件下萃取乳香，得萃取物40g，备用；D)取没药200g，用超临界CO2萃取法在萃取压力25Mpa、温度45℃、萃取时间4小时条件下萃取没药，得萃取物24g，备用；E)取冰片25g用乙醇120mL溶解后和上述雄黄超微粉、三七总皂苷浸膏、乳香萃取物、没药萃取物及透皮吸收促进剂即浓度3％(质量百分比)的氮酮30g一起加入已混匀的空白基质700g中，搅拌均匀并涂布于裱背材料上，涂附厚度为0.8mm，每块药膏的切割尺寸为7×10cm，加盖保护膜，切割后，封装即得止痛巴布膏。
实施例2A)取雄黄50g，捡去杂质，粗粉碎，初步水飞后在40℃温度条件下烘干，用气流粉碎机超微粉碎半小时后得雄黄超微粉36g，备用，所得颗粒50％的颗粒粒径小于4.60μm，分布相对较集中，且加工过程可有效避免产生大量热量使得雄黄被氧化；B)取三七100g，粉碎成粗粉，用65％乙醇回流提取两次，每次加醇7倍药材重量，每次提取1.0小时，合并回流液，减压回收乙醇至含药量为0.5g·ml-1，提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性，然后用6倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得三七总皂苷浸膏55g，备用；C)取乳香100g，用超临界CO2萃取法在萃取压力20Mpa、温度60℃、萃取时间8小时条件下萃取乳香，得萃取物18.5g，备用；D)取没药100g，用超临界CO2萃取法在萃取压力20Mpa、温度60℃、萃取时间6小时条件下萃取没药，得萃取物13.6g，备用；E)取冰片12g，用乙醇60mL溶解后和上述雄黄超微粉、三七总皂苷浸膏、乳香萃取物、没药萃取物及透皮吸收促进剂即浓度3％(质量百分比)的氮酮16g一起加入已混匀的空白基质340g中，搅拌均匀并涂布于裱背材料上，涂附厚度为0.6mm，每块药膏的切割尺寸为7×10cm，加盖保护膜，切割后，封装即得止痛巴布膏。
实施例3A)取雄黄70g，捡去杂质，粗粉碎，初步水飞后在60℃温度条件下烘干，用气流粉碎机超微粉碎半小时后得雄黄超微粉45g，备用，所得颗粒50％的颗粒粒径小于4.42μm，分布相对较集中，且加工过程可有效避免产生大量热量使得雄黄被氧化；B)取三七120g，粉碎成粗粉，用75％乙醇回流提取两次，每次加醇9倍量，每次提取2小时，合并回流液，减压回收乙醇至含药量为0.4g·ml-1，提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性，然后用8倍柱体积的55％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得三七总皂苷浸膏80g，备用；C)取乳香120g，用超临界CO2萃取法在萃取压力30Mpa、温度40℃、萃取时间4小时条件下萃取乳香，得萃取物24g，备用；D)取没药120g，用超临界CO2萃取法在萃取压力30Mpa、温度40℃、萃取时间6小时条件下萃取没药，得萃取物15g，备用；E)取冰片10g，用乙醇50mL溶解后和上述雄黄超微粉、三七总皂苷浸膏、乳香萃取物、没药萃取物及透皮吸收促进剂即即浓度3％(质量百分比)的氮酮25g一起加入已混匀的空白基质600g中，搅拌均匀并涂布于裱背材料上，涂附厚度为1mm，每块药膏的切割尺寸为7×10cm，加盖保护膜，切割后，封装即得止痛巴布膏。
以下通过对比例来进步阐述本发明止痛巴布膏的制备方法。
对比例1雄黄加工方法对比评价乳钵研磨法、高剪切乳化法、球磨法、气流粉碎法加工雄黄结果，初步筛选出雄黄的加工方法。
(1)乳钵研磨法取雄黄适量，置乳钵内，加适量清水研磨成糊状，然后加多量清水搅拌，稍停，倾出混悬液，下沉的粗粉继续研磨，如此反复多次，直至手捻细腻、无亮星为止，弃取杂质，将前后倾出的混悬液静置后，倾去上面的清水，60℃干燥，再研细即可。
(2)高剪切乳化法取雄黄适量，捣碎，加入适量冷蒸馏水，用高剪切乳化机乳化(3000rpm·min-1)1小时，静置，倾去上面的清水及上浮的杂质，60℃干燥，研细即可。
(3)球磨法取雄黄适量，捣碎，加入适量冷蒸馏水，球磨机加工(3000rpm·min-1)2小时，静置，倾去上面的清水及上浮的杂质，60℃干燥，研细即可。
(4)气流粉碎法气流粉碎法又称气流磨法，它是在高速气流作用下，物料通过本身颗粒的之间的撞击，气流对物料的冲击剪切作用以及物料与其它部件的冲击、摩擦和剪切等而使物料粉碎。
气流粉碎具有如下突出特点①粉碎后的物料平均粒度细，一般小于5μm；
②尤其适用于低融点和热敏性等物料，因为该方法以压缩空气为动力，压缩气体在喷嘴处的绝热膨胀会使系统温度降低，工作过程中不会产生大量的热。
雄黄超微粉粒径分布(如图2所示)和四种加工方法对比结果见表1表1 四种方法加工雄黄结果比较
结果显示，采用超微粉碎加工雄黄粉碎时间短，所得颗粒粒径最小4.18μm{D(v，0.5)50％的颗粒粒径小于4.18μm}且分布相对较集中，且加工过程中有效避免了大量热量得产生避免其被氧化，该方法可行。
雄黄粉的制备工艺优选为取雄黄，捡去杂质，粉碎，初步水飞后低温(60℃)烘干，用气流粉碎机粉碎得雄黄超微粉，备用。
对比例2三七提取纯化工艺1.三七提取工艺研究正交设计三七醇回流提取工艺，以总提取物、三七总皂苷和人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量为指标进行分析评价，确定三七醇回流提取工艺。
考察指标及测定方法如下(1)总提取物的测定精密吸取各提取液10.0ml，置干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置105℃烘3小时，置干燥器中冷却30分钟，称重，计算总提取物含量。
(2)三七总皂苷(PNS)的测定标准曲线绘制精密吸取人参皂苷Rg1(2.642mg·ml-1)对照品液10、20、40、60μl，置10ml具塞试管中，热风吹去溶剂，加5％香草醛-冰醋酸0.2ml，高氯酸0.8ml，于60℃水浴加热15分钟，迅速冷却，加冰醋酸5.0ml，摇匀，随行试剂作空白，于560nm处测定吸收度，以吸收度为纵座标，对照品量为横座标，绘制标准曲线，y＝3.99×10-3x-0.0199 r＝0.9977。
三七总皂苷含量测定精密吸取各提取液10.0ml水液加水饱和正丁醇萃取4次，每次10ml，合并正丁醇液，用氨试液洗3次，每次15ml，水浴蒸干正丁醇液，残渣用甲醇溶解并定容为10ml，取上述各溶液0.03ml，依标准曲线绘制项下的方法，自“热风吹去溶剂”起依法测定吸收度，依标准曲线得出各提取液中三七总皂苷含量。
(3)总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的测定色谱条件与系统适用性试验ZORBAX SB-C18柱(4.6×250mm，5-Micro)；柱温30℃；检测波长203nm，参比波长400nm；流速1.0ml·min-1；进样量10μl；梯度洗脱程序见表2。
表2 HPLC梯度洗脱程序
①标准溶液制备取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1标准品适量，精密称定，置容量瓶中，分别以甲醇溶解并定容至5ml，即得浓度分别为0.1352mg·ml-1、0.4651mg·ml-1和0.2469mg·ml-1的标准品溶液。
②供试品溶液制备取各提取液10.0ml，加水饱和的正丁醇萃取4次，每次15ml，合并正丁醇液，再用正丁醇饱和的水萃取3次，用氨试液洗3次，每次20ml，水浴蒸干正丁醇液，残渣用甲醇溶解并定容为5ml，微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。
③含量测定吸取上述标准品溶液和供试品溶液各20μl，注入HPLC色谱仪。
对结果进行分析得三七提取最优选工艺为8倍量70％乙醇，提取两次，每次1.5小时。
2.三七总皂苷纯化工艺研究应用纯化皂苷较好的大孔吸附树脂AB-8和D101并对比其吸附解吸附性能，优选大孔树脂纯化三七总皂苷工艺参数。
(1)指标的测定(见三七提取工艺研究中考察指标及测定方法)(2)不同型号大孔吸附树脂对三七总皂苷吸附、解吸性能的研究①树脂的前处理取市售大孔吸附树脂，用乙醇加热回流提取5小时，装柱，用乙醇洗脱，至洗脱液中加蒸馏水(洗脱液∶蒸馏水＝1∶3)无混浊，再用蒸馏水洗，至洗脱液中加乙醇(洗脱液∶乙醇＝1∶3)无混浊即可，备用。
②不同型号大孔吸附树脂对三七总皂苷吸附率和解吸率的比较分别称取各型号(AB-8、D101)湿大孔吸附树脂适量，湿法装柱，取三七提取液30ml分别上样，逐步调节流速，过柱液重吸附三次，收集过柱液，定容；静置1小时后以蒸馏水冲洗至Molish反应阴性，收集水洗液，定容；再以50％乙醇冲洗，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，定容，依上述方法测定，分别计算两种树脂对PNS与R3(即三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1)之和的吸附解吸附性能。结果显示，AB-8对PNS和R3的吸附率分别为94％、96％，解析率分别为80％、75％；D101对PNS和R3的吸附率91％、92％，解析率分别为52％、45％，即两种树脂对PNS和R3的吸附性良好，且吸附率差别不大，但AB-8的解吸率大大高于D101，故选取AB-8树脂用于三七总皂苷的纯化。
(3)最佳洗脱溶媒的选择精密量取一定体积的三七提取液，上AB-8树脂柱，先用水洗至流出液Molish反应呈阴性，依次用10％，30％，50％，70％，90％乙醇液各100ml洗脱，每25ml收集一份，以洗脱液先后顺序编号，测定其中各成分含量。以收集编号(X)和三七总皂苷、三皂苷单体之和(Y)为坐标分别绘制洗脱曲线，结果分别见图3、图4。
图3、图4中，1～4号用10％乙醇洗脱；5～8号用30％乙醇洗脱；9～12号用50％乙醇洗脱；13～16号用70％乙醇洗脱；17～20号用90％乙醇洗脱；由图可知，三七总皂苷和三皂苷单体均以50％乙醇洗脱效果最佳。
(4)洗脱溶媒用量的确定根据上述确定的AB-8吸附量和最佳洗脱溶媒，精密吸取三七提取液适量上柱，用蒸馏水洗脱至流出液Mlolish反应呈阴性，然后以50％醇300ml洗脱，分段收集洗脱液，测定部分洗脱液中各成分含量，结果显示洗脱剂用量为300ml时，PNS和R3的累计解析率分别为95.1％，84.7％，此时目标成分基本洗脱完全，故洗脱剂用量为300ml(6倍柱体积)。
AB-8大孔吸附树脂纯化三七总皂苷优选工艺为取含药量为0.3～0.5g/ml的三七提取液上样，调节流速，过柱流出液循环上样3次，静置30分钟，以蒸馏水洗至洗脱液Molish反应呈阴性，再以6BV(6倍柱体积)50％乙醇洗脱，收集洗脱液即可。
对比例3乳香提取工艺研究1.提取方法选择以水蒸气蒸馏、超声提取、索氏提取和超临界CO2萃取法四种方法提取乳香，GC和GC-MS分析各提取物中成分，从中优选出最佳提取方法。
(1)供试品溶液的制备①水蒸气蒸馏法称取乳香粗粉50g，精密称定，依2000年版《中国药典》一部提取乳香挥发油，用无水Na2SO4脱水，计算得率。
②超临界CO2萃取法称取乳香粗粉50g，精密称定，置超临界CO2萃取釜中，萃取条件为压力30Mpa，萃取温度45℃，CO2流量160L·h-1，解析釜温度60℃，萃取时间8小时得乳香超临界CO2萃取物，计算得率。
③索氏提取法称取乳香粗粉50g，精密称定，置索氏提取器中，石油醚提取至提取液近无色，合并提取液并过滤，回收石油醚后得淡黄色提取物，计算得率。
④超声提取法称取乳香粗粉50g，精密称定，石油醚超声两次，合并提取液并过滤，回收石油醚后得黄色提取物，计算得率。
取以上四种方法所得乳香提取物各60mg，精密称定，置2ml容量瓶中以丙酮溶解并稀释至刻度，即为供试品溶液。
(2)色谱条件及测定结果①GC条件Agilent6890N气相色谱仪，FID检测器，载气氮气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；升温程序150℃，2℃·min-1，250℃；柱前压65Kpa；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃；进样量2μl。
②GC-MS条件Agilent6890N气质联用仪，载气氦气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；升温程序150℃，2℃·min-1，250℃；柱前压65Kpa；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃；分辨率600，电离方式EI，电离电压70Ev，离子源温度200℃，扫描范围30～350amu，扫描速度1s/dec；进样量1μl。
③测定方法及结果取上述各供试品溶液，依GC和GC-MS条件进行测定，结果如下见表3表3 四种方法提取得率及各提取物中主要成分含量测定结果
超临界CO2萃取物中鉴定出47个成分，萃取物中含有较多的挥发油，其中乙酸辛酯，1-辛醇，乙酸冰片酯，顺式-β-罗勒烯，苯(甲)酸苄酯，橙花醇乙酸酯等含量较高；除含有挥发油外，还含有较多未鉴定的其它成分。
水蒸气蒸馏物中鉴定出41个成分，主要为挥发性强的单萜、倍半萜等挥发油，挥发油中乙酸辛酯含量最高，还有较多的1-辛醇和乙酸冰片酯，但该法得率太低，提取时间很长，且不能提出树脂等成分。
超声和索氏提取物中分别鉴定出35个和36个成分，两方法得率虽较高，但挥发油含量很低，尤其是乙酸辛酯含量较低。
由以上结果可见，超临界CO2萃取得率和萃取物中主要有效成分含量较高，且其中除含有挥发油外还含有其它成分，又避免了乳香提取过程中的高温和有机溶剂残留，总体评价该法优于其它三种提取方法，故初步确定采用超临界CO2萃取乳香。
2.超临界CO2萃取乳香工艺采用正交法设计提取工艺，GC测定提取物中有效成分α-蒎烯和乙酸辛酯含量并进行综合评价，优选最佳提取工艺参数。
(1)正交试验设计以L9(34)进行正交设计，选择对萃取过程影响较大的萃取压力(A)，萃取温度(B)和萃取时间(C)三因素，A、B和C各水平分别为20、25、30Mpa；35、45和55℃；4、6和8h进行正交试验。
(2)GC测定方法及试验结果Agilent6890N气相色谱仪，FID检测器，载气氮气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25um；升温程序150℃，2℃/分钟，250℃；柱前压65Kpa；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃。
①α-蒎烯和乙酸辛酯标准曲线的绘制分别吸取α-蒎烯和乙酸辛酯对照品适量，精密称定，以丙酮为溶剂，配成42.91mg/ml和43.45mg/ml的标准溶液，再分别精密量取各对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml置1ml容量瓶中，分别用丙酮定容，取上述稀释后的梯度溶液和原对照品溶液各1μl进样，分别计算回归方程为α-蒎烯回归方程为y＝30472x+54220，r＝0.9998；在4.291～42.91μg内线性关系良好。乙酸辛酯回归方程为y＝27963x+32368，r＝0.9994；在4.345～43.45μg内线性关系良好。
②GC含量测定取萃取物各50mg，精密称定，置2ml容量瓶中以丙酮溶解并d定容，分别吸取上述各溶液2μl，依上述GC条件测定，并计算α-蒎烯和乙酸辛酯含量，正交试验结果萃取压力、温度和时间对得率、α-蒎烯含量和乙酸辛酯含量的影响程度不同，且分别以得率、α-蒎烯含量和乙酸辛酯含量为评价指标得出的最佳工艺不尽一致，故进行综合评分(对萃取得率、α-蒎烯和乙酸辛酯含量进行加权评分)以评价最佳工艺；对综合得分影响大小次序为萃取温度、压力和时间，以综合得分为指标得出最优选工艺参数为A2B3C2，即萃取压力25Mpa，温度55℃，时间6小时。
对比例4没药提取工艺研究1.提取方法选择以水蒸气蒸馏、超声提取、索氏提取和超临界CO2萃取法(SFE-CO2)四种方法提取没药，GC和GC-MS分析各提取物中成分，从中优选出最佳提取方法。
(1)供试品溶液制备①水蒸气蒸馏法称取没药粗粉80g，精密称定，依2000年版《中国药典》一部提取没药挥发油，用无水Na2SO4脱水，计算得率。
②超临界CO2萃取法称取没药粗粉80g，精密称定，置超临界CO2萃取釜中，萃取条件为压力25Mpa，萃取温度45℃，CO2流量100L·h-1，解析釜温度55℃，萃取时间8小时得没药超临界CO2萃取物，计算得率。
③索氏提取法称取没药粗粉80g，精密称定，置索氏提取器中，石油醚提取至提取液近无色，合并提取液并过滤，回收石油醚后得淡黄色提取物，计算得率。
④超声提取法称取没药粗粉80g，精密称定，石油醚超声两次，合并提取液并过滤，回收石油醚后得黄色提取物，计算得率。
取以上四种方法所得没药提取物各60mg，精密称定，置2ml容量瓶中以丙酮溶解并稀释至刻度，即为供试品溶液。
(2)色谱条件及测定结果①GC条件Agilent6890N气相色谱仪，FID检测器，载气氮气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；升温程序150℃，2℃·min-1，250℃；柱前压65Kpa；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃；进样量2μl。
②GC-MS条件Agilent6890N气质联用仪，载气氦气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；升温程序150℃，2℃·min-1，250℃；柱前压65Kpa；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃；分辨率600，电离方式EI，电离电压70Ev，离子源温度200℃，扫描范围30～350amu，扫描速度1s/dec；进样量1μl。
③含量测定方法及结果取上述各供试品溶液，依GC和GC-MS条件进行测定，结果如下见表4
表4 四种方法提取得率及各提取物中β-榄香烯含量测定结果
超临界CO2萃取物中鉴定出39个成分，萃取物中含有较多的挥发油，其中β-榄香烯、叩巴烯、大根香叶烯、γ-榄香烯等含量较高；除含有挥发油外，还含有较多五环三萜等树脂成分。
水蒸气蒸馏物中鉴定出32个成分，绝大部分为挥发性强的单萜、倍半萜等挥发油，挥发油中β-榄香烯含量最高。
超声和索氏提取物中分别鉴定出27个和30个成分，提取物中较多的为挥发油，其中β-榄香烯含量均为最高。
由上述分析可见，SFE-CO2得率和萃取物中β-榄香烯含量较高，且其中成分种类多，除含有效部位挥发油外还含有树脂等成分，同时又避免了提取过程中的高温和有机溶剂残留，总体评价该法优于其它三种提取方法，故初步确定采取SFE-CO2没药。
2.没药SFE-CO2提取工艺研究采用正交法设计提取工艺，GC测定提取物中有效成分β-榄香烯含量并进行综合评价确定最佳提取工艺参数。
(1)正交试验设计参考相关文献，以L9(34)进行正交设计，选择对萃取过程影响较大的萃取压力(A)，温度(B)和时间(C)三因素，A、B和C各水平分别为15、20和25Mpa；35、45和55℃；2、3和6h。
(2)GC测定方法及结果Agilent6890N气相色谱仪，FID检测器，载气氮气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25um；升温程序150℃，2℃/分钟，250℃；柱前压65Kpa；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃。
①β-榄香烯标准曲线的绘制吸取β-榄香烯对照品适量，精密称定，以丙酮为溶剂，配成8.860mg/ml的标准溶液，精密量取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml置1ml容量瓶中，分别用丙酮定容，取上述稀释后的梯度溶液1μl进样测定，经计算得回归方程为y＝19321x+4214.1，r＝0.9995；β-榄香烯在0.8860～7.0880μg间呈良好线性关系。
②GC含量测定取萃取物各70mg，精密称定，置2ml容量瓶中以丙酮溶解并定容，分别吸取上述各溶液2μl，依上述GC条件测定，并计算供试品中β-榄香烯的含量，正交结果表明影响得率的主要因素为萃取时间(C)、其次为压力(A)和温度(B)；以得率为指标得最佳工艺为压力15Mpa，温度45℃，萃取时间4小时。对β-榄香烯含量的影响因素大小次序为萃取压力、温度和时间；以β-榄香烯含量为指标得最佳工艺为压力25Mpa，温度35℃，时间3小时。由于以得率和β-榄香烯含量为指标得出的最佳工艺不完全一致，故进行综合评分(对得率和β-榄香烯含量进行加权评分)以优选其工艺；对综合得分影响大小次序为萃取压力、时间和温度，以综合得分为指标得最优选工艺为A2B3C2，即萃取压力25Mpa，温度45℃，萃取时间4小时。
对比例5基质处方和制备工艺采用正交设计法，以初粘性、持粘性和剥离强度为指标进行综合评价，确定巴布膏基质处方，原料为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸钠(PNA)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和甘油。
据预试验结果，设定各因素水平如下见表5表5 因素水平表
1.基质处方评价指标取各正交样品，进行以下指标的测定。
(1)快粘力测定快粘力是指样品在较小的压力下粘附在被粘物上的能力。测定方法如下将样品仅靠自身重力轻轻粘附于不锈钢板上，以约300±20mm·min-1的速度拉开，剥离角度为90度，样品从不锈钢板上剥离的力即为快粘力，测定3贴，取均值。
(2)持粘性测定取样品，揭去保护膜，贴于不锈钢板上，然后在样品上用金属棒(重2000±50g，外层裹有橡胶层)以300mm·min-1的速度压一个往返，放置20分钟以上，供试品长度方向接于拉力器上，以300±20mm·min-1的速度拉动，记录供试品脱落时的拉力即可，测定3贴，取均值。
(3)剥离强度测定取样品，揭去保护膜，贴于不锈钢板上，然后在样品上用金属棒(重2000±50g，外层裹有橡胶层)以300mm·min-1的速度压一个往返，放置20分钟以上，在样品的一端做180度的折返，同时把粘附部分揭起25mm，接于拉力器上，以300±20mm·min-1的速度拉下。每隔20mm读数一次，共读4次，测定三个不同样品，求出12个测定值的均值即可。
分析结果表明，各因素对对初粘性和剥离强度均无显著影响；PNA对持粘性较显著(p＜0.01)影响、甘油对持粘性显著(p＜0.05)影响；而以各单指标得出的最佳处方配比不尽一致，故对三种指标进行了加权评分，综合得分的方差分析结果表明各因素对其无显著影响；因此对结果进行直观分析并综合考虑初粘性、持粘性和剥离强度对巴布膏性能的影响，得止痛巴布膏基质最佳处方PVP∶PNA∶CMC-Na∶甘油＝1∶2∶1∶8。
对比例6体外透皮吸收1.透皮试验把止痛巴布膏样品剪成接受池口大小相等的圆形，紧密粘贴在大鼠离体皮肤上后置于盛满接受液的接受池(16ml)上，使液面与皮肤真皮一侧接触良好，将扩散室置巴布膏上方，固定好扩散室(直径为1.5cm)，置透皮扩散仪(32±0.5℃，300rpm·min-1)中，分别于1、2、4、6、8、12、24小时后吸取5ml接受液，之后立即补加相同体积的新鲜接受液。
2.测定方法取各时间点接受液2ml，加过氧化氢溶液2.5ml，再加入2.0ml硝酸，水定容置10ml，即为测砷的供试品溶液；取各时间点所取接受液2ml，以乙酸乙酯萃取3次，每次3ml，合并萃取液，低温挥尽溶剂，残渣以乙酸乙酯溶解并定容为1ml，微孔滤膜过滤即为测定乙酸正辛酯、β-榄香烯和冰片的供试品溶液。取各供试液依以下条件进行测定雄黄测定条件AF-610A型原子荧光光谱仪，PMT电压260V，HCL主阴极电流80mA，载气流量600ml·min-1，进样体积1ml，原子化温度220℃，原子化器高度7mm，泵速90r·min-1，采样时间7秒，检测波长为193.7nm。
乙酸辛酯、β-榄香烯和冰片测定条件Agilent6890N气相色谱仪，FID检测器，载气氮气，HP-5MS毛细管石英柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；升温程序150℃，2℃·min-1，250℃；柱前压65Kpa；分流比50∶1，气化室温度250℃，检测器温度250℃；进样量2μl。
止痛巴布膏中各成分累计渗透量Q根据以下公式计算Q=16cnΣi=1n-15CiA.]]>上式中，Cn为第n个取样点浓度(μg·ml-1)，Ci为第i个取样点浓度(μg·ml-1)，A为渗透面积(cm2)。以Q对时间t作线性回归，所得Q-t直线方程的斜率即为透皮速率常数J(μg·cm2·h-1)。
结果见图5，由图5可见，在所研究范围内，氮酮(Azone)浓度为3％时各成分加权渗透速率最大，故止痛巴布膏中透皮吸收促进剂氮酮的浓度为3％时促渗效果最佳。
以下通过试验例来进一步阐述本发明方法制备的止痛巴布膏的有益效果，同时试验例还包括了本发明方法制备的药物的药理毒理试验和临床疗效观察试验。
试验例1本发明方法制备的止痛巴布膏镇痛止痛作用试验方法一热板法将恒温器调节至55±0.5℃，金属盘的底部完全接触水面，加热后作为热板，用秒表记录小白鼠自投入热板至出现舔后足的时间(秒)作为此小白鼠的痛阈值。取小鼠50只，♀，称重，随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、阳性药(乙酰水杨酸)组和供试品大、中、小剂量组。给药前先测定每只小白鼠的痛阈值二次，以平均值不超过30秒者为合格，取平均值作为给药前的阈值。然后按组分别给药，乙酰水杨酸组按0.2g·kg-1的剂量灌胃给药，对照组及大、中、小剂量组在腹部涂基质及供试品，对照组涂基质30g·kg-1，大剂量涂以含生药0.72g生药/g的本发明方法制备的止痛巴布膏30g·kg-1，中、小剂量依次减半，给药后30、60分钟复测上述指标，如痛阈值超过60秒，则停止测试并按60秒计，按下式计算痛阈提高百分率。
实验结果与对照组比较进行t检验统计处理和分析。
结果显示给小白鼠外用后，大、中剂量组动物的痛阈值在60分钟时比给药前均有显著提高(P＜0.01)，小剂量组在给药后30分钟、60分钟时有明显提高(P＜0.05)；乙酰水杨酸的小白鼠痛阈值在给药后60分钟时有显著提高(P＜0.001)。其中，乙酰水杨酸组给药后60分钟痛阈提高百分率达到50％以上。大、中剂量组给药后30分钟达到30％以上，表示止痛巴布膏具有一定的镇痛作用。
试验方法二扭体法取小鼠50只，雌雄各半，称重，并随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、乙酰水杨酸阳性药组和止痛巴布膏大、中、小剂量组。止痛巴布膏大剂量为2.2g生药/kg，中、小剂量分别为1.1、0.55g生药/kg，乙酰水杨酸灌胃给药，剂量为0.2g·kg-1，给药后1小时各鼠分别腹腔注射0.5％醋酸0.2mL。观察10分钟内各组小白鼠出现扭体反应的潜伏期和扭体次数。实验结果进行t检验统计处理。
结果显示腹腔注射醋酸后可引起小鼠腹腔疼痛，出现扭体反应。给小白鼠敷用大、中剂量的本发明方法制备的止痛巴布膏后，各组动物的扭体次数明显低于对照组(P＜0.05)；并且大剂量组显著延长小鼠出现扭体反应的时间。表明本发明方法制备的止痛巴布膏有明显抑制疼痛的作用，并随剂量增加而作用加强，呈现一定的量效关系。
试验例二本发明方法制备的止痛巴布膏皮肤急性毒性及刺激性试验试验用新西兰大耳白兔完整皮肤及破损皮肤大剂量接触止痛巴布膏，所产生的毒性反应和一次和多次接触止痛巴布膏后产生的局部刺激反应结果总结如下本发明方法制备的止痛巴布膏破损皮肤组新西兰大耳白兔给药后24～48小时内的活动有所减少，精神萎靡不振，进食减少，在除去残留的受试物后1小时内给药部位的皮肤可见明显的红斑，24小时后皮肤红斑减轻48小时时皮肤红斑基本消失，72小时至第7日恢复正常；每日动物的皮肤毛发、眼和粘膜未见明显的异常变化，呼吸正常，中枢神经系统、四肢活动等均正常，未见其它异常病变，无动物死亡。
巴布膏基质对照组新西兰大耳白兔在除去残留的受试物后1、24、48、72小时至第7日未见皮肤红斑、色素沉着等变化，皮肤毛发、眼和粘膜、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等均正常，未见其它病变和动物死亡。
一次皮肤刺激性实验显示本发明方法制备的止痛巴布膏对新西兰大耳白兔完好皮肤未见明显刺激性；对新西兰大耳白兔破损皮肤在去除止痛巴布膏后1小时可见轻度刺激性，主要是破损处轻度红斑可见，6小时以后逐渐恢复至正常。巴布膏基质的作用及其强度基本同止痛巴布膏，初步认为基质对新西兰大耳白兔的破损皮肤有轻度的刺激性，而药物有效成份未见明显的刺激性。
多次给药刺激性结果表明，本发明方法制备的止痛巴布膏对新西兰大耳白兔完好皮肤未见明显刺激性；对新西兰大耳白兔破损皮肤在给药起至第4天可见轻度刺激性，第5天后恢复至正常。基质的作用及其强度基本同止痛巴布膏，初步认为基质对新西兰大耳白兔的破损皮肤有轻度的刺激性，而药物有效成分未见明显的刺激性。
试验例3本发明方法制备的止痛巴布膏对癌痛的临床观察1.一般资料20例门诊及部分住院患者，病人中，男性13例，女性7例，年龄24～75岁，其中肝癌5例，食道癌1例，胃癌6例，肺癌2例，胰头癌2例，子宫癌2例，前列腺癌1例，胆囊癌1例；20例中手术病理诊断4例，CT影像诊断12例，胃镜病理诊断4例，其中中期癌症2例，晚期癌症18例，同时包含肿瘤转移的6例。
2.治疗方法(1)将止痛巴布膏贴于肿瘤患部，每次一贴，三天更换一次，2～3次为一个疗程。
(2)疼痛的分级及疗效的评价，按卫生部药政局制定的癌症病人三阶梯止痛疗法的指导原则。
3.疗效评价标准按划线法将疼痛分为0～10度，根据记录分为完全缓解(CR)治疗后完全无痛。
部分缓解(PR)疼痛较给药前明显减轻，睡眠基本上不受干扰，能正常生活。
轻度缓解(MR)疼痛较给药前减轻，但仍感明显疼痛，睡眠仍受干扰。
无效(NP)与治疗前比较无减轻。
4.结果本发明方法制备的止痛巴布膏对20例癌症病人治疗结果表明完全缓解11例，明显缓解3例，轻度缓解4例，无效2例；同时镇痛起效时间，短者贴药后20分钟疼痛缓解，长者1小时内起效，且给药期间未发现毒副作用。
本发明方法制备的止痛巴布膏临床疗效观察
权利要求
1.一种止痛巴布膏的制备方法，包括以下步骤A)取雄黄，捡去杂质，先粗粉碎，将其微粉化至50％的颗粒粒径小于5μm，备用；B)取三七，粉碎成粗粉，用65％～75％乙醇回流提取两次，每次加醇7～9倍药材重量，每次提取1～2小时，合并回流液，减压回收乙醇至含药量为0.3～0.5g·ml-1，提取液通过大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性，然后用6～8倍柱体积的50％～55％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得三七总皂苷浸膏，备用；C)萃取乳香得萃取物，备用；D)萃取没药得萃取物，备用；E)取冰片用乙醇溶解后和上述雄黄超微粉、三七总皂苷浸膏、乳香萃取物、没药萃取物及透皮吸收促进剂一起加入已混匀的空白基质中，搅拌均匀并涂布于裱背材料上，加盖保护膜，切割后，封装即得止痛巴布膏。
2.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤A)中所述的微粉化方法为乳钵研磨法、高剪切乳化法、球磨法或气流粉碎法。
3.根据权利要求2所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤A)中所述的气流粉碎法为初步水飞后在40～60℃温度条件下烘干，用气流粉碎机粉碎至50％的颗粒粒径小于5μm得雄黄超微粉。
4.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤B)中所述的大孔吸附树脂柱为AB-8大孔吸附树脂柱或D101大孔吸附树脂柱。
5.根据权利要求1或4所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤B)中所述的提取液通过大孔吸附树脂柱时循环三次。
6.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤C)中所述的乳香萃取方法为超临界CO2萃取法、水蒸气蒸馏法、超声提取法或索氏提取法。
7.根据权利要求6所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于所述的超临界CO2萃取法的萃取条件为萃取压力20～30Mpa、温度40～60℃、萃取时间4～8小时。
8.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤D)中所述的没药的萃取方法为超临界CO2萃取法、水蒸气蒸馏法、超声提取法或索氏提取法。
9.根据权利要求8所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于所述的超临界CO2萃取法的萃取条件为萃取压力20～30Mpa、温度40～60℃、萃取时间4～6小时。
10.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤E)中所述的空白基质是用重量配比为聚乙烯吡咯烷酮∶聚丙烯酸钠∶羧甲基纤维素钠∶甘油＝1∶2∶1∶8的原料混合均匀后制得。
11.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤E)中所述的透皮吸收促进剂为质量百分浓度2～4％的氮酮。
12.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于步骤E)中所述的裱背材料上药物的涂附厚度为0.5～1mm，每块药膏的切割尺寸为7×10cm。
13.根据权利要求1所述的止痛巴布膏的制备方法，其特征在于包括以下步骤A)取雄黄，捡去杂质，粗粉碎，初步水飞后在60℃温度条件下烘干，用气流粉碎机粉碎至50％的颗粒粒径小于5μm得雄黄超微粉，备用；B)取三七，粉碎成粗粉，用70％乙醇回流提取两次，每次加醇8倍量，每次提取1.5小时，合并回流液，减压回收乙醇至含药量为0.3～0.5g·ml-1，提取液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗至流出液Molish反应呈阴性，然后用6倍柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得三七总皂苷浸膏，备用；C)用超临界CO2萃取法在萃取压力25Mpa、温度45℃、萃取时间6小时条件下萃取乳香，得萃取物，备用；D)用超临界CO2萃取法在萃取压力25Mpa、温度45℃、萃取时间4小时条件下萃取没药，得萃取物，备用；E)取冰片用乙醇溶解后和上述雄黄超微粉、三七总皂苷浸膏、乳香萃取物、没药萃取物及质量百分浓度3％的氮酮一起加入用重量配比为聚乙烯吡咯烷酮∶聚丙烯酸钠∶羧甲基纤维素钠∶甘油＝1∶2∶1∶8的原料混合均匀后制得的空白基质中，搅拌均匀并涂布于裱背材料上，涂附厚度为0.5～1mm，加盖保护膜，每块药膏切割为7×10cm尺寸，封装即得止痛巴布膏。
全文摘要
本发明公开了一种以中草药为原料制备的止痛巴布膏的制备方法，属于中药领域，该方法制备的止痛巴布膏具有载药量高、生物相容性好、透气性和保湿性好、无过敏性和利于透皮吸收等优点，同时还具有较好的止痛作用，可广泛应用于临床，该方法通过雄黄超微粉碎、三七的提取、乳香和没药萃取、冰片处理等步骤，再加透皮吸收促进剂与基质混合均匀后涂布于裱背材料上，加盖保护膜，切割后，封装即制得止痛巴布膏。
文档编号A61K9/70GK1723978SQ20051004107
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月18日 优先权日2005年7月18日
发明者贾晓斌, 朱启勇, 陈彦, 王勇 申请人:江苏省中医药研究院