专利名称：一种含基质细胞衍生因子－1与免疫球蛋白－Fc段双重活性的蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术-重组基因工程领域。更具体地说，本发明涉及用重组基因工程与细胞培养的方法生产一种含基质细胞衍生因子-1与免疫球蛋白-Fc段双重生物活性的全新的多肽蛋白质(SDF1-Fc)。
背景技术：
肿瘤发生转移是影响临床疗效及肿瘤患者预后的一大因素。在生物学上肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发的部位脱落后再迁移、扩散至身体其它部位并形成新的病灶的过程。肿瘤细胞的转移途径与炎症反应时的炎症细胞(如淋巴细胞)的迁移途径非常相似两者均伴有一穿透血管管壁或淋巴管管壁的关键步骤。肿瘤细胞/炎症反应细胞经穿透血管管壁或淋巴管管壁而达到迁移部位是一主动、耗能和多步骤的过程，并受多种因素影响(1)。近年的研究证明肿瘤细胞能在较短时间里(一般历程2-4小时)完成穿透血管壁或淋巴管管壁再定向迁移(即趋化)到身体其它部位的关键是体内特定组织能在一定的时间里不断分泌多种趋化因子(2)(chemokines)，而待迁移的肿瘤细胞或炎症反应细胞则表达其相应的特异性受体(即趋化因子受体)(3-4)。
趋化因子是一类结构性相似、分子量为8-11 Kda的蛋白质多肽； 由多种组织细胞分泌表达(2)。在结构上，趋化因子均含有保守的半胱氨酸残基，而以半胱氨酸残基形成的二硫键在维持其蛋白质三级构象及生物活性上起关键作用。依其蛋白质多肽顺序中前面两个半胱氨酸的位置，趋化因子可分为三大类即C-C，C-X-C和C-X3-C趋化因子。在目前已知的40多个趋化因子中，基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)在肿瘤及炎症细胞迁移过程中最为特殊与重要(5-9)。SDF-1(又名为CXCL12，结构上属于C-X-C家族成员)由多种组织的基质细胞表达及分泌；其已知的唯一天然受体是CXCR4(10-13)。SDF1通过与CXCR4结合产生传导和趋化信号，进而诱导CXCR4表达阳性的细胞发生变型、变长直至完成穿透血管内皮细胞间隙，最终达到新的组织部位。与其他趋化因子受体一样，CXCR4也是属于7次跨膜结构域G蛋白偶联受体家族成员，其表达具组织细胞特异性(9-12)。此外，多种恶性肿瘤如乳腺癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病及多发性骨髓瘤等癌细胞具有CXCR4的高水平表达；而伴有CXCR4过度表达的肿瘤细胞常发生转移(13-17)。近年更有实验表明如抑制或降低肿瘤细胞表达CXCR4的水平，则可达到抑制肿瘤细胞在体内转移与复发的效果。例如美国DNAX研究所成员Muller A.et al.于2002年报道通过向实验小鼠体内注射抗人CXCR4单克隆抗体方式，取得降低人乳腺癌细胞MCF7上的CXCR4的表达水平，并进而达到抑制该乳腺癌细胞向肺、骨髓等脏器的转移、积聚与生长(14)。
CXCR4同时亦是人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)侵入靶细胞如CD4+T细胞的最重要辅助受体之一(18)。在HIV1/CD4+T细胞的培养液中加入SDF1，可竞争性地拮抗HIV-1与CD4+T细胞膜上CXCR4结合，从而保护T细胞免遭HIV-1病毒的(19-20)。
近来的研究揭示SDF-1可分为三个主要功能区即N-端趋化因子功能区，中端β片层结构区和C-端α螺旋结构区(21-22)。N-端区是SDF-1与CXCR4结合与活化的主要结构关键；C末端α螺旋结构对于维持SDF-1的构象和生物活性起着重要的作用(21-22)。但天然的SDF1体内含量低，且分子量小、稳定性差，故其分离提取与应用受到限制。而某些经修饰改造的趋化因子如去C端α螺旋的突变产物SDF-1/54R(23，杜军等中国发明专利申请号03146833.0)虽保留有与CXCR4的亲和结合的力及诱导CXCR4内在化，但因丧失SDF-1介导的信号传导和趋化作用，其应用范围也有一定的限制。因此，开发研究出一种既保持有如天然SDF-1样的生物活性，又具有高度稳定及便于分离提取等其他特征的SDF-1结构变体或以其衍生物以替代天然SDF-1应具有更为广泛的使用价值。
本发明报道了一种含基质细胞衍生因子-1与免疫球蛋白-Fc段双重生物活性的全新的蛋白质(SDF1-Fc)。本发明的SDF1-Fc蛋白质通过采用重组DNA方法将SDF1基因与免疫球蛋白-Fc段基因相连，定向插入到表达载体，再转入到宿主细胞里进行表达而生产。本发明的SDF1-Fc蛋白为抗体样大分子物质，便于检测分离；可广泛用于如体内外检测SDF-1的配体或受体及用于干预肿瘤细胞/炎症反应细胞的迁移及HIV病毒感染等。
发明内容
本发明是选取在肿瘤细胞及炎症反应细胞迁移过程中起着非常重要作用的基质细胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)及其唯一的天然受体CXCR4为靶点，以基因工程/细胞工程为手段开发生产出基质细胞衍生因子-1与免疫球蛋-Fc段相连的蛋白质(SDF1-Fc)。本发明的SDF1-Fc蛋白质为抗体样大分子物质，具有如基因序列表1所示的氨基酸序列。本发明的SDF1-Fc蛋白稳定性强及便于检测分离，具有较为广泛的用途。
本发明的具体内容如下1.含SDF1-Fc重组基因的表达载体的构建。
构建含SDF1-Fc重组基因的表达载体的具体技术与操作方法与一般重组基因工程相同。鉴于SDF1-Fc蛋白具有分子量大、含二硫键(S_S)及糖基，其生产方式以采用由真核细胞如哺乳动物细胞分泌性表达生产为理想。细胞分泌性表达生产SDF1-Fc蛋白的一大优点是生产的蛋白可集聚于细胞培养上清液中，便于回收分离。
保证细胞分泌性表达生产SDF1-Fc蛋白的一大关键因素是需要一段信号肽(signalpeptide)以引导新合成的蛋白质穿透内质网，并最终分泌到细胞外间质。信号肽的编码来源可来自SDF-1基因本身、免疫球蛋白基因、或其他外源基因如IL-2等基因。本发明的SDF1-Fc蛋白中的免疫球蛋白Fc段可以来自于IgG、IgM、IgA或IgD任一型。根据融合蛋白的主要用途不同，SDF1-Fc重组基因的构建可以是全人源的(即SDF-1及Fc基因来只于人)、全鼠源的(即SDF-1及Fc基因来只于鼠)、或人鼠相嵌的(即SDF-1及Fc基因可来源于人和鼠)。
SDF1-Fc重组基因表达载体的具体构建可分为两大部分1)克隆获得免疫球蛋白-Fc段基因，并将其定向插入到真核细胞表达载体，获得含免疫球蛋-Fc段基因的过渡载体，2)克隆获得SDF1基因，并将其与含免疫球蛋白-Fc段基因的过渡载体相连，从而获得带SDF1-Fc重组基因的表达载体。
1a.免疫球蛋白-Fc段基因的克隆扩增及其表达载体的构建本发明的SDF1-Fc蛋白的免疫球蛋白-Fc段基因编码可以从人类cDNA或基因组DNA库中以逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)或PCR扩增获得。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的免疫球蛋白-Fc段基因的核苷酸序列以体外合成方式获得。克隆获得的基因片段经限制性内切酶酶切处理后，再用T4连接酶将其与经相应的酶切处理的表达载体相连，经转入感受态细菌扩增，再经提取质粒DNA及酶切鉴定，即获得含免疫球蛋白-Fc段基因的表达载体。可用于真核细胞表达SDF1-Fc基因的载体包括pcDNA3.1(Invitrogen)，逆转录病毒载体pLXSN(Clonetech)等。该类表达载体的特征是包括真核细胞表达启动子/增强子hCMV启动子、5’LTR及polyA等序列在内。
1b.SDF1基因的克隆扩增及SDF1-Fc重组基因表达载体的构建本发明的SDF1-Fc蛋白中的SDF-1基因编码可从人类cDNA或基因组DNA库中以RT-PCR或PCR扩增方法获得。用于PCR的上、下游引物可参照已报道的SDF1基因核苷酸序列以体外合成方式获得。扩增获得的SDF-1基因片段经限制性内切酶酶切处理，再用T4连接酶将其定向插入到上述的含免疫球蛋-Fc段基因的表达载体中，从而获得带SDF1-Fc重组基因的载体。理想的SDF1-Fc重组基因的连接顺序(从5‘到3‘)是SDF1-Fc。重组的SDF1-Fc基因保持有维一开放读框(open-reading frame，ORF)。该ORF的编码起始于SDF-1的信号肽，终止于免疫球蛋白Fc端CH3区。
2.SDF1-Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达生产SDF1-Fc蛋白的表达生产以在哺乳动物细胞中为理想。常用的哺乳动物细胞有CHO，COS-7，Hela，HEK-293等。保证SDF1-Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的高效稳定表达的关键因素是1)高效地将表达载体转染入细胞内；2)筛选与扩增出高表达细胞株。
将SDF1-Fc表达载体转染入哺乳动物细胞(如CHO细胞)有两种主要方式即瞬时转染与稳定转染。稳定转染的细胞因可进一步用于筛选与扩增高表达细胞株，在本发明实施中为优选。稳定转染常用的方法包磷酸钙法；阳离子脂质体法；病毒介导法及电穿孔法等。
SDF1-Fc基因在转染细胞里的表达可以用免疫组化方法进行检测；也可以通过免疫印迹试验及ELISA方法直接定性及定量检测转染的细胞培养液中的SDF1-Fc融合蛋白。经检测确认转染细胞表达及分泌SDF1-Fc蛋白后，转染的细胞则转入含筛选药物如G418的培养液中进行筛选。筛选出的表达细胞株再扩增培养，并收集其培养上清液。收集的培养液用于分离提取SDF1-Fc蛋白。
3.SDF1-Fc蛋白的分离提取及其理化与生物活性鉴定SDF1-Fc蛋白可以用免疫亲和层析柱法从收集的转染细胞培养液中分离提取。用于分离提取SDF1-Fc融合蛋白的常用免疫亲和层析柱有protein-A或protein-G亲和层析柱。如以Protein-G免疫亲和层析法柱分离提取SDF1-Fc融合蛋白，其操作步骤如下取收集的细胞培养上清液，经离心及以0.45μm滤膜过滤后，将滤液上样置Protein G-亲合层析柱，SDF1-Fc融合蛋白因其Fc段与protein-G的非共价的耦联，被特异吸附于亲合层吸柱中。层吸柱先以PBS洗脱去除杂蛋白，再以低pH液(如pH2.7，0.1M甘氨酸)洗脱被吸附的蛋白。再经调节pH至7.0及对PBS透析后即获得纯化的SDF1-Fc蛋白。
分离提取的SDF1-Fc蛋白可以用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)，结合考马斯亮蓝染色或免疫印迹试验及ELISA等方法加以鉴定。
本发明的SDF1-Fc蛋白的一大特征是其保持有与SDF-1的天然受体CXCR4相特异结合的生物活性。鉴定SDF1-Fc蛋白与CXCR4相结合的一方法如下先以含CXCR4基因的表达载体转染入哺乳动物细胞如CHO细胞，24-48h后，转染的CHO细胞经1×PBS液漂洗及以固定后，分别加入含SDF1-Fc融合蛋白或Fc蛋白，25℃孵育1-2h，以PBS液洗脱，再加入酶标记的抗人IgG-Fc抗体，25℃孵育1-2h，再以PBS液洗脱，然后加入显色液，室温至显色，于显微镜下观察显色结果。如加入SDF1-Fc融合蛋白的孔有显色阳性的细胞，而加入Fc蛋白的孔里细胞应无显色，证明SDF1-Fc融合蛋白保持有与CXCR4受体相特异结合的生物活性。
4.SDF1-Fc蛋白的应用本发明的SDF1-Fc蛋白因具有SDF1与免疫球蛋白-Fc段的双重生物活性，可作为SDF-1的替代物或竞争性抑制剂，广泛用于如体内外检测CXCR4受体的表达；用于体内外吸附、分离清除CXCR4阳性的细胞/组织及用于干预HIV病毒感染等。其具体的应用说明如下4a.SDF1-Fc蛋白作为试剂用于体内外检测CXCR4的表达水平已知的SDF-1的唯一天然受体是CXCR4。本发明的SDF1-Fc蛋白可作为试剂用于体内外检测及CXCR4的表达水平。被检测的CXCR4分子可以是以膜蛋白形式表达于细胞/组织中，或以流离降级的可溶性分子存在于体液(如血清、血浆、唾液等)，或细胞培养上清液中。
作为检测试剂，SDF1-Fc蛋白可有标记处理的及未标记处理的两种主要形式存在。常用于标记SDF1-Fc蛋白的标记物包括酶(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，微过氧化物酶)；荧光素(异硫氰酸荧光素，FITC)；生物素-抗生物素及胶体金等。经标记的SDF1-Fc蛋白，可作为试剂直接用免疫酶组化、免疫荧光或免疫印迹等方法来进行体内外检测CXCR4的表达。如以辣根过氧化物酶标记的SDF1-Fc蛋白为试剂，用免疫酶组化方法来体外检测肿瘤组织病理切片中的CXCR4的表达为例，其步骤如下取肿瘤组织病理切片及正常组织切片，去蜡处理，1×PBS液漂洗及固定后，加入辣根过氧化物酶记的SDF1-Fc融合蛋白，25℃孵育1-2h，以PBS液洗脱，然后加入显色液，室温静置至显色，再于显微镜下观察切片显色结果。根据显色结果并与正常组织切片相比较，可判断肿瘤组织CXCR4的表达水平。
未标记处理的SDF1-Fc蛋白也可与其他已标记的试剂合并作为试剂盒成分，用于体外检测CXCR4的表达。其他标记的试剂可以是酶标或荧光标记的抗免疫球蛋白Fc段抗体，酶标或荧光标记的protein-A/protein-G蛋白，酶标或荧光标记的抗人CXCR4抗体等。如以未标记的SDF1-Fc融合蛋白与酶标记的鼠抗人CXCR4单克隆抗体合并组成试剂盒，用夹心ELISA法来检测体液(如血清、细胞悬液、细胞培养上清液)中的CXCR4的表达水平为例，其检测步骤如下先用SDF1-Fc蛋白包被ELISA板，4℃过夜，经1×PBS液漂洗及2％BSA液室温封闭1～2h后，分别加入待检的样品如血清，37℃孵育1-2h，经PBS液洗脱后，再加入酶标记的鼠抗人CXCR4抗体，37℃孵育1-2h，PBS液洗脱后，加入显色液，室温至显色，再以酶联免疫仪测定特定波长处各孔的吸光值。根据OD值并与CXCR4正常参照物相比较，可估测待检的样品中流离或降级的CXCR4水平。
4b.SDF1-Fc蛋白用于体内外吸附及分离CXCR4表达阳性细胞与组织SDF1-Fc蛋白可作为SDF1的替代物，用于体内外吸附与分离CXCR4表达阳性的细胞与组织。如用SDF1-Fc蛋白体外吸附分离CXCR4表达阳性的细胞与组织为例，可先将SDF1-Fc融合蛋白吸附在适当的固相载体上(固相载体包括如细胞培养板，细胞培养皿，硝酸纤维素膜等)，再加入含CXCR4表达阳性的细胞或组织，4℃孵育1-2h，再以1×PBS液洗脱，即达到吸附与分离CXCR4表达阳性细胞或组织成分的目的。
分离纯化后的SDF1-Fc蛋白还可通过先浸置与吸附于医用纱布或绑带上，再贴于如外伤、炎症或外科手术创面，达到吸引CXCR4表达阳性细胞迁移至伤口处的目的。
4c.SDF1-Fc蛋白用于干预HIV病毒感染人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)通过其外膜蛋白gp120与其靶细胞表面的CD4+受体与CXCR4辅助受体的相互作用而吸附并进入靶细胞，而产生感染。SDF-1及其衍生物因其与CXCR4分子的高亲和力结合，可竞争性地抑制HIV外膜蛋白gp120与CXCR4受体的相互结合，从而阻止HIV与感染靶细胞融合。本发明的SDF1-Fc蛋白既保持与CXCR4分子的高亲和力结合的活性，又有如免疫球蛋白样的在体内外半衰期长，稳定性高等优点及Fc段介导的细胞毒效应功能(ADCC)及补体激活效应功能。因此，在阻止HIV外膜蛋白gp120与CXCR4受体的相互结合上，SDF1-Fc蛋白应是一理想的大分子生物拮抗剂，可用于开发成为干预HIV病毒感染的医药制剂。
4d.SDF1-Fc蛋白用于建立肿瘤细胞或炎症细胞的体外迁移模型并以该模型开展抗肿瘤细胞迁移或抗炎症反应细胞迁移药物成分的筛选本发明中的SDF1-Fc蛋白可作为SDF-1的替代物用于建立模拟SDF-1介导的肿瘤细胞或炎症细胞体外迁移模型。迁移模型的建立可采用微孔隔离膜双层培养板方式。微孔双层培养板中的隔离膜的孔经大小为4-10um，肿瘤细胞或炎症细胞在无趋化因子条件下不会自由穿透隔离膜。而在有SDF-1趋化因子或SDF1-Fc融合蛋白的介导下，置于隔离膜上层的肿瘤细胞将发生变型、变长等一系列变化，直至穿透隔离膜微孔，达到向趋化因子集聚部位(培养板下层)的迁移。完成迁移的细胞可在显微镜下观察及计数。
建立起的SDF1-Fc融合蛋白介导的肿瘤细胞体外迁移模型可进一步用于进行抗肿瘤细胞迁移抗炎症细胞迁移药物成分的快速筛选。被筛选的物质成分可包括抗体及各种蛋白质、多肽、中草药提取物及各种小分子化合物等。如以该迁移模型从中草药提取物中筛选抗肿瘤细胞迁移药物成分为例，其方法如下先将CXCR4表达阳性的肿瘤细胞如HL60细胞置于微孔隔离膜上层，将SDF1-Fc融合蛋白加入下层各孔。其中一孔不加SDF1-Fc融合蛋白为阴性对照；一孔只加SDF1-Fc融合蛋白为阳性对照；其余各孔依次加入不同溶度的待筛选的中草药提取物。37℃共孵育4-24h，期间在显微镜下观察各孔中的完成穿透微孔隔离膜的肿瘤细胞并计数。各孔结果经与只加SDF1-Fc蛋白的阳性对照组的计数结果相对比，可推断被筛选药物的拮抗/抑制肿瘤迁移的相对活性。根据拮抗/抑制肿瘤迁移的比例，被筛选的成分可归为无拮抗/抑制(抑制肿瘤迁移的比例在25％以下)；低度拮抗/抑制(25-50％)，中度拮抗/抑制(50-75％，)及高度拮抗/抑制(75％以上)。对具有中度以上拮抗/抑制的成分可再对其进行包括药物结构分析、体外细胞毒性实验、动物毒理与药理等一系列临床前研究。
依同法，建立的SDF1-Fc融合蛋白介导的迁移模型可用于抗炎症反应细胞迁移药物成分的快速筛选。
图1构建的含SDF1-Fc重组基因的表达质粒(pQY-SDFIg)图谱。
图1中的SDF1为人基质细胞衍生因子-1 cDNA；Ig为人免疫球蛋白Fc段cDNA。
图2内切酶酶切鉴定SDF1-Fc重组基因表达质粒结果(1.5％琼脂糖电泳图谱)。
其中泳道条带1为100 bp DNA标准(购自Promga)，泳道条带2为pQY-SDF1Ig质粒经HinDIII及XhoI双酶切产物；泳道条带3为pQY-SDF1Ig质粒经HinD III及BamH I双酶切产物；泳道条带4为250 bp DNA标准(购自上海博光生物技术有限公司)。
图3免疫组化试验检测SDF1-Fc重组基因在转染细胞中的表达。
图3a为CHO细胞转染含SDF1-Fc重组基因质粒的显色结果；图3b为CHO细胞转染空白对照质粒转染的显色结果。
图4免疫印迹试验(Western blotting)鉴定转染细胞上清液中的SDF1-Fc融合蛋白。
图中的Marker为蛋白质分子量标准，see-blue2 markers(Invitrogen)。样品条带1为空白对照转染的CHO细胞上清液样品；样品条带2为pQY-SDF1Ig转染的CHO细胞上清液样品之1号；样品条带3为pQY-SDF1Ig转染的CHO细胞上清液样品之2号。
图5以SDF1-Fc蛋白质为试剂用于检测CXCR4基因在转染细胞中的表达。
图5a为CHO细胞转染含CXCR4-GFP重组基因质粒的显色结果；图5b为CHO细胞转染含GFP对照基因质粒的显色结果。
本发明
具体实施例方式
实施例一含SDF1-Fc重组基因表达载体的构建1.人类免疫球蛋白IgG-Fc段(IgG-Fc)基因片段的克隆。
采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法从健康人外周血单核细胞(PBMCs)中克隆获得人类免疫球蛋白IgG-Fc段基因片段(IgG-Fc)。其具体实施如下取健康人外周血5mL，经Ficol分理出单核细胞(PBMCs)，以TRIzol试剂(Invitrogen)按常规方法从分理出的单核细胞(PBMCs)中提取总RNA。再取1μg总RNA，加入到逆转录酶的反应液里(总体积为20μL，包括5×buffer 4μL、Oligo(dT)引物2μL及10mmol/L dNTP 8μL，RNasin 1μL，反转录酶5U～10U)，经70℃变性10分钟，42℃1小时，42℃30分钟，70℃15分钟，逆转录反应终止，合成得到cDNA。用于PCR扩增人免疫球蛋白IgG1-Fc段的上下游引物序列如下
上游引物(hIg-F)(30 bases-GAG GGA TCC CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT)及下游引物(hIg-R)(30 bases-GTC AGA TCT TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA)。
PCR扩增反应PCR扩增用的Taq酶购自大连TAKARA生物公司。PCR的反应总体积为50μL(包括上述逆转录反应终产物cDNA 2μL，10×Taq酶buffer 5μL、上，下游引物各2μL，10mmol/L dNTP 1μL，RNasin 1μL，Taq酶5U，去离子水37μL)。PCR的反应条件为94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。
PCR产物纯化及酶切取PCR产物经1％琼脂糖电泳，待引物二聚体与扩增片段分离后，切下扩增片段(扩增的人类免疫球蛋白IgG1-Fc段为长度780 bp的cDNA基因外显子部分序列)，再经BamH I和Bg1 II酶切及回收纯化后，用20μ去离子水溶解，置-20℃保存备用。
DNA重组连接及转化感受宿主菌采用以T4 DNA连接酶的方法将上述酶切后的DNA与经同样酶切处理的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)DNA体外相连。连接反应体系总体积为20μL(包口10×T4 DNA连接酶-ATP buffer 2μL、酶切后的PCR扩增片段5μL(1μg)，上述酶切后的表达载体载体2μl(1μg)，T4连接酶1μl，去离子水10μl)。在16℃条件下连接16h后，取2μl连接反应物在4℃条件下转化感受态细菌宿主菌DH5a(50μl/管)30分钟。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定从含Amp筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。第2天，经离心收集细菌，采用碱裂解法小量提取质粒DNA。提取的质粒DNA再经HinD III和Bgl II酶切，进行电泳鉴定，从而获得含免疫球蛋白Fc片段的质粒pQY-Fc2.人类基质细胞衍生因子-1与免疫球蛋白-Fc段重组融合基因(SDF1-Fc)表达载体的构建采用RT-PCR技术从人健康人外周血单核细胞cDNA基因库中克隆出全长为284 bp的人类基质细胞衍生因子-1 cDNA(含该基因外显子大部分序列)。用于PCR扩增SDF1a的上下游引物序列如下上游引物(SDF1-F)(36 bases-GCG AAG CTT GGC GCC ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC)；及下游引物(SDF1-R)(36 bases-GCG GGA TCC AGC TTT CTC CAG GTA CTC CTG AAT CCA)。
PCR扩增反应PCR的反应总体积为50μl(包括上述逆转录反应终产物cDNA 2μl，10×Taq酶buffer 5μl、上，下游引物各2μl，10mmol/L dNTP 1μl，RNasin 1μl，Taq酶5U，去离子水37μl)。PCR的反应条件为94℃预变性2min后，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35个循环，末次循环72℃延伸5min。
PCR产物纯化及酶切取10μl PCR产物经2％琼脂糖电泳分离后，切下扩增片段(含长为284 bp的人类SDF1 cDNA)，再经回收纯化，用HinD III和BamH I酶切，反应完毕后再回收纯化，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。
DNA重组连接及转化感受宿主菌采用以T4 DNA连接酶的方法将上述酶切后的SDF1cDNA与经同样酶切处理的含人类免疫球蛋白IgG-Fc段的表达载体pQY-Fc体外相连接。连接反应体系总体积为20μl(包括10×T4 DNA连接酶-ATP buffer 2μl、酶切后的PCR扩增片段5μl(1μg)，上述酶切后的表达载体载体2μl(1μg)，T4连接酶1μl，去离子水10μl)。在16℃条件下连接16h后，取2μl连接反应物在4℃条件下转化感受态细菌宿主菌DH5a(50μl/管)30分钟。转化结束后，将感受细菌接种于LB/agar培养板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育过夜。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定从含Amp筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。第2天，经离心收集细菌，采用碱裂解法小量提取质粒DNA。含SDF1-Fc重组基因表达质粒(pQY-SDF1Ig)DNA图谱如图1所示。
提取的质粒DNA经HinD III和Xho I双内切酶酶切，或经HinD III和BamH I双内切酶酶切后，再进行电泳鉴定。酶切结果如图2所示HinD III和Xho I双酶切后获得一片断，电泳位置在1.0kb；HinD III和BamH I双酶切后获得一片断，电泳位置在250 bp DNA标准的上端。该酶切结果与图1的pQY-SDF1Ig质粒图谱酶切位点相符合。对酶切证明含SDF1-Fc重组基因的质粒再经测序鉴定，结果表明重组质粒含有方向及序列均正确的SDF1-Fc重组基因。所含的SDF1-Fc重组基因的核苷酸序列见所附的基因序列2；其编码的蛋白质氨基酸序列见所附基因序列3。
实施例二SDF1-Fc重组基因在哺乳动物细胞中的表达生产1.SDF1-Fc重组基因质粒转染入哺乳动物细胞预实验证实CHO细胞不含有内源性SDF1基因表达，可用于体外转染及表达SDF1-Fc重组基因。CHO细胞的转染采用Fugen6(Roche)介导的方法。其步骤如下取对数生长期的CHO细胞，胰酶/5mM EDTA常规消化后，以2×104细胞/孔接种24-孔塑料培养板，37℃，5％CO2培养过夜。第2天，在100μL无血清的DMEM培养基加入2μLFugen6与不同量的SDF1-Fc质粒及阴性对照空载体DNA(1-2μg)混匀，制备成Fugen6-DNA混合液，室温放置15min后，缓慢滴加至CHO细胞中，于37℃、5％CO2条件下培养4-6h后，加入1ml DMEM-5％胎牛血清/孔，培养。转染48～72h后，收集培养细胞上清，并用免疫组化方法检测SDF1-Fc蛋白在细胞中的表达。
2.免疫组化试验检测SDF1-Fc重组基因在转染的细胞中的表达在转染48-72h后，CHO细胞经1×PBS液漂洗及90％甲醇4℃下固定20min后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG-Fc段多克隆抗体(抗体购自Sigma，以1∶200稀释，300ul/孔)，37℃孵育1h，再以PBS液洗脱3次，然后加入显色底物(邻苯二胺及3％H202)，室温静置，至显色反应出现后再于显微镜下观察显色结果。如图3示，含SDF1-Fc重组基因载体转染的CHO细胞样品孔里有5-10％的细胞显色呈阳性反应(图3a)；而以空载体转染的CHO细胞样品孔未见显色阳性细胞(图3b)。此结果说明SDF1-Fc重组基因在转染的CHO细胞里成功表达。
实施例三以免疫印迹试验(Western blotting)鉴定与检测转染SDF1-Pc融合蛋白为经一步鉴定与检测转染SDF1-Fc融合蛋白，转染细胞的上清液用免疫印迹试验方法来检测其中的SDF1-Fc融合蛋白含量。其步骤如下取含SDF1-Fc重组基因载体或空载体转染CHO细胞的上清液，上样于10％SDS-PAGE凝胶，进行电泳分离。SDS-PAGE电泳结束后，取下凝胶，将蛋白质转印至PVDF膜(30 V，4℃，16h)，再以1％BSA封闭，室温1～2h后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记-山羊抗人IgG-Fc多克隆抗体(抗体购自Sigma，1∶1000稀释)，37℃孵育1h。膜经充分漂洗后，加入显色液(邻苯二胺，3％H202)，至显色条带出现后，蒸馏水漂洗终止反应。免疫印迹试验结果如图4示在非变性样品中，SDF1-Fc重组基因载体转染的CHO细胞上清液呈阳性反应，泳带在分子质量为65-70kd左右的位置，这与预期的双倍体SDF1-Fc蛋白的分子量大小相符。而空载体转染的培养上清液检测结果为阴性。免疫印迹试验结果表明转染的CHO细胞分泌表达SDF1-Fc蛋白；而表达的SDF1-Fc蛋白保持有免疫球蛋白Fc段抗原活性，可被抗人IgG-Fc抗体识别。
实施例四SDF1-Fc蛋白作为试剂用于检测细胞/组织中的CXCR4的表达水平本发明的SDF1-Fc蛋白因具有SDF-1生物活性(即特异识别与结合CXCR4受体)及免疫球蛋白Fc段(抗体样活性)双重活性，故可作为抗体样试剂用于体内外检测CXCR4的表达。在本发明的实施例中，以SDF1-Fc蛋白为第1抗体，以辣根过氧化物酶标的山羊抗人IgG-Fc段多克隆抗体为第2抗体，两者合并使用以检测细胞/组织中的CXCR4的表达。其步骤如下取对数生长期的CHO细胞，胰酶/5mM EDTA常规消化后，以2×104细胞/孔接种24-孔塑料培养板，37℃，5％CO2培养过夜。第2天，在100μL无血清的DMEM加入2μLFugen6与不同量的含CXCR4-GFP质粒及GFP对照质粒DNA(1μg)混匀，制备成Fugen6-DNA混合液，室温放置15min后，缓慢滴加至CHO细胞中，于37℃、5％CO2条件下培养4-6h后，加入3ml DMEM-5％胎牛血清/孔继速培养。在转染48h后，以1×PBS液漂洗及90％甲醇4℃下固定CHO细胞20min，再加入含SDF1-Fc融合蛋白(1∶200稀释，300ul/孔)，37℃孵育1h后，以PBS液洗脱3次，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG-Fc段多克隆抗体(Sigma，1∶200稀释，300ul/孔)，37℃再孵育1h后，以PBS液洗脱3次，然后加入显色液(邻苯二胺-3％H202)，室温5-10min至显色反应出现，于显微镜下观察显色结果。如图5示在加入含SDF1-Fc蛋白及酶标记的山羊抗人IgG-Fc抗体后，CXCR4-GFP质粒转染的细胞培养孔有5-10％的细胞显色反应呈阳性(图5a)，而GFP对照质粒转染的细胞培养孔无显色阳性细胞(图5b)。此结果说明本发明中的SDF1-Fc蛋白保持有与CXCR4受体相特异结合的生物活性，可作为试剂用于定性或定量检测细胞或组织中的CXCR4受体的表达。
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附核苷酸或氨基酸序列表基因序列1(SEQ ID NO1)SDF1-Fc蛋白质的氨基酸序列表(共298个氨基酸)1 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala 19Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Ash Cys Ala Leu Gln Ile Val 39Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 59Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 79Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 99Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 119Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 139Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val LeuT hr Val 159Leu His Gln Asp Trp Leu Ash Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vat Ser Ash Lys Ala Leu 179Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys G1y Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 199Tyr Thr Leu Pro Pro Set Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 219Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 239Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Set Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 259Lys Leu Thr Val Asp Lys Set Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 279His Glu Ala Leu His Ash His Tyr Thr Gin Lys Set Leu Set Leu Set Pro Giy Lys . 298基因序列2(SEQ ID NO2)SDF1-Fc重组基因的核苷酸序列(共978个核苷酸)AAGCTTGCCG CC AACGC CAAGGTCGTG GTCGTGCTGG TCCTCGTGCT GACCGCGCTC60TGCCTCAGCG ACGGGAAGCC CGTCAGCCTG AGCTACAGAT GCCCATGCCG ATTCTTCGAA120AGCCATGTTG CCAGAGCCAA CGTCAAGCAT CTCAAAATTC TCAACACTCC AAACTGTGCC180CTTCAGATTG TAGCCCGGCT GAAGAACAAC AACAGACAAG TGTGCATTGA CCCGAAGCTA240AAGTGGATTC AGGAGTACCT GGAGAAAGCT GGATCCCCCA AATCTTGTGA CAAAACTCAC300ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC360CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG420GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG480CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC540GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC600AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA660GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC720CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT780GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC840TTCCTCTATA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA900TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT960CCGGGTAAA AGATCT978
基因序列3(SEQ ID NO3)SDF1-Fc重组基因的核苷酸序列及其氨基酸编码序列ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC GTG CTG GTC CTC GTG CTG ACC GCG CTC TGC CTC AGC GAC60Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu Cys Leu Ser Asp20GGG AAG CCC GTC AGC CTG AGC TAC AGA TGC CCA TGC CGA TTC TTC GAA AGC CAT GTT GCC120GlyLys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala40AGA GCC AAC GTC AAG CAT CTC AAA ATT CTC AAC ACT CCA AAC TGT GCC CTT CAG ATT GTA180Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val60GCC CGG CTG AAG AAC AAC AAC AGA CAA GTG TGC ATT GAC CCG AAG CTA AAG TGG ATT CAG240Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln80GAG TAC CTG GAG AAA GCT GGA TCC CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG300Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro100TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG360Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys120GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC420Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His140GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG480Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys160ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC540Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val LeuT hr Val180CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC600Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu200CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG660Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val220TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG720Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu240
GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG780Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu260AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC840Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr Ser280AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG900Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met300CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA960His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys . 319
权利要求
1.一种含基质细胞衍生因子-1与免疫球蛋白-Fc段双重生物活性的全新的SDF1-Fc蛋白质；其特征在于该蛋白质具有如基因序列表1所示的氨基酸序列。
2.一种制备权利要求1的SDF1-Fc蛋白质的方法；其步骤包括a)以多聚酶链式反应(PCR)及重组基因工程方法构建含有SDF1-Fc重组基因的表达载体；该表达载体的特征在于其具有如基因序列表2所示的SDF1-Fc重组基因核苷酸序列；b)表达载体转染入哺乳动物细胞及鉴定、检测SDF1-Fc重组基因在转染细胞中的分泌性表达；c)SDF1-Fc重组基因表达阳性细胞的筛选、扩增培养及上清液的收集；d)以免疫亲和层析柱法从收集的细胞培养上清液中分离提取SDF1-Fc蛋白质。
3.用权利要求1的SDF1-Fc蛋白质为试剂盒成分进行体内或体外检测SDF-1的特异性受体或配体表达水平的方法；其特征在于被检测的受体或配体是以膜蛋白形式表达于细胞/组织中，或以流离降级的可溶性物质形式存在于体液(如血清、血浆、唾液等)，或细胞培养上清液中。
4.用权利要求1的SDF1-Fc蛋白质为吸附剂，体外分离或清除SDF-1特异性受体或配体表达阳性细胞或组织的方法。
5.权利要求3和4所述的特异性受体或配体包括天然的CXCR4及CXCR4变体如CXCR4-GFP重组基因等。
6.一种以权利要求1的SDF1-Fc蛋白质为趋化物而建立的肿瘤细胞或炎症反应细胞体外迁移的模型；该模型的特征在于采用带微孔隔离膜的双层培养板，肿瘤细胞或炎症反应细胞加于隔离膜上层，SDF1-Fc蛋白质加于隔离膜下层，微孔隔离膜孔经大小为4-10um。
7.一种以权利要求6所述的体外迁移模型来筛选抗肿瘤细胞迁移或抗炎症反应细胞迁移药物活性成分的方法。
8.用于权利要求6的被筛选物成分包括各类受体、配体、抗体、融合蛋白、脂肪、糖类、核苷酸、大分子有机合成物、小分子活性多肽、小分子无机化学合成物、活性氨基酸及衍生物、活性胺类物质、脂类介质、毒素、动植物萃取物及代谢产物等。
9.一种以权利要求1所述的SDF1-Fc蛋白来干预人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的用途。
全文摘要
本发明属于生物技术一重组基因工程领域。本发明报道了一种含基质细胞衍生因子－1与免疫球蛋白－Fc段双重生物活性的多肽蛋白质(SDF1－Fc)及其制备方法和应用。本发明的SDF1－Fc蛋白质为采用重组基因工程与细胞培养方法制备生产。本发明的SDF1－Fc蛋白质可用于体内外检测SDF－1的受体如CXCR4的表达；用于吸附、分离清除CXCR4表达阳性的组织或细胞；用于干预人类免疫缺陷病毒(HIV)与CXCR4的结合。本发明的SDF1－Fc蛋白还可替代SDF－1用于建立肿瘤细胞或炎症细胞的体外迁移模型。该体外迁移模型可用于抗肿瘤迁移或抗炎症细胞迁移药物成分的快速筛选。
文档编号A61P31/18GK101016339SQ200610023808
公开日2007年8月15日 申请日期2006年2月9日 优先权日2006年2月9日
发明者徐一清, 陶飞龙, 胡红群, 马玲莎 申请人:上海思坦维生物技术有限公司