专利名称：模拟病毒型轮状病毒基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药卫生技术领域，特别是涉及一种模拟病毒型轮状病毒基因疫苗及其制备方法。
背景技术：
轮状病毒是引起婴幼儿病毒性重症腹泻的最主要病原。迄今为止，尚无特效的轮状病毒治疗药物，因此研制安全有效的轮状病毒预防性疫苗是问题的关键。现行的轮状病毒疫苗主要有以下几种形式一是减毒活疫苗。减毒活疫苗可模拟轮状病毒的自然感染过程，诱导有效的免疫保护，但活疫苗的致命缺陷是其本身及病毒毒力回复带来的安全性问题。如美国的恒河猴轮状病毒四价重配株RRV-TV(商品名Rotashield)于1998年批准用于临床，由于发现服用后增加了肠套叠发生的危险性，于1999年被迫停止使用。
二是轮状病毒亚单位疫苗。主要形式有纯化的轮状病毒结构蛋白的多肽疫苗、病毒样颗粒、转基因植物口服疫苗等，但均未获得理想的结果，其主要缺陷是其免疫原性弱，难以引起有效、持久的粘膜免疫保护反应。
三是基因疫苗。相对其他的疫苗形式，基因疫苗有很大的优势，如可使机体产生长时间的体液免疫及细胞免疫；DNA质粒含有CpG基序，本身也是一种非常强的佐剂；DNA制备简单、易于保存。但现行的基因疫苗作为粘膜疫苗形式的效果并不理想，其主要问题在于裸DNA在粘膜的摄取困难及常规的真核表达质粒在体内的表达效率偏低。
到目前为止，尚未见有关模拟病毒型轮状病毒基因疫苗及其制备方法的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有轮状病毒疫苗存在的问题，提供一种新型的轮状病毒基因疫苗及其制备方法。
该疫苗是类似于天然病毒的颗粒性肽-DNA复合物，直径约几十纳米，包含有1～3个含α-病毒复制酶cDNA的轮状病毒结构蛋白真核质粒表达载体，该复合物的颗粒性肽为霍乱毒素B亚单位与富含正电荷的18赖氨酸多聚物K18的偶联物。
霍乱毒素B亚单位cholera toxin B subunit，简称CTB本发明的模拟病毒型轮状病毒基因疫苗依次通过下列步骤合成
(1)用常规方法构建轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a的表达载体；(2)CTB用SPDP修饰；带正电荷的18赖氨酸多聚物K18先用SPDP修饰，再进一步与DTT作用1h；透析，以去除游离的SPDP与DTT；修饰后的CTB与K18按质量比为1∶2的比例混合，室温作用18h；最后进行透析，得到CTB-K18耦联物；(3)理论计算质粒与CTB-K18偶联物的电荷数，由于CTB-K18偶联物含有18个K残基，记为18e+；而每个脱氧核糖核酸的平均分子量为330Da，含1个磷酸根，记为1e-；CTB-K18偶联物以1∶1或2∶1的电荷比与质粒进行混合；(4)在浓度为150mM或87.5mM的NaCl条件下，将CTB-K18溶液逐滴滴入等体积的涡旋状态含有500μg/ml DNA的水溶液中，形成电荷比为1或2的CTB-K18-DNA复合物。
上述方法中，轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a含有CMV启动子和α病毒复制酶cDNA基因；CTB为霍乱毒素B亚单位，SPDP为Sigma公司产品succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate；二硫苏糖醇dithiothreitol，简称DTT。
本发明具有三个显著优点1、具有颗粒性及粘膜靶向性，使其更易被肠粘膜细胞有效摄取，克服传统基因疫苗在粘膜摄取的困难。在正负电荷相互吸引的静电作用下，CTB-K18偶联物可结合到质粒DNA上，将质粒由上百纳米的松散线性分子压缩成直径几十纳米的致密颗粒；另一方面，CTB可通过自身的神经节苷脂结合位点与肠粘膜细胞的相应受体特异性结合，从而促进粘膜细胞对该疫苗的有效摄取。实验表明，结肠癌细胞株HT-29及Caco-2对颗粒性肽-DNA复合物的摄取效率比裸DNA提高了约3倍以上。
2、轮状病毒结构蛋白的表达质粒含有α-病毒复制酶cDNA基因，使目的抗原基因在靶细胞得到高效表达。实验表明，用含有α病毒复制酶cDNA基因的pShame 2a构建的轮状病毒结构蛋白真核质粒表达载体较常规真核质粒表达载体的转染效率提高了约5倍以上。
3、能引起强而有效的粘膜免疫保护反应。CTB既具有粘膜靶向性，又是有效的粘膜免疫佐剂。本发明将其巧妙的用于质粒表达载体的包装肽，极大的提高了粘膜免疫反应水平。实验结果表明，该新型疫苗能诱导产生有效的粘膜免疫保护反应，其免疫保护率达85％以上。
图1为模拟病毒型轮状病毒基因疫苗的结构及合成示意图。
具体实施例方式
实施例1用常规方法构建轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a的表达载体；CTB用SPDP修饰；带正电荷的18赖氨酸多聚物K18先用SPDP修饰，再进一步与DTT作用1h；透析，以去除游离的SPDP与DTT；修饰后的CTB与K18按质量比为1∶2的比例混合，室温作用18h；最后进行透析，得到CTB-K18耦联物；理论计算质粒与CTB-K18偶联物的电荷数，由于CTB-K18偶联物含有18个K残基，记为18e+；而每个脱氧核糖核酸的平均分子量为330Da，含1个磷酸根，记为1e-，CTB-K18偶联物以1∶1的电荷比与质粒进行混合；在150mM NaCl条件下，将CTB-K18溶液逐滴滴入等体积的涡旋状态含有500μg/ml DNA的水溶液中，从而形成电荷比为1∶1的CTB-K18-DNA复合物。
实施例2用常规方法构建轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a的表达载体；CTB用SPDP修饰；带正电荷的18赖氨酸多聚物K18先用SPDP修饰，再进一步与DTT作用1h；透析，以去除游离的SPDP与DTT；修饰后的CTB与K18按质量比为1∶2的比例混合，室温作用18h；最后进行透析，得到CTB-K18耦联物；理论计算质粒与CTB-K18偶联物的电荷数，由于CTB-K18偶联物含有18个K残基，记为18e+；而每个脱氧核糖核酸的平均分子量为330Da，含1个磷酸根，记为1e-，CTB-K18偶联物以1∶1的电荷比与质粒进行混合；在87.5mM NaCl条件下，将CTB-K18溶液逐滴滴入等体积涡旋状态含有500μg/ml DNA的水溶液中，从而形成电荷比为1∶1的CTB-K18-DNA复合物。
实施例3用常规方法构建轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a的表达载体；CTB用SPDP修饰；带正电荷的18赖氨酸多聚物K18先用SPDP修饰，再进一步与DTT作用1h；透析，以去除游离的SPDP与DTT；修饰后的CTB与K18按质量比为1∶2的比例混合，室温作用18h；最后进行透析，得到CTB-K18耦联物；理论计算质粒与CTB-K18偶联物的电荷数，由于CTB-K18偶联物含有18个K残基，记为18e+；而每个脱氧核糖核酸的平均分子量为330Da，含1个磷酸根，记为1e-，CTB-K18偶联物以2∶1的电荷比与质粒进行混合；在150mM NaCl条件下，将CTB-K18溶液逐滴滴入等体积涡旋状态含有500μg/ml DNA的水溶液中，从而形成电荷比为2∶1的CTB-K18-DNA复合物。
实施例4用常规方法构建轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a的表达载体；CTB用SPDP修饰；带正电荷的18赖氨酸多聚物K18先用SPDP修饰，再进一步与DTT作用1h；透析，以去除游离的SPDP与DTT；修饰后的CTB与K18按质量比为1∶2的比例混合，室温作用18h；最后进行透析，得到CTB-K18耦联物；理论计算质粒与CTB-K18偶联物的电荷数，由于CTB-K18偶联物含有18个K残基，记为18e+；而每个脱氧核糖核酸的平均分子量为330Da，含1个磷酸根，记为1e-，CTB-K18偶联物以2∶1的电荷比与质粒进行混合；在87.5mM NaCl条件下，将CTB-K18溶液逐滴滴入等体积涡旋状态含有500μg/ml DNA的水溶液中，从而形成电荷比为2∶1的CTB-K18-DNA复合物。
权利要求
1.一种模拟病毒型轮状病毒基因疫苗，其特征在于所述疫苗是颗粒性肽-DNA复合物，它包含有1～3个含α-病毒复制酶cDNA的轮状病毒结构蛋白真核质粒表达载体，该复合物的颗粒性肽为霍乱毒素B亚单位与富含正电荷的18赖氨酸多聚物K18的偶联物。
2.一种模拟病毒型轮状病毒基因疫苗制备方法，其特征在于，依次通过下列步骤合成(1)用常规方法构建轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a的表达载体；(2)CTB用SPDP修饰；带正电荷的18赖氨酸多聚物K18先用SPDP修饰，再进一步与DTT作用1h；透析，以去除游离的SPDP与DTT；修饰后的CTB与K18按质量比为1∶2的比例混合，室温作用18h；最后进行透析，得到CTB-K18耦联物；(3)理论计算质粒与CTB-K18偶联物的电荷数，由于CTB-K18偶联物含有18个K残基，记为18e+；而每个脱氧核糖核酸的平均分子量为330Da，含1个磷酸根，记为1e-；CTB-K18偶联物以1∶1或2∶1的电荷比与质粒进行混合；(4)在浓度为150mM或87.5mM的NaCl条件下，将CTB-K18溶液逐滴滴入等体积的涡旋状态含有500μg/ml DNA的水溶液中，形成电荷比为1或2的CTB-K18-DNA复合物。上述方法中，轮状病毒结构蛋白真核质粒pShame 2a含有CMV启动子和α病毒复制酶cDNA基因；CTB为霍乱毒素B亚单位，SPDP为Sigma公司产品succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate；二硫苏糖醇dithiothreitol，简称DTT。
全文摘要
一种模拟病毒型轮状病毒基因疫苗及其制备方法，该疫苗是类似于天然病毒的颗粒性肽－DNA复合物，直径约几十纳米，包含有1～3个含α－病毒复制酶cDNA的轮状病毒结构蛋白真核质粒表达载体，该复合物的颗粒性肽为霍乱毒素B亚单位与富含正电荷的18赖氨酸多聚物K
文档编号A61P1/12GK101057974SQ20061005452
公开日2007年10月24日 申请日期2006年10月25日 优先权日2006年10月25日
发明者魏静 申请人:西南大学