专利名称：黄芪总黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芪总黄酮的用途，尤其涉及其在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，在我国城市人口中，肿瘤是第一位死因，占全部死亡率的1/4。
国内外大量实验证明自由基损伤、氧化损伤、辐射损伤、环境污染、慢性炎症等均可导致基因突变或细胞损伤，如突变得不到修复或修复不及时就可引起细胞异常生长——出现癌变。
根据肿瘤形成的两次打击学说，由正常细胞向恶性肿瘤细胞的转化将要经历漫长的突变和诱变过程。研究表明，大多数亚临床状态肿瘤发生的高危人群(亚健康状态人群)，常出现血液中一项或多项肿瘤标志物高于正常水平，但此时又难以出现影像学(如B超、CT、MRI等)证据或临床症状，这类亚临床患者的肿瘤标志物可持续处于高水平状态数月或数年而后再出现恶性肿瘤。如果能够有针对性的治疗这些高危人群，将可在一定程度上阻止或延缓恶性肿瘤的形成。
经实验研究，黄芪具有提高免疫力、抗肿瘤的作用，如中国专利申请CN 1723984 A介绍了黄芪的水提物用于治疗血液系统肿瘤。但一般研究认为，黄芪中发挥抗肿瘤作用的有效成分是黄芪多糖，上述专利申请中所述的黄芪水提物即是极性较大的水溶性成分。又如中国专利申请CN1557392 A介绍了黄芪多糖和黄芪总皂苷以3-5∶1的比例混合用于治疗肿瘤。
所以，对于黄芪抗肿瘤的有效成分及其适应症，还需进一步研究。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供黄芪总黄酮(TFA)在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明的另一个目的是提供上述黄芪总黄酮的制备方法。本发明提供了黄芪总黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用，具体地说，所述的肿瘤是白血病或肉瘤。
白血病是一种造血组织的恶性疾病，俗称“血癌”，特点是某一类型的白血病细胞在骨髓或其它造血组织中的肿瘤性增生，可浸润体内各器官、组织、使各个脏器的功能受损，产生相应的症状和体征。本发明中用MTT法观察了黄芪总黄酮对Molt-4细胞(急性淋巴母细胞白血病)，Raji细胞(Burkitt’s淋巴瘤)，KG-1细胞(髓系)和Jarkat-1细胞(T-细胞白血病)的半数抑制浓度(IC50)，结果显示，黄芪总黄酮对T细胞系白血病细胞和髓系白血病细胞均有良好的抑制作用，这对临床应用有重要参考意义。
肉瘤是指来源于间叶组织(包括结缔组织和肌肉)的恶性肿瘤。多发生于皮肤、皮下、骨膜及长骨两端。如纤维肉瘤生长迅速，肿瘤晚期常有坏死、出血、切面灰红色、质均匀细如生鱼肉状。骨肉瘤以青年人为多，好发于四肢长骨之两端，尤以股骨下端、胫骨上端和肱骨上端最多见。在黄芪总黄酮抗S180肉瘤细胞的实验中，该药物与对照组比较均有极显著意义(p＜0.001)。
肿瘤的起因复杂多样，在本发明的应用中，所述的白血病或肉瘤主要是由基因突变(mutation)或细胞损伤引起的。
本发明所述的基因突变是指由氧自由基、紫外线辐射、电离辐射引起的基因突变。
近年来随着对自由基对线粒体造成的氧应激损伤的研究，氧自由基对线粒体DNA(mtDNA)攻击可能是线粒体衰老的原因，并有人猜想，受到氧自由基攻击并发生改变的部分mtDNA会逃离线粒体至核内，并将已发生改变的DNA序列整合到染色体或核内DNA中，造成细胞核内DNA损伤或突变。在DNA氧化损伤中，8-羟基鸟嘌呤(8-OH-G)形成频率最高，致突变能力最强，是DNA氧化损伤的代表性产物，是肿瘤发生和发展的重要因素。
人皮肤因受紫外线照射而使同一条DNA链上相邻的嘧啶或者嘌呤以共价键连成二聚体的频率可达每小时5×104/细胞，它所诱导的突变一般只局限于皮肤中引起皮肤癌变。此外，紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。
电离辐射可导致DNA分子的多种变化，如碱基变化、脱氧核糖变化、DNA链断裂和交联，前述突变因素均可造成基因突变，如不能及时得到修复，最终均可能发展成恶性肿瘤。黄芪总黄酮对超氧阴离子自由基和羟自由基等活性氧有很好的清除效能。
本发明所述的细胞损伤是指由自由基引起的细胞膜损伤，化学试剂或药物等所致的细胞、细胞器、蛋白质和DNA等生物大分子的损伤，以及辐射或缺血再灌注所致的组织细胞损伤。
细胞膜上富含多不饱和脂肪酸，极易受自由基的损伤，诱发脂质过氧化，造成结构和功能的改变。黄芪总黄酮能够显著降低紫外线、过氧化氢及超氧阴离子自由基诱发的脂质过氧化损伤，对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶和紫外线所致红细胞溶血也有很好的抑制作用。
自由基可引起细胞膜脂的过氧化和膜蛋白的损伤，进而引起DNA的损伤和基因突变，从而诱发生理、病理变化，导致细胞损伤、凋亡甚至死亡，引起多种疾病，如心脏病、衰老和肿瘤等。黄芪总黄酮对这些损伤因子所致细胞蛋白质、DNA的损伤均有不同程度的防护作用，其作用强度与药物浓度成正比。
缺血再灌注可造成机体广泛受损，其作用因子就是缺血再灌注后大量自由基的生成。黄芪总黄酮能明显减少缺血再灌注时自由基的产生，即降低了自由基对心肌细胞的损害。
本发明还提供了上述黄芪总黄酮的制备方法，该方法包括以下步骤a、黄芪和/或葛根制成饮片、粗颗粒或者粉末，用提取溶剂乙醇、甲醇或丙酮按质量体积比(g/ml)1∶1-3进行回流提取1-3次，每次1-3h；b、合并滤液，回收该提取溶剂，所得残渣用1-2倍体积的蒸馏水稀释，再以同样体积的醋酸乙酯萃取2-3次；c、合并萃取液，回收醋酸乙酯，在温度50-70℃下干燥。
其中步骤a中所述的提取溶剂的浓度为70-95％。
步骤a中所述的黄芪别名黄耆、绵黄芪等，是豆科多年生草本植物黄芪Astragalus membranacens(Fisch)Bge.和内蒙黄芪A.mongholicus Bge.的根。
所述的葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi Puerariathomsonii Benth.的干燥根。
对由上述方法得到的黄芪总黄酮进行HCl-Mg反应、AlCl3反应和荧光检测，结果均呈阳性。
将本发明所述的黄芪总黄酮过硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚(60-90℃)-丙酮(1∶0-9∶1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5-0∶1)梯度洗脱，将得到的流份经葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，以甲醇洗脱，得到的单一化合物经核磁共振波谱仪(BrukerAV-600)分析，结果显示所述的黄芪总黄酮中主要含有β-谷甾醇、芒柄花素、毛蕊异黄酮、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
根据临床需要，本发明所述的黄芪总黄酮可以和在药学上可接受的辅料制成口服液、胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂或注射剂等多种剂型。本发明提供的黄芪总黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用，具有以下优点
1、从单味中药中提取的纯天然有效部位，易于操作。
2、防止多种有害物质引起细胞基因的突变和损伤，可预防恶性肿瘤的发生、发展。
3、对于接触致突变因素的肿瘤高危人群(亚健康状态人群)，是目前唯一能够通过直接抑制突变、诱变过程，降低肿瘤标志物而达到抗突变(肿瘤)作用的产品。
4、选择性地抑制恶性肿瘤细胞的生长，可防止复发和转移。
5、从常用的天然中药中提取，无毒副作用。
具体实施方式通过下面给出的本发明具体实施例可以进一步清楚地理解本发明，但这些实施例不是对本发明保护范围的限制。
实施例1 黄芪总黄酮的制备方法a、称取50g黄芪饮片，用100ml 95％乙醇进行减压回流提取2次，每次1.5h；b、合并提取液，回收乙醇，得到残渣20ml，再加入30ml蒸馏水稀释，然后用30ml醋酸乙酯萃取3次；c、合并萃取液，回收醋酸乙酯，所得浸膏于70℃下进行干燥。
将本发明所述的黄芪总黄酮过硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚(60-90℃)-丙酮(1∶0-9；1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5-0∶1)梯度洗脱，将得到的流份经葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，以甲醇洗脱，得到的单一化合物经核磁共振波谱仪(BrukerAV-600)分析，表明所述的黄芪总黄酮中主要含有β-谷甾醇、芒柄花素、毛蕊异黄酮、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。上述化合物的重量比例为23∶11∶12∶3∶22∶29。
实施例2 黄芪总黄酮对白血病细胞生长的抑制作用药物与试剂取实施例1所得黄芪总黄酮浸膏经高压灭菌后用乙醇溶解(80mg/ml)作为供试药，实验前以培养液稀释至所需浓度。以柔红霉素(Rubomycin.)(河北制药厂生产，生产批号060120)为对照药品，以生理盐水稀释至50μg/ml，实验前用培养液稀释至所需浓度。
肿瘤细胞株培养Molt-4细胞(急性淋巴母细胞白血病)，Raji细胞(Burkitt’s淋巴瘤)，KG-1细胞(髓系)，Jarkat-1细胞(T-细胞白血病)。培养液为含10％小牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco)，另添加适量的HEPES及抗菌素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，37℃培养箱内静置培养，隔天换液。当细胞生长至活力良好，于对数生长期时将细胞株调整细胞浓度为5×105/ml备用。
细胞毒测定(MTT法)参照Mosmann法(Rapid colorimetric assay forcellular growth and survialApplication to prdifereation and cytotoxicityassays.J Immunoloyical Methods，1983，6555-63.)。取不同的白血病细胞系细胞，用Hank’s液洗3次，用培养液稀释，接种于96孔板(5×104个细胞/孔/100μl)，加入10μl不同浓度的黄芪总黄酮或柔红霉素或同体积培养液，药物设4-6个浓度，每个浓度4个复孔，置于37℃、5％CO2培养44h后每孔再加入MTT10μl，继续培养4h，然后每孔加入100μl 0.4N盐酸异丙醇终止反应，混匀后于波长595nm测定光密度值(OD)，按公式IC50＝(1-OD实验组/OD对照组)×100％计算抑制率，求出IC50(半数抑制生长浓度)。
统计学处理采用SPSS10.0软件计算半数抑制浓度。
实验结果柔红霉素对两种白血病细胞均有较好的抑制作用，对Molt-4和Raji细胞的IC50分别为15.5±2.3和6.2±2.8μg/ml。本发明所述的黄芪总黄酮对以上4种白血病细胞均有较好的杀伤作用，其IC50分别为T(Molt-4)细胞系为30μg/ml，髓系(KG-1)细胞为84μg/ml，红细胞系(Jartat-1)为164μg/ml，B细胞系(Raji)为184μg/mlμg/ml。
讨论以往的研究认为细胞毒作用是药物抗肿瘤作用的唯一途径，大量化疗药物也证实了药物的细胞毒作用可有效的遏制肿瘤细胞的生长。本实验中的阳性对照药物柔红霉素对Molt-4和Raji两种细胞均有很好的抑制作用，其作用强度优于黄芪总黄酮，然而基础和临床数据都有大量研究证明化疗药物的耐药性已经越来越严重。此外，化疗药物对人体健康的伤害也已经引起了人们足够的重视，因此，近年来，人们的研究方向以从过去筛选细胞毒药物转向筛选具有诱导细胞调亡和促进分化的和无毒或低毒的植物提取成分，换言之，研究具有选择性抑制肿瘤细胞生长的药物已越来越受到人们的关注。黄芪已在传统医学中应用数千年，从中分离出的黄芪总黄酮在大、小鼠两种动物上的最大耐受量均超过21.5g/kg，相当于临床成人用量的300倍。
实施例3 黄芪总黄酮对S180肉瘤细胞的影响选取河北医科大学实验动物学部提供的清洁级昆明小鼠180只，(批准号医动字第04054号)，体重18-22g，随机分为6组，每组雌雄各半。按照徐淑云等主编的《药理实验方法学》(第1版，北京人民卫生出版社，1994，1423)制备小鼠S180肉瘤模型。
取实施例1所得黄芪总黄酮浸膏作为供试药，按给药剂量分为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和17.5mg/kg组；对照药品为环磷酰胺(上海华联制药厂生产，批号20050906)，给药剂量为25mg/kg；阳性对照为生理盐水。供试药物各组每日灌胃给药1次，阳性对照组给相同剂量的生理盐水，环磷酰胺组腹腔注射给药。连续给药7d后将小鼠处死，将肿瘤组织取出后称重，计算抑瘤率。
实验重复三批，计算各组平均抑瘤率。结果表明当供试药给药浓度为2.5、5.0、10mg/kg时其抑瘤率分别为35.17％、39.41％和49.58％，与阳性对照组比较均有极显著意义(p＜0.001)。
中药新药抗肿瘤药物的判断标准表明当中药对肿瘤的抑瘤率高于30％时即认为有效。由于环磷酰胺是常用的抗肿瘤化学药物，故本实验选它为阳性对照药物，浓度为25mg/kg时其抑瘤率达81.36％，提示该实验模型有效，实验结果可靠。
权利要求
1.黄芪总黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤是白血病或肉瘤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的白血病是急性淋巴母细胞白血病、Burkitt’s淋巴瘤、髓系细胞白血病或T-细胞白血病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤是由基因突变或细胞损伤引起的。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的基因突变是由氧自由基、紫外线辐射、电离辐射引起的基因突变。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的细胞损伤是由自由基引起的细胞膜损伤、化学试剂或药物所致的细胞、细胞器、蛋白质或DNA生物大分子的损伤，以及辐射或缺血再灌注所致的组织细胞损伤。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的应用，其特征在于所述的黄芪总黄酮是通过下述步骤制备得到的a、黄芪和/或葛根制成饮片、粗颗粒或者粉末，用提取溶剂乙醇、甲醇或丙酮按质量体积比1∶1-3进行减压回流提取1-3h，然后过滤，这种操作重复进行1-3次；b、合并滤液，回收溶剂，所得残渣以1-2倍体积的蒸馏水稀释，再以同样体积的醋酸乙酯萃取2-3次；c、合并萃取液，回收醋酸乙酯，在温度50-70℃下减压干燥。
7.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的应用，其特征在于根据临床需要，所述的黄芪总黄酮可以和在药学上可接受的辅料制成口服液、胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂或注射剂。
全文摘要
本发明提供了黄芪总黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是白血病或肉瘤，尤其是基因突变或细胞损伤引起的白血病或肉瘤。所述的黄芪总黄酮对超氧阴离子自由基和羟自由基等活性氧有很好的清除效能，对自由基所致细胞膜、蛋白质和DNA等生物大分子的损伤具有明显的防护作用，可显著降低辐射和缺血再灌注所致组织细胞损伤，并具有良好的抗紫外线损伤作用。本发明还提供了所述黄芪总黄酮的制备方法。
文档编号A61K9/10GK1985876SQ20061017227
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月30日 优先权日2006年12月30日
发明者汪德清, 田亚平, 董振南 申请人:中国人民解放军总医院