植物果肉的不皂化提取物在治疗皮肤老化中的用途的制作方法

专利名称：：植物果肉的不皂化提取物在治疗皮肤老化中的用途的制作方法植物果肉的不皂化提取物在治疗皮肤老化中的用途本发明的领域涉及植物果肉的不皂化提取物在制备用于治疗和/或预防与老化相关的皮肤病症的美容、药物或营养产品中的用途。老化是一种不可避免的、緩慢进行和不可逆的现象，它引起导致器官功能异常的解剖学和组织学变化。首先的可见标志在皮肤组织水平上表现为质地、颜色和透明度的改变以及皱紋的出现。这些表现可被外在因素如阳光、烟草等所增强。氧自由基(0FR)在参与老化的过程中的重要性被认为是主要的理论之一。在皮肤水平上，氧自由基被描述为炎症病理学以及老化的早期介质(KressM.等人，A//1995;62:87-94)。在老化的过程中，皮肤的所有结构都发生改变。然而，基本的改变主要是在真皮中，并且成纤维细胞和细胞外基质正是这些改变的主要靶标和主要参与者。成纤维细胞能够进入衰老状态，结果是，它们的数量减少，功能减弱，和表型改变。在这种情况下，它们积极参与皮肤细胞外基质的降解。此外，在衰老过程中，成纤维细胞失去其反应性并经历其调节的改变。这是因为，已认识到，老化与对环境应激的应答的降低甚至是丧失相关，由此也与感染性、自身免疫性以及癌症类的疾病相关(GardnerI.D.//2尸ecL1980;2:801-10)。皱紋的出现是老化的最早的标志之一。对某些人来说，这成了他们与外界关系中的一个真实问题。因此，今天，有许多力求治疗皮肤老化的美容产品已提供给了公众，这些特殊产品主要以植物提取物为基础。阿干树(arganier),在国际植物命名法中称为刺阿干树(Jrgfl力ifls/7/770sa(L.)Skells)，尤其是通过美容产业而身价倍增，特别是它的种仁。阿干树是一种低矮的树木，6-10米高，它的树形让人想起橄榄树。树冠形状可有一些变化，可能是直立的或者下垂的。枝条非常多刺，布满互生、狭窄、短小(约2cm)的披针形小叶，枝条常聚集成束。阿干树的叶子通常是常绿的，但在非常干燥的时期也会落叶。花黄绿色，雌雄同体(雄蕊和雌蕊在同一朵花上)，五基数(五个花瓣，五个萼片)，聚成球状花序。花期从五月到六月。阿干树自五岁树龄开始结果。果实是黄色、卵形的无柄浆果，长4到5厘米。其由包藏一种极坚硬的棕色"假果核"的肉质果皮(也叫果肉)构成。"假果核"实际上由2到3个彼此粘连在一块的扁平种子组成，每个种子包含一个油质种仁。最有价值的应用在于种仁，它能提供油，继而提供油饼。种子来源的油已成为多项发明专利的目标用溶剂获得油(FR2553788);富集在不皂化部分中的阿干树油(FR2724663)。除油之外的其他物质也获得了专利。一个例子是从在油提取之后获得的种子油饼而来的多肽油与油饼中的多肽的联合用于治疗与皮肤老化有关的紊乱(FR2756183)。阿千树的叶片以及油饼中的蛋白质和皂苷也同样是发明专利的目标EP1213025涉及叶片提取物，EP1213024涉及油饼中的蛋白质，和EP1430900涉及油饼中的皂苷。最近，阿干树果实的果肉已成为专利申请WO2005/039610的目标。阿千树的果实是一种假核果。因此，它由一种称为果肉的肉质果皮(占果实的55%至75%)以及一个具有极坚硬外壳、包含1至3个种仁的果核組成。油就是从种仁中提取的。已对果实的果肉进行了化学研究。它由糖类组成，包括纤维素、葡萄糖、果糖和蔗糖。(CharroufZ.GuillaumeD.，Ethnoeconomical，ethnomedical，andphytochemicalstudyofArganiaspinosa(L.)Skeels.，JournalofEth卿harmacology，1999，67，1，7-14;SandretF.G.，Etudespr61iminairesdesglucidesetdulatexdelapulpedufruitd，Argan(Arganiaspinosa):variationaucoursdelamaturation,BulletindelaSoci6t6deChimieBiologique，1957，39，5-6，619-631)。其中还存在脂质。它们的含量为6%。在这些脂质的不皂化级分中已鉴定出5种三薛醇高根二醇、羽扇醇、a-和(3-脂檀素、桦木醛，和两种甾醇a-菠菜甾醇(a-spinost&ol)和仙人掌甾醇(schomnol)(CharroufZ.，Fkih-Teto画iS.，CharroufM.,MouchelB.，Triterp6nesetsterolsextraitsdelapulped，Arganiaspinosa，PlantesM6dicinalesetPhytothgrapie，1991，25，2-3，112-117)。专利申请W02005/039610—般性地论及了基于阿干树果实的果肉的组合物用于制备美容产品的用途。果肉提取物已多少经过了纯化。这是因为，发明者在该过程的各个不同阶段对提取物已做了测试。因此，这优先描述了在己烷提取后获得的果肉提取物的用途(第15页)。随后，作者在本领域技术人员已知的传统皂化步骤后对如此收集到的不皂化级分进行了测试。最后，作者还设置了一个通过色谱法来分离不皂化级分的步骤，小心地除去了三萜化合物高根二醇。这样做的理由可能基于所获得的结果，尤其是这样的事实，即在低于该文献所定义的三萜级分的剂量时，高根二醇单独地表现出具有毒性(实施例1):级分A不具有高根二醇(第38页)。此外，与所述三碎级分相比，高根二醇单独地对于UVA和UVB仅表现出一般优势(实施例3和4)。因此，该文献的一般性教导涉及阿干树果实的果肉提取物的三萜级分在制备美容产品中的用途，优选地在治疗经过刺激成纤维细胞的代谢而被UU和UVB侵害的皮肤中。更具体而言，该文件教导了，在WO2005/039610中所公开的所述三萜级分比低含量的高根二醇更具有活性。令人惊奇且意外地，本发明的作者证明了富含高根二醇的阿干树所述提取物可以通过丙酮提取以及随后的传统皂化步骤来获得。然而，有理由预期，本发明的益处可以被扩展至任何植物果肉的不皂化提取物，所述不皂化提取物具有三萜级分，所述三辟级分的组成在主要化合物方面接近来源于阿干树果肉的三薛级分。本发明涉及包含三萜级分的植物果肉的不皂化提取物在制备用于预防和/或治疗与皮肤老化相关的皮肤病症的美容、药物或营养产品中的用途，其特征在于，所述三萜级分包含高根二醇、a-脂檀素、p-脂檀素和羽扇醇。优选地，所述提取物通过丙酮提取以及随后的传统皂化步骤来获得。这种不急化提取物，也称为起始不皂化级分，可以被溶解于赋形剂之中以促进配制。优选地，所述提取物从选自山榄科(Sapotaceae)的植物中获得。更优选地，所述提取物从阿干树果实的果肉中获得。丙酮提取的一个优点在于可以除去胶乳，其占脂质级分的绝大部分，并因此在脂质级分的不皂化物质中浓度更高。根据本发明的不皂化物的组成在质和量上都与专利申请WO2005/039610中优先描述的那种不同。根据本发明的提取物的特征在于含有三萜物质。三萜物质可以按照传统的合适方法通过气相色镨来进行分析，所述方法使得能够鉴定p-脂檀素和高根二醇。相反地，a-脂檀素和羽扇醇不能用此法分离，因而，对于这些分子可以一般性地进行含量测定。有利地，提取物的三萜级分由以下成分组成高根二醇，其质量分数为起始不皂化物的约7%至约40%;p-脂檀素，其质量分数为起始不皂化物的约5%至约30%;a-脂檀素和羽扇醇，两者质量分数之和为起始不皂化物的约10%至约50%。有利地，所述高根二醇的质量分数为起始不皂化物的约10%至约20%;更有利地，等于起始不皂化物的约15%。有利地，所述p-脂檀素的质量分数为起始不皂化物的约7%至约20%;更有利地，等于起始不皂化物的约10%。有利地，所述a-脂檀素和羽扇醇的质量分数之和为起始不皂化物的约15%至约30%;更有利地，等于起始不皂化物的约20%。这些不同分子的含量决定于提取条件。根据添加至起始不急化物中的赋形剂，这些值在美容、药物或营养产品中的含量将会更低。本发明的一个突出点是，高根二醇在根据本发明的不皂化提取物的抗衰老特性中具有重要贡献。由于氧自由基在皮肤老化过程中发挥着重要作用，因而通过与根据本发明的阿千树果肉的不皂化物相比较对高根二醇的抗自由基(抗氧自由基)效应进行了评价。细胞内由氧自由基造成的损害表现为质膜的脂质组分的改变(脂质过氧化)、蛋白质的改变(变性和降解)以及遗传物质或DM的改变(突变)。进行了体外测试以测定-高根二醇和不皂化提取物针对膜脂质氧化的保护效力(实施例3);和-高根二醇和其他三薛分子(羽扇醇、a-和p-脂檀素)对于基因组DNA改变的保护能力(实施例4)。这些测试已经证明，高根二醇是拥有显著抗氧化潜力的分子。在本发明的一个具体实施方案中，提取可以如下进行磨碎干燥的阿千树果实的杲肉，然后用丙酮提取。也可以采用丙酮/水的混合物。提取在搅拌下或者以静止方式进行，植物/溶剂比率可在1:2到1:20间变动，温度可在环境温度到溶剂的沸点之间变化，进行时间可以从30分钟到24小时。一旦提取完毕，植物的固体残留物通过过滤或离心而与提取溶液分开。该溶液可以被或多或少地浓缩，直至获得干的提取物。在后一种情况下，所述干物质可以被溶解于醇中以允许皂化。在该溶液中加入金属氢氧化物，尤其是氢氧化钠或氢氧化钾，浓度从O.1N到10N。皂化在从环境温度至沸点的温度下于搅拌下进行，根据温度，持续时间可从15分钟到48小时变化。纯化通过液/液萃取来进行。那么，在水解介质中加入不相混的溶剂，其可以是pH值调节到3至9的被盐[NaCl，(NH4)2S04]饱和或未饱和的水。该溶剂可以是氧醚(aheroxyde)、酯、烷烃、卣代烃或者这些溶剂的混合物。进行一次、两次或三次连续的液/液提取。合并有机相，随后用pH3至9的被盐饱和或未饱和的水进行洗涤。洗涤过程可重复数次。纯化后，对有机相进行处理以除去溶剂。该处理过程可以在控制压力的情况下通过蒸发来完成。蒸发步骤可能导致产生具有多少有些蜡状的脂质粘稠性的产物，即起始不急化物。可以加入赋形剂，其可以是动物蜡(例如蜂蜡)或植物蜡(例如巴西棕榈蜡、小烛树腊或霍霍巴蜡)、植物油(玉米、红花、芝麻、阿干树等)、甘油、合成来源的产品如凡士林油、多元醇(例如丙二醇、丁二醇、丙三醇等)、酯化的甘油三酯(例如miglyol812、myritol318、neobeeMJ)、分子式为H(OCH2-CHCH3)n0H的氧化丙烯聚合物或分子式为H(OCH2-CH2)n0H的氧化乙烯聚合物、不同长度(d至U)的脂肪醇的二酯。阿干树果肉的起始不皂化级分与赋形剂的比例可以为1/99至99/1。有利地，本发明使得果实的果肉能够以合理的成本用于抗老化治疗。无需另外的纯化步骤就可使用不皂化提取物，所述纯化步骤是非常昂贵的。因此，根椐本发明的组合物可以借助于插入了本领域技术人员已知的传统提取和皂化步骤的过程来获得。根据本发明的植物果肉的不皂化提取物的使用使得能够预防和/或治疗皮肤病症，所述皮肤病症表现为皮肤的质地、颜色和透明度的改变以及铍紋的出现。在本明的一个具体实施方案中，皮肤病症是由于对环境应激的应答降低或者丧失而引起的，尤其是由阳光或烟草造成的环境应激。在本发明的另一个具体实施方案中，皮肤病症是由于HSP72蛋白的可诱导性降低或者丧失而引起的。HSP(标示"热休克蛋白")蛋白在许多细胞中组成性地表达，并且具有在维持蛋白质方面必不可少的功能，它们的名字"分子伴侣"蛋白由此而来。这是因为，它们抑制变性蛋白质的聚集，防止蛋白质的不适当的结合，并且它们参与细胞内运输和参与以非活性形式维持某些蛋白质(MorrisS.D.C///.Zer则&7.2002;27:220-224)。HSP还在应激反应中，尤其是在调动适应性应答的细胞保护过程中起着根本作用(MaytinE.V././扁"."er/n"o厶1995;104:448-55)。令人意外地，使用根据本发明的提取物使得能够恢复衰老的成纤维细胞中HSP72蛋白的诱导。在本发明的范围内，包含根据本发明的提取物的美容、药物或营养产品通过口服或局部途径施用，优选地通过局部途径施用。对于通过局部途径的施用，所迷盖仑氏形式选自霜剂、凝胶剂、软骨剂和喷雾剂。有利地，口服形式选自片剂、胶嚢剂和用于可饮用悬液的粉剂。有利地，所述提取物在最终美容产品中的量为制剂总重量的约0.001重量％至约50重量％，优选约0.01重量％至约10重量％，更优选约0.1重量°/至约2重量％。此外，制剂还可以包含本领域技术人员熟知的用于治疗和/或预防与皮肤老化相关的皮肤病症的其他活性物质。有利地，所述制剂包含来自阿干树的因其"抗老化，，作用而知晓的其他物质，例如从种仁中获得的油以及油饼中的肽。下面的根据本发明的组合物的实例以示例性而非限制性的方式给出。百分比以相对于组合物总重量的以重量计的比例形式给出。实施例1:抗面部松弛的护理阿干树果肉的不皂化提取物富集的阿干树油阿千树的多肽维生素E的衍生物维生素F的甘油酯0.1至2%1至5%0.1至1%0.1至0.5%0.1至0.5%-维生素A棕榈酸酯0.1至1%-甲基葡萄糖硬脂酸酯1至5%-辛酸/癸酸甘油三酯2至8%-液体石蜡5至12%-香料q.s.-纯化水q.s.p.100g下面的实施例举例说明了本发明，而并不限制其范围。实施例2:获得阿干树果肉的不皂化提取物的方法磨碎1吨干燥的阿干树果实的果肉，然后在反应器中用5吨丙酮提取。该提取过程在回流搅拌下进行1小时。溶液一旦冷却，就经过滤进行回收，然后在真空下浓缩，直到得到去溶剂的油状提取物。将该残留物吸收在500升95%(v/v)的乙醇中。然后向其中添加100升ION的氢氧化钠(lessivedesoude)，并回流搅拌l小时。冷却后，将经水解的溶液置于滗析器中，向其中加入500升庚烷和300升水。液/液萃取小心地进行。在滗析后，收集有机相。用500升庚烷再进行2次萃取。合并3个庚烷相，并洗涤3次，每次用500升水。经洗涤的有机相是去除了溶剂的。这样就得到一种蜡质的糊状物。测定这一提取物(相应于起始不皂化物)中三萜物质的含量。它包含10%p-脂檀素、15%高根二醇和20。/。羽扇醇/a-脂檀素混合物。实施例3:高根二醇的抗自由基效应的分析一一脂质过氧化的分析1)导言质膜是氧自由基的主要和首要靶标，并且由于富含脂质，其是增加的过氧4匕作用的位点(GirottiA.W.X尸reeAad/c.#ecT.1985;1:87-95)。脂质氧化过程中产生的过氧化物也具有很高的反应性，并且能够降解蛋白质和基因组物质。为了评价膜的改变，本发明的作者们通过对脂质氧化产物和硫代巴比妥酸之间的复合物进行体外定量，而测量了脂质的过氧化。这些复合物称为TBARS(表示"硫代巴比妥酸反应性物质(ThioBarbituricAcidReactiveSubstances)，，)，并以》匕命名i亥须'J试TBARS须'J试。为了模拟化学氧化应激，用由过氧化氢(H202)和铁(Fe27Fe3+)组成的复合物来处理成纤维细胞系L929，因而再现了芬顿(Fenton)反应，该反应是氧自由基，尤其是羟基自由基(0H°)的来源(VesseyD.A.等人/.//2reW./er边"o/.1992;99:859-63):H202+Fe2+^OH0+OH—+Fe3+。2)方法O受试产品产品在鼠成纤维细胞系L929上进行评价。细胞用不同浓度的产品(表I)预处理16小时，然后用H20广Fe^/Fe3+复合物刺激l小时。批次LK0304的阿干树果肉的不皂化提取物根据实施例2进行制备。表I:受试溶液概览<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>膜脂质的过氧化通过测量TBARS来进行分析。(根据MorlUreP.等人，"/oc力/迈.S/o;力;^.1991;1084:261-268)。O测试原理在酸性介质中，于95C下，脂质氧化产物(丙二醛或MDA)和硫代巴比妥酸(TBA)之间形成复合物，称为TBARS(表示"硫代巴比妥酸反应性物质")，其含量可以通过相对于MDA标准系列而言的焚光来进行测定。TBARS的测定值表示为pmol/pg蛋白质。蛋白质和TBARS均在细胞内环境中进行含量测定。O计算细胞膜保护的百分比从计算以pmol/ng蛋白质表示的TBARS开始，按下式计算不同的产物针对膜脂质氧化的保护效力<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>来对HSP72基因的表达水平进行标准化。最后，设定对照样品中的表达水平为1,从而可以确定HSP7Z基因的诱导倍数。图1B显示了通过实时PCR进行的对于在年轻IMR-90(翻)和衰老IMR-90(■)(由&02诱导的衰老)中HSP72mRNA诱导水平的定量分析。图1B清楚地显示了，在IMR-90成纤维细胞的经诱导的衰老过程中，HSP72mRNA的诱导也大大降低。-阿干树果肉提取物的效力的分析为了评价根据实施例2制备的阿干树果肉抽提物，本发明的作者使用了釆用IMR-90成纤维细胞系的诱导的衰老或SIPS(StressInducedPrematureSenescence,应激诱导的过早衰老)模型。将细胞与浓度为1fig/ml至3pg/ml的阿干树果肉抽提物一起孵育24小时。然后，使它们经历能诱导衰老的氧化应激。对于一批"年轻"IMR-90细胞和一批未经阿干树果肉抽提物预处理的"衰老"(诱导的衰老)细胞，将所有处理进行比较。氧化应激后3天(72小时)，用热诱导HSP72。最后，HSP72RNA和HSP72蛋白分别通过实时PCR和Western印迹进行分析。图2显示了在用不同浓度的根据实施例2制备的不皂化提取物处理的IMR-90细胞中HSP72蛋白水平的Western印迹分析。图注"T"和"ST"分别代表"对照"和"热应激"。A、B、C和D分析分别对应于年轻IMR-90成纤维细胞、衰老IMR-90成纤维细胞(由&02诱导的衰老)、与1jig/ml不皂化提取物孵育的衰老IMR-90成纤维细胞以及与3jig/ml不皂化提取物孵育的衰老IMR-90成纤维细胞。图3显示了在用1jig/ml(C)和3|ng/ml(D)不皂化提取物预处理的衰老IMR-90成纤维细胞中HSP72蛋白的诱导水平(用P-肌动蛋白的表达水平来标准化的)的半定量分析。还显示了在年轻IMR-90成纤维细胞(A)和衰老IMR-90成纤维细胞(由&02诱导的衰老)(B)中HSP72蛋白的诱导水平。图2和图3表明，在变得衰老的IMR-90成纤维细胞中不再有HSP72蛋白的诱导，但浓度为1jig/ml和3pg/ml的阿干树果肉抽提物恢复了热应激对于HSP72的诱导。最后，下面的表V给出了在用不同浓度的阿干树果肉抽提物预处理的衰老成纤维细胞中HSP72mRNA的诱导倍数(标准化后的)。表V:诱导倍数<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>这个表证实了在转录水平上获得的结果，并显示了阿干树果肉抽提物几乎完全恢复了HSP72mRNA的诱导。在3jig/ml的浓度时，该提取物的活性最大。4)结论HSP72蛋白是能被多种应激(热等)所诱导的蛋白质，并且强烈地参与适应性应答的过程。已认识到，在皮肤和其他组织水平上HSP72蛋白的可诱导性随着年龄增长而降低，特别是在细胞衰老的过程中。此外，已承认，老化与对于引起年龄相关性病理学的环境应激所作出的应答降低有关。从在培养的成纤维细胞中的诱导的衰老模型开始，作者评价了阿千树果肉抽提物调节HSP72的热诱导降低的能力。总之，这些结果确认了，一方面，与年轻成纤维细胞相比，在衰老成纤维细胞中HSP72蛋白的诱导(通过热应激)强烈降低。另一方面，这些工作表明，阿干树果肉抽提物恢复了表老成纤维细胞中HSP72蛋白的诱导。在这个体外研究模型中，阿千树果肉抽提物限制了细胞衰老的生物学后果，因而表现出抗老化的特性。权利要求1.包含三萜级分的植物果肉的不皂化提取物在制备用于预防和/或治疗与皮肤老化相关的皮肤病症的美容、药物或营养产品中的用途，其特征在于，所述三萜级分包含高根二醇、α-脂檀素、β-脂檀素和羽扇醇，其中高根二醇的量为所述不皂化提取物的7重量％至40重量％。2.权利要求1的用途，其特征在于，|3-脂檀素的质量分数为所述不皂化提取物的5%至30%。3.权利要求1的用途，其特征在于，a-脂檀素和羽扇醇的质量分数之和为所述不皂化提取物的10°/。至50%。4.权利要求1的用途，其特征在于，所述提取物在最终美容产品中的量为所述制剂总重的0.001重量°/。至50重量°/。，优选0.01重量％至1G重量％，更优选0.1重量％至2重量％。5.权利要求1的用途，其特征在于，所述提取物从选自山榄科的植物中获得。6.权利要求1的用途，其特征在于，所述提取物获自阿干树的果实的果肉。7.权利要求1的用途，其特征在于，所述皮肤病症表现为皮肤质地、颜色和透明度的改变以及皱紋的出现。8.权利要求1的用途，其特征在于，所述皮肤病症是由于对环境应激的应答降低或者丧失而引起的。9.权利要求8的用途，其特征在于，所述环境应激由阳光或烟草造成。10.权利要求1的用途，其特征在于，所述皮肤病症是由于HSP72蛋白的可诱导性降低或者丧失而引起的。11.权利要求l的用途，其特征在于，所述美容、药物或营养产品为口服或局部使用的形式，优选为局部使用的形式。12.权利要求11的用途，其特征在于，所述局部使用的形式选自霜剂、凝胶剂、软骨剂和喷雾剂。13.权利要求ll的用途，其特征在于，所述口服形式选自片剂、胶嚢剂和用于可饮用悬液的粉剂。全文摘要本发明的领域涉及植物果肉的不皂化提取物在制备用于治疗和/或预防与老化相关的皮肤病症的美容、药物或营养产品中的用途。文档编号A61K8/97GK101355926SQ200680050441公开日2009年1月28日申请日期2006年12月28日优先权日2006年1月5日发明者B·法伯,C·鲍杜尹,M·查尔弗隆,R·伯利申请人:皮尔法伯护肤化妆品公司